宰后貯藏期間氧化磷酸化調控灘羊肉色澤穩定性的機制

王金霞，魏志寶，陳雪妍，李 榮，張 倩，胡麗筠，羅瑞明

（寧夏大學食品科學與工程學院，寧夏 銀川 750000）

灘羊以其營養豐富、無膻味、肉質細嫩而著稱，作為寧夏等地的區域性優質家畜品種，其具有重要的經濟及食用價值。消費者往往通過肉表面的顏色判斷肉的健康與新鮮程度，長期以來，肉色褐變已造成巨大的經濟損失[1]，因此探究動物宰后貯藏期間影響肉色的因素從而提高肉色穩定性，避免造成損失是當前的首要任務。

肉的色澤穩定性通常由肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、血紅蛋白和一些微量有色代謝物維持。在充分放血的肌肉中，Mb含量占總色素含量的75%左右[2]，是影響宰后肉色澤穩定性的主要因素[3]。由于血紅素在肉中具有多種存在形式，因此可以形成許多豐富的肉色，比如鮮紅色、紫紅色、深褐色，甚至還有綠色、灰色等比較少見的顏色[4]。

氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）系統由線粒體內膜電子傳遞鏈（electron transfer chain，ETC）和ATP合成酶（復合物V）組成，是物質在線粒體內氧化釋放的能量通過呼吸鏈供給ADP與無機磷酸合成ATP的偶聯反應。氧化磷酸化可產生ATP，從而滿足細胞行使功能所需能量[5]；同時氧化磷酸化參與調節各種關鍵細胞活動，例如活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和封存[6]、鈣穩態、細胞凋亡以及細胞衰老等[7]。

蛋白質組學技術是能夠揭示細胞/組織生長、發育、代謝等生命現象本質變化的分子生物學篩選技術[8]。它是一種最直接、有效的蛋白質研究手段，可以對細胞/組織中全部蛋白質表達水平、組成成分以及修飾狀態的變化進行分析，從而對蛋白質之間的交互關系進行全面說明，從分子水平上對蛋白質的功能和細胞代謝的生命活動進行深入探討[9]。Wu Shuang等[10]以蛋白質組學技術為基礎，研究了黑切牛肉的顏色變化，結果表明，較高的脫氧Mb含量、耗氧率、高鐵肌紅蛋白（methemoglobin，MetMb）還原活性和較低的脂質氧化作用使得黑切牛肉具有較低的a*值和較高的肉色穩定性。Hughes等[11]通過蛋白質組學分析發現，光的散射和吸收與結構蛋白的表達量變化顯著相關。劉吉娟等[12]采用同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術對不同貯藏時間的灘羊肉進行蛋白質組學分析，發現10 個主要涉及肌肉收縮、ATP酶活性調控的差異蛋白，并最終影響灘羊肉持水性。綜上，利用蛋白組學技術可以從分子水平上闡明肉品質在貯藏過程中的變化機制，但目前鮮見從分子水平揭示氧化磷酸化影響肉色穩定的機制研究。

本實驗采用iTRAQ蛋白質組學技術研究貯藏0、4、8 d灘羊肉中差異蛋白的表達變化，篩選與氧化磷酸化相關差異蛋白，鑒定0～4 d和4～8 d兩個貯藏階段共有的差異豐度蛋白質，采用Cytoscape軟件鑒定核心網絡；將所篩選的差異蛋白標注于氧化磷酸化通路上，從通路水平揭示氧化磷酸化調控灘羊肉色澤穩定性的機制，旨在為灘羊肉宰后肉品色澤穩定性控制提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取12 只來自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司且胴體質量相近的6 月齡公灘羊的右側背最長肌，屠宰后采用滅菌刀立即剔除可見脂肪與結締組織，置于聚乙稀薄膜內，采用錫紙包裝后置于帶有編號的保鮮袋中，并將記為0 d的樣本置于液氮中暫時保存，將需要成熟4、8 d的樣本置于4 ℃的保溫箱貯藏，待樣本成熟后，立即將0、4、8 d的樣本轉置于－80 ℃冰箱中保存，用于各指標的測定。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司；乙腈（分析純）美國賽默飛世爾科技公司；三乙二胺碳酸鹽、考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國普洛麥格公司；十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 上海碧云天生物科技有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；ROS探針 上海懋康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1200紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀 上海凈信有限公司；352型酶標儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；TGL-24M高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；Sciex Triple TOF-5600質譜儀 美國應用生物系統公司；冷凍離心機 德國艾本德公司；ImageScanner掃描儀 美國GE Healthcare公司；VCX-130超聲波細胞粉碎機 美國Sonics公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 美國賽默飛世爾科技公司；Mini-PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

準確稱取貯藏0、4、8 d的樣品各500 mg，于液氮中迅速冷凍后放置到-80 ℃的冰箱中，用于蛋白質組學的測定和其他指標的測定。采集0、4、8 d的樣品各10 g，用于測定CAT、SOD、GSH-Px活性、ROS含量的測定。

1.3.2 CAT活性測定

參照CAT檢測試劑盒說明書進行，使用紫外-可見分光光度計于240 nm波長處測定。

1.3.3 SOD活性測定

參照SOD檢測試劑盒說明書進行，使用酶標儀在560 nm波長處測定。

1.3.4 GSH-Px活性測定

參照GSH-Px檢測試劑盒說明書進行，使用酶標儀在340 nm波長處測定。

1.3.5 線粒體活性氧含量測定

參考張玉林[13]的方法，并略作修改。準確稱取已經剔除脂肪與結締組織的肉樣0.1 g，置于Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、10 mmol/L蔗糖，pH 7.4）中混合備用，4 ℃、60 Hz勻漿30 s后，3 000×g冷凍離心15 min并收集上清液，采用雙縮脲法測定上清液的蛋白濃度。

取100 μL上清液與100 μL反應緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、0.8 g/100 mL NaCl、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、10 mmol/L蔗糖、10 μmol/L 2,7-二氯熒光素二乙酸酯，pH 7.4）在酶標板內迅速混合，于激發波長480 nm、發射波長525 nm處立即測定孵育前的熒光強度，再置于37 ℃孵育箱內孵育30 min，再次測定孵育后熒光強度，ROS水平按下式計算：

1.3.6 蛋白質組學分析

參考尤麗琴等[14]的方法提取灘羊肉中的總蛋白質。iTRAQ-蛋白質組學分析委托上海鹿明生物科技有限公司進行，運用Analyst TS 1.1軟件獲得蛋白質組學數據。采用Protein Pilot 5.0軟件獲得蛋白質的定性及定量信息。通過UniProt數據庫檢索Ovisaries數據信息。數據進行歸一化處理后，以差異倍數（fold change，FC）＞1.6或FC＜1/1.6且P＜0.05為標準篩選差異豐度蛋白質，并利用OmicsBean軟件進行生物信息學分析，比對后獲得差異蛋白的基因本體論（Gene Ontology，GO）功能信息，選擇差異最顯著的前10 個條目作圖。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫對所篩選的差異蛋白質進行通路注釋分析。利用String數據庫（https://www.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0軟件進行蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡分析及核心互作網絡篩選。將所篩選的差異蛋白標注于氧化磷酸化通路上，從通路水平揭示氧化磷酸化調控灘羊肉色澤穩定性的機制。

1.4 數據處理

采用Excel軟件統計數據，SPSS Statistics 26軟件對數據進行方差分析，Origin 2021軟件作圖，R軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 內源抗氧化酶體系活性的變化

如圖1 所示，貯藏0～4 d CAT 活性顯著下降（P＜0.05），貯藏4～8 d其活性顯著上升（P＜0.05），表明抗氧化酶體系清除自由基的能力開始減弱。貯藏期間SOD活性隨著貯藏時間的延長呈顯著下降趨勢（P＜0.05），表明SOD清除超氧陰離子自由基的能力變弱[15]。GSH-Px活性在貯藏期間顯著下降（P＜0.05），表明GSH-Px將過氧化氫轉化為水和分子氧的能力變弱[16]。

圖1 貯藏期間內源抗氧化物酶體系活性的變化Fig.1 Changesin endogenous antioxidant enzyme activities during storage

2.2 貯藏期間線粒體ROS含量的變化

如圖2所示，灘羊背最長肌的ROS含量隨貯藏時間的延長顯著上升（P＜0.05），這是因為內源抗氧化酶的活力隨貯藏時間的延長而降低，導致ROS逐漸積累增加[17]。

圖2 貯藏期間ROS水平變化Fig.2 Changes in ROS contents during storage

2.3 蛋白質組學數據分析

如圖3所示，貯藏過程可以很好地區別樣本，相同貯藏期的樣本之間區別不顯著，而不同貯藏期的樣本之間區別顯著，以上結果說明本實驗樣品收集合理，并且蛋白質組學數據可靠，可以滿足后續分析的需要。

圖3 3 個貯藏期樣本蛋白質組學數據主成分分析Fig.3 Principal component analysis of proteomic data of samples in three storage periods

2.4 差異豐度蛋白質篩選

如圖4所示，4 d對比0 d組記為4/0 d組，8 d對比4 d組記為8/4 d組，共鑒定出164 個豐度差異顯著蛋白質。其中4/0 d組共鑒定出71 個豐度差異顯著蛋白質，53 個顯著上調，18 個顯著下調；8/4 d組共鑒定出93 個豐度差異顯著蛋白質，其中11 個顯著上調，82 個顯著下調。

圖4 3 個貯藏期樣本的差異蛋白火山圖Fig.4 Volcano maps of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

2.5 篩選蛋白的生物信息學統計

2.5.1 GO功能注釋富集統計

利用GO注釋對所篩選出的差異豐度蛋白質從生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular components，CC）3 個角度對其功能進行生物信息統計。由圖5a可知，4/0 d組的差異豐度蛋白質富集到406 個BP、98 個CC、95 個MF；由圖5b可知，8/4 d組的差異豐度蛋白質富集到699 個BP、85 個CC、168 個MF。

圖5 3 個貯藏期樣本差異豐度蛋白的生物信息學統計Fig.5 Bioinformatic statistics of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

由圖6a可知，灘羊宰后貯藏0～4 d期間，差異豐度蛋白主要參與的BP包括肌肉收縮、肌肉系統過程、系統過程的調節、小分子代謝過程以及ATP代謝過程等；CC主要包括肌節、細胞外泌體、胞外細胞器、細胞外膜結合細胞器、橫紋肌細絲等；MF主要包括維生素結合、谷胱甘肽轉移酶活性、電子載流子活性等過程。灘羊屠宰后貯藏初期肌肉收縮、前體代謝和能量的產生、ATP代謝過程等發生變化，這些變化可能引起線粒體損傷，導致細胞內能量無法正常交換，能量代謝活動發生紊亂，致使MetMb無法被進一步還原，導致肌肉中3 種Mb的含量與存在形式發生改變，最終對灘羊肉色澤穩定性產生影響。

由圖6b可以看出，灘羊宰后貯藏4～8 d期間，差異蛋白主要參與的BP包括ATP代謝過程、核苷二磷酸化、嘌呤核苷單磷酸代謝過程等；CC主要包括細胞外膜細胞器、細胞外泌體、膜結合囊泡、肌纖維、收縮纖維等；MF主要包括抗氧化物活性、細胞骨架蛋白結合、MHCII類蛋白復合物結合等過程。灘羊屠宰后貯藏后期，差異表達蛋白質涉及過氧化物酶活性、橫紋肌收縮和ATP代謝過程等反應過程，這些代謝過程的變化可能影響內源氧化還原酶系統的活性，促使肌細胞線粒體能量代謝受到影響，引起肌肉組織收縮，直接影響3 種Mb的存在狀態和含量，最終對灘羊肉色澤穩定性產生負面影響。

2.5.2 KEGG通路統計

將3 個貯藏期所篩選的164 個差異豐度蛋白質進行KEGG通路注釋統計，如圖7所示，4/0 d組共顯著富集于16 條KEGG通路，8/4 d組共顯著富集于18 條KEGG通路。

圖7 3 個貯藏期樣本差異蛋白的KEGG通路注釋Fig.7 KEGG pathway annotation of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

灘羊宰后貯藏0～4 d期間，差異蛋白主要參與碳代謝、代謝途徑、2-氧代羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及心肌收縮等通路；宰后貯藏4～8 d期間，差異蛋白主要參與氨基酸合成、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、氧化磷酸化、HIF-1信號通路等。宰后初期，所篩選的差異蛋白并未明顯富集于氧化磷酸化通路的根本原因可能是同一個差異蛋白可富集于不同的信號通路，例如氧化磷酸化復合物亞基COX5A、COX4I1及COX5B等都顯著富集在心肌收縮通路中。以上代謝過程可能通過影響宰后肌細胞線粒體能量代謝活動從而影響高鐵肌紅蛋白還原酶（metmyoglobin reductase，MetMbase）體系，最終影響灘羊肉色澤穩定性。同時，所篩選的差異蛋白可以顯著富集到氧化磷酸化代謝通路，且隨貯藏時間的延長其上的相關酶會發生改變，MetMbase系統又受氧化磷酸化的調控。因此，本研究將以氧化磷酸化通路中關鍵蛋白的差異變化為重點，初步闡明氧化磷酸化通路上關鍵蛋白對灘羊肉色澤穩定性產生的影響。

2.6 核心網絡的構建

通過Venn網站（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選3 個貯藏期共有的差異蛋白，如圖8所示，4/0 d組與8/4 d組共有的差異蛋白為28 個，并將這28 個差異蛋白列于表1中。通過String網站（https://www.string-db.org/）對28 個共有的差異蛋白進行PPI網絡分析，如圖9所示，該網絡中PPI的富集P值為1.0×10-16，聚類系數為0.556。共有34 個節點數，78 條邊位于該互作網絡中，表明24 個差異蛋白之間具有明顯的互作關系。

表1 3 個貯藏期樣本共有的差異蛋白變化Table 1 Changes in shared differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

圖8 3 個貯藏期樣本差異蛋白的Venn圖Fig.8 Venn diagrams of differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

圖9 3 個貯藏期樣本共有差異蛋白的互作網絡圖Fig.9 Interaction network diagram of shared differentially expressed proteins between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

將PPI網絡導入Cytoscape 3.9.1軟件中并采用MCODE篩選該PPI網絡中與氧化磷酸化相關的核心網絡，結果如圖10所示。核心網絡上共有8 個的差異蛋白在氧化磷酸化通路中，分別為細胞色素c氧化酶亞基5A（cytochrome c oxidase subunit 5A，COX5A）、COX2、ATP合酶亞基α（ATP synthase F1 subunit alpha，ATP5A1）、ATP合酶亞基O（ATP synthase peripheral stalk subunit OSCP，ATP5O）、ATP合酶亞基D（ATP synthase peripheral stalk subunit D，ATP5H）、琥珀酸脫氫酶復合鐵硫亞基B（succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B，SDHB）、ADP/ATP轉位酶（ADP/ATP translocase 1，SLC25A4）和細胞色素c（cytochrome c，CYCS），其中ATP5A1、ATP5O、ATP5H參與線粒體中氫離子的轉運；COX5A指導COX的正確裝配，維持COX結構的穩定，COX2為細胞色素c氧化酶亞基2；SDHB負責將電子從琥珀酸鹽轉移到泛醌；SLC25A4負責催化ADP和ATP在膜上的交換。因此，認為這8 個上調表達的差異蛋白是影響灘羊宰后貯藏期間氧化磷酸化的核心差異蛋白。

2.7 氧化磷酸化通路

為了將所篩選出的核心差異蛋白在氧化磷酸化通路中的變化進行可視化展示，以KEGG代謝途徑作為媒介，將差異蛋白標注于氧化磷酸化通路中。由圖11a可知，宰后貯藏0～4 d差異蛋白ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS均上調表達，線粒體蛋白Ndufv1、Ndufa8、COX5B及COX4也在貯藏初期上調表達，而COX2、COX3下調表達；Ndufv1、Ndufa8為泛醌氧化還原酶核心亞基，COX2、COX3、COX4、COX5A及COX5B均為細胞色素c氧化酶的核心亞基[18]。由圖11b可知，貯藏4～8 d氧化磷酸化通路上仍有多個差異蛋白上調表達，其中Ndufa13為NADH還原酶亞基，QCR8是泛醇-細胞色素c還原酶的亞基，負責編碼低分子質量的泛醌結合蛋白。但宰后初期上調表達的COX4未發現明顯變化，Ndufab1、COX5A顯著下調表達。

圖11 核心差異蛋白在氧化磷酸化通路的注釋Fig.11 Annotation of the core differentially expressed proteins in the oxidative phosphorylation pathway

2.8 貯藏期間Mb表達量變化

如表2所示，貯藏0～4 d Mb表達量下調，這可能是因為機體供養方式的改變，促使Mb的初級結構發生改變，引起其開始下調表達[19]，貯藏4～8 d期間，Mb為下調表達，這可能是因為隨著貯藏時間的延長含量氧的降低使肌細胞內離子穩態失衡，造成線粒體功能受損，最終導致Mb表達量下降[20]。灘羊背最長肌的Mb表達量在整個貯藏期呈顯著下降趨勢，這是因為Mb二級結構會隨貯藏時間的延長發生分子重排，引起部分分子間的二硫鍵被破壞，導致Mb構象由規整向松散分布，致使Mb結構穩定性下降[21]，最終導致灘羊背最長肌中的Mb表達量在整個貯藏期顯著下降。

表2 貯藏期間灘羊背最長肌中Mb表達量變化Table 2 Changes in Mb expression in M.longissimus dorsi muscle of Tan sheep between day 4 and day 0 and between day 8 and day 4

2.9 影響灘羊肉色澤穩定性的機制

由圖12可知，Mb表達量與ATP5A1、SDHB、SLC25A4、CYCS呈高度顯著負相關（P＜0.001），與ATP5O、ATP5H顯著負相關（P＜0.05），而其與COX2、COX5A呈高度顯著正相關（P＜0.001）；ATP5A1與ATP5O、ATP5H、SLC25A4均極顯著正相關（P＜0.01），與SDHB、CYCS高度顯著正相關（P＜0.001），與COX2、COX5A呈極顯著負相關（P＜0.01）；ATP5O、ATP5H與COX2、COX5A并無顯著相關性，這可能是因為COX2、COX5A直接影響ATP5A1的表達量，從而間接對ATP5O、ATP5H產生影響；SDHB、SLC25A4、CYCS均與各指標顯著相關。相關性分析結果表明，氧化磷酸化通路上的差異蛋白ATP5A1、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS直接影響灘羊肉Mb的表達量，同時這些核心差異蛋白質也可能通過間接方式影響灘羊背最長肌的色澤穩定性。

圖12 灘羊肉Mb表達量與氧化磷酸化核心蛋白質的相關性分析Fig.12 Correlation analysis between Mb expression level and core proteins of oxidative phosphorylation in Tan sheep meat

3 討論

ROS是具有活性化學性質的信號分子，能降低線粒體抗氧化能力，造成線粒體損傷[22]，主要來自線粒體細胞。當機體受損或處于缺血缺氧狀態時會產生過量的ROS，線粒體產生ROS的速率受線粒體內膜跨膜電位的調節。本研究中灘羊宰后貯藏期間灘羊背最長肌中的ROS含量顯著上升，這是因為隨著貯藏時間的延長內源抗氧化酶逐漸失活，不能及時清除機體內過量的ROS，導致ROS含量逐漸積累增加，從而導致氧化應激，最終引起細胞凋亡[23]。

機體內的內源性抗氧化酶系統能夠清除氧化應激產生的ROS[24]。SOD是抗氧化酶系統中最重要的酶，主要負責催化超氧陰離子歧化成過氧化氫[25]，CAT進一步將過氧化氫催化分解為水和氧氣。馬森[26]提出GSH-Px通過激活谷胱甘肽介導了過氧化物、羥基等多種ROS的產生，從而維持了線粒體的穩定。本研究發現SOD、GSHPx活性隨著貯藏時間的延長均顯著下降，這說明內源抗氧化酶系統清除氧自由基的活力開始變弱。而CAT活性在貯藏0～4 d顯著下降，但在4 d后卻顯著上升，這可能是因為同期SOD活力的上升催化產生了過多的過氧化氫，導致機體產生應激反應，致使CAT活力開始升高[27]。

宰后灘羊肉的貯藏時間與肌細胞線粒體內能量代謝活動具有顯著相關性，本研究發現不同貯藏階段蛋白差異水平有顯著變化，在貯藏期間顯著上調或下調，且多個顯著變化的差異蛋白可以富集于氧化磷酸化通路。灘羊宰后貯藏0～4 d，顯著差異蛋白ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4及CYCS均富集于氧化磷酸化通路；貯藏4～8 d，除所篩選出的8 個核心差異蛋白外，差異蛋白Ndufab1、COX5A也富集于氧化磷酸化過程。雖然不同貯藏期鑒定的差異蛋白表達量并不相同，但這些差異蛋白在KEGG中均注釋于能量代謝，這說明動物屠宰后，細胞內環境改變會引起組織內能量代謝相關酶亞基表達發生變化[28]。線粒體蛋白質組在轉錄、翻譯和活性等多個層面上存在協同作用，因此富集于氧化磷酸化通路上差異蛋白的上調/下調表達則說明肌細胞線粒體通過調節氧化磷酸化復合物的表達量和活性，保持正常的能量代謝活動，從而應對由于細胞內環境的改變而造成的線粒體損傷。蛋白質水平的上調表達很可能是由于線粒體受損而引起的離子穩態失衡、結構保護機制失效、抗凋亡功能失效等生理生化變化所致，蛋白質水平發生下調表達則預示著機體能量的持續耗竭，最終引起組織/細胞的程序性死亡。

所鑒定的差異蛋白在不同貯藏階段呈現了上調或下調的表達趨勢，細胞色素c氧化酶位于線粒體ETC的末端，其轉錄水平變化對酶活性具有調節作用[29]，COX1、COX2及COX3具有酶催化活性，COX5A指導COX的正確裝配，其中COX5A在貯藏初期上調表達，而在貯藏后期下調表達，這說明隨著貯藏時間的延長肌細胞內環境的改變促使COX5A無法正確指導COX的裝配，促使細胞色素c氧化酶活性發生改變，進而對氧化磷酸化進程產生影響，最終導致灘羊肉色澤穩定性受到影響。F型H+轉運ATP酶廣泛分布于線粒體內膜，是組織能量代謝的關鍵酶，負責利用呼吸鏈產生的電化學勢能，改變蛋白質結構合成ATP。ATP5A1、ATP5O、ATP5H在貯藏初期均上調表達，在貯藏后期均下調表達，ATP酶亞基的蛋白質上調表達意味著宰后肌肉組織內發生應激反應，導致線粒體復合物V高效組裝并引起其活性發生改變。ATP酶亞基的蛋白質水平下調表達意味隨著貯藏時間的延長，細胞凋亡程序的啟動使復合物V已無法正確裝配，促使其活性開始下降。SDHB為復合物II亞基B，其具有結合金屬離子和電子傳遞的功能對于阻止復合體II的電子泄漏起著非常重要的作用，可能介導呼吸鏈生物功能和調控細胞生長[30]，SDHB在貯藏初期上調表達，并在貯藏后期下調表達，這可能是因為肌細胞內環境的改變促使復合物II亞基B的表達受到貯藏時間的調控，其表達量的下調表達會引起復合物II發生突變，促使其氧化效能增加，最終加速細胞死亡[31]。

相關性分析結果表明，所篩選的8 個核心蛋白ATP5A1、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS直接影響灘羊肉Mb的表達，并且這8 個核心蛋白均顯著富集于氧化磷酸化通路中，因此推測所篩選出的8 個核心蛋白對灘羊肉色澤穩定性起重要調控作用，并且此過程是通過氧化磷酸化途徑實現的。Mb衍生態在組織內存在的狀態和相對含量為灘羊宰后肉色變化的內在機制，組織內的還原酶系統對Mb狀態至關重要。而氧化磷酸化反應往往伴隨著電子的轉移，復合物I負責催化NADH脫氫生成NAD+，復合物II主要負責將琥珀酸催化生成延胡索酸，并將產生的電子最終傳遞給泛醌，復合物III主要負責將電子從輔酶Q的傳遞給細胞色素c，復合物IV主要負責將電子從細胞色素c轉移到O2，將O2轉化為水。已有研究表明，動物屠宰后機體細胞缺氧缺血，細胞內氧自由基的產生會引起肌細胞內離子穩態的失衡導致線粒體損傷，引起線粒體功能下降[32]，促使氧化磷酸化復合物活性發生改變，導致MetMb還原酶系統受到影響，最終導致灘羊肉色穩定性變差。COX是聯系低氧反應和代謝模式轉化的重要紐帶，它可以通過調節氧化磷酸化生成ATP，從而導致能量代謝方式發生轉化[28]，進而對灘羊被最長肌中的Mb表達量產生影響，最終影響灘羊肉色澤穩定性。

通過分析研究結果，發現宰后貯藏期間灘羊肉中內源抗氧化物酶系統的失效，導致ROS含量隨貯藏時間的延長不斷積累，引起肌細胞發生程序性凋亡，促使氧化磷酸化通路上ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS等復合物亞基表達紊亂，引起線粒體復合物結構和功能發生改變，使氧化磷酸化進程受到阻礙，并進一步對肌肉中Mb存在形式造成影響，最終影響灘羊肉色澤穩定性。

4 結論

采用iTRAQ技術分析鑒定出8 個差異蛋白質為影響灘羊肉色澤穩定性的核心蛋白質，分別為ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS，這些蛋白質主要通過能量代謝過程和氧化還原過程影響灘羊肉色澤穩定性。宰后貯藏期間灘羊肉中抗氧化體系的失效導致ROS含量不斷積累，破壞肌細胞線粒體完整性，促使氧化磷酸化通路上ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS等復合物亞基表達紊亂，引起線粒體復合物結構和功能發生改變，使氧化磷酸化進程受到阻礙，對肌肉中MetMbase系統造成負向影響，最終影響灘羊肉色澤穩定性。