基于“腦心同治”探討電針不同介入時(shí)間對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知障礙的影響

郭文慧,張 衛(wèi),鄭淑美,苑鴻雯,張 璐,王天琪,崔學(xué)慧,崔 海△,杜若桑△

1.首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069;2.宣武中醫(yī)醫(yī)院,北京 100050

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是由外力所導(dǎo)致的一種后天性腦損傷,可能導(dǎo)致腦功能暫時(shí)或永久性的傷害[1]。目前全世界TBI的發(fā)病率約為5 000萬例/年,造成的經(jīng)濟(jì)損失約為4 000億美元,約占世界生產(chǎn)總值的0.5%[2]。TBI的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程,主要可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[3]。原發(fā)性損傷與大腦受到的原發(fā)性外部撞擊直接相關(guān),而繼發(fā)性腦損傷可在原發(fā)性撞擊發(fā)生后數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)發(fā)生,出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元死亡、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及自由基釋放等病理變化,會(huì)進(jìn)一步加劇腦組織損傷[4]。

炎癥反應(yīng)被證實(shí)與認(rèn)知障礙之間存在極其密切的關(guān)系,后者是TBI最常見的后遺癥之一[5],不同損傷程度的TBI會(huì)引起長(zhǎng)、短期認(rèn)知障礙,不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,同時(shí)也阻礙患者的早期康復(fù)[6]。有研究顯示通過抑制腦組織內(nèi)神經(jīng)炎癥,可減輕大鼠認(rèn)知障礙,增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力,改善神經(jīng)功能損傷[7]。而促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平的高低,對(duì)于檢測(cè)TBI后認(rèn)知功能損傷程度具有一定的導(dǎo)向作用。針刺作為中醫(yī)重要組成部分,廣泛應(yīng)用于TBI后認(rèn)知障礙、意識(shí)障礙與肢體活動(dòng)障礙等癥狀[8]。亦有諸多研究關(guān)注針刺的起效機(jī)制,針刺可通過抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、抗氧化、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝、改善腦循環(huán)及抑制細(xì)胞凋亡等多途徑治療TBI[9]。

根據(jù)中醫(yī)理論,心腦均與神志相關(guān),正如張錫純所言:“神明之功用,原心與腦相輔相成”“神明之體藏于腦,神明之用發(fā)于心”。腦為髓海,主精神意識(shí)和感覺運(yùn)動(dòng)。心藏神,總統(tǒng)魂魄《素問·靈蘭秘典論》云:“心者,君主之官,神明出焉”,TBI后認(rèn)知障礙的發(fā)生與心腦密切相關(guān),治療宜從調(diào)理腦心功能、腦心同治入手。

課題組前期研究結(jié)果表明2/100 Hz疏密波電流下的電針治療能夠更加有效地緩解TBI大鼠的神經(jīng)炎癥,同時(shí)也能有效地提高大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力[10],但是其針對(duì)TBI后認(rèn)知障礙的最佳干預(yù)時(shí)間仍未確定。基于此,本研究采用“腦心同治”針刺法,利用大鼠TBI模型,通過觀察炎癥反應(yīng)進(jìn)一步探討不同介入時(shí)間點(diǎn)對(duì)TBI后認(rèn)知障礙的療效差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用7～8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量280～320 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可SCXK(京)2016-003]提供,于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)國家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(京)2018-0003]分籠飼養(yǎng),每籠3只。飼養(yǎng)溫度(22±3)℃,濕度40%～50%,12 h/12 h晝夜周期,均可自由攝食、飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。動(dòng)物造模以及實(shí)驗(yàn)研究過程嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利倫理原則,本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(批號(hào):AEEI-2023-043)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 β-actin單克隆抗體(Abcam,貨號(hào):ab8227);IL-18兔源一抗(Proteintech,貨號(hào):10663-1-AP);IL-1β兔源一抗(Abcam,貨號(hào):ab283818);彩虹預(yù)染蛋白Maker(蘇州新賽美生物科技有限公司,貨號(hào):P9006);HPR-山羊抗兔IgG(Proteintech,貨號(hào):SA00001-2);594-山羊抗兔IgG(Abcam,貨號(hào):ab150080);FJB染液(Merck Life Sciences,貨號(hào):AG310)。

1.2.2 儀器 精密顱腦損傷撞擊器PCI3000(美國Hatteras instruments公司);68025型腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司);華佗牌一次性無菌針灸針(0.3 mm×13 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電泳、電轉(zhuǎn)儀套裝(美國加利福尼亞州Bio-Rad);化學(xué)發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)(美國加利福尼亞州Bio-Rad)。

1.3 造模方法

采用隨機(jī)數(shù)字方法將80只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、電針1組、電針2組與電針3組,每組均為16只。

除假手術(shù)組外,其余4組大鼠利用PCI3000制備TBI模型。本實(shí)驗(yàn)全過程均采用異氟烷吸入麻醉法,3%異氟烷誘導(dǎo)大鼠麻醉后調(diào)為2%用以維持,大鼠頭部備皮俯臥于腦立體定位儀上。沿大鼠矢狀縫切一條長(zhǎng)約1.5 cm的切口,使大鼠的前囟能完整暴露,以前囟右旁開約2.5 mm、后1.5 mm處為圓心,用微型手持式顱鉆鉆取直徑大約為6.0 mm的孔,打開骨窗并保持硬腦膜完整。除假手術(shù)組外其余組均用PCI3000進(jìn)行撞擊(撞擊參數(shù)為撞擊頭直徑:4.0 mm;打擊速度:4 m/s;打擊深度:2.5 mm;停留時(shí)間:100 ms),撞擊完后清理創(chuàng)口,還納骨窗并用組織膠水封閉,隨后縫合傷口。

1.4 干預(yù)方法

電針1組、電針2組以及電針3組分別在造模結(jié)束后即刻、造模結(jié)束后第3天以及造模結(jié)束后第7天開始電針干預(yù)。所有電針組取穴均為“水溝”(DU26)、雙側(cè)“風(fēng)池”(GB20)和雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”(PC6),穴位定位及選取參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用穴位名稱與定位》[11]。操作:2%異氟烷麻醉大鼠后俯臥位固定,向上斜刺水溝約1 mm,捻轉(zhuǎn)10 s后出針不留針;內(nèi)關(guān)直刺約2 mm,風(fēng)池斜刺3 mm;風(fēng)池、內(nèi)關(guān)兩穴行平補(bǔ)平瀉手法后連接電針儀。電針參數(shù)采用疏密波,頻率2/100 Hz,電流強(qiáng)度以大鼠身體輕微抖動(dòng)為度,留針15 min,1次/d,連續(xù)針刺14 d。干預(yù)期間假手術(shù)組與模型組只麻醉不進(jìn)行針刺干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 在大鼠造模結(jié)束后1 d、14 d以及21 d采用神經(jīng)功能評(píng)分表(modified neurological severity scores,mNSS)對(duì)各組的神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)價(jià)[12],綜合評(píng)價(jià)大鼠運(yùn)動(dòng)(肌肉狀態(tài)以及異常動(dòng)作)、感覺(如視覺、觸覺及平衡覺等)以及反射反應(yīng)。測(cè)試得分越高則表示大鼠的神經(jīng)損傷功能損傷程度越嚴(yán)重,本測(cè)試滿分為18分。

1.5.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 于造模后21 d對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行評(píng)估,實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 d。第1天將大鼠放置于一個(gè)空曠的鐵皮箱中,進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)5 min的環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練。第2天在箱子中放置兩個(gè)大小、質(zhì)地和顏色一樣的物體,讓大鼠進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為5 min的探索;訓(xùn)練后1.5 h進(jìn)行短期記憶保留訓(xùn)練,訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)為5 min,訓(xùn)練過程中將兩個(gè)物體中的一個(gè)替換成另外一個(gè)顏色、質(zhì)地一樣但是形狀不一樣的新物體,訓(xùn)練并分別記錄大鼠探索新舊物體的時(shí)間。24 h后進(jìn)行長(zhǎng)期記憶保留訓(xùn)練,再次將兩個(gè)舊物體中的一個(gè)替換成一個(gè)顏色、質(zhì)地一樣但形狀不同的新物體,其他不變,訓(xùn)練并記錄大鼠探索新舊物體的時(shí)間。最后分別計(jì)算短期記憶保留試驗(yàn)以及長(zhǎng)期記憶保留試驗(yàn)中各組大鼠的新物體探索時(shí)間比:(探索新物體時(shí)間/總探索時(shí)間)×100以及對(duì)新舊物體的偏好指數(shù):(探索新物體時(shí)間-探索舊物體時(shí)間)/總探索時(shí)間[13]。

1.5.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 于造模后第28天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索試驗(yàn),分別對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶以及空間定位功能進(jìn)行評(píng)估。定位航行實(shí)驗(yàn):水迷宮實(shí)驗(yàn)前4 d,將大鼠面朝池壁,順時(shí)針分別從4個(gè)不同的象限下水,平臺(tái)固定于第2象限,取大鼠在除平臺(tái)所在象限外其他3個(gè)象限尋找平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間的平均值作為衡量空間學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。空間探索實(shí)驗(yàn):水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天撤去平臺(tái),將大鼠放入水池并記錄2 min,記錄大鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù),用以衡量大鼠空間記憶能力。

水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行灌注取腦,將大腦浸泡于4%多聚甲醛中24 h,隨后進(jìn)行石蠟包埋、制作切片用于FJB染色、HE染色和后續(xù)免疫熒光試驗(yàn)。各組剩余8只大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后,快速取出大腦,剝離損傷灶周圍皮層組織用于Western blot檢測(cè)。

1.5.4 Fluoro-jade B染色 采用FJB染色法檢測(cè)大鼠患側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞退行性變異情況。腦切片經(jīng)脫石蠟、復(fù)水后,用梯度環(huán)保脫蠟液脫蠟,再用梯度乙醇脫水,最后用蒸餾水洗滌,然后滴加FJB工作液,50%冰醋酸為溶劑,按1∶400配制FJB工作液,稀釋FJB綠色熒光探針,4 ℃過夜。DAPI染核8 min,最后用蒸餾水沖洗。切片晾干后,經(jīng)二甲苯洗滌,最后封片。染色圖像在直立熒光顯微鏡(Nikon,日本)下觀察和拍攝,放大倍數(shù)為400×,使用Image-pro plus 7.0軟件測(cè)量和計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.5.5 HE染色法觀察大鼠損傷側(cè)大腦海馬區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)變化 將腦組織浸泡在4%多聚甲醛(4 ℃)中24 h,然后用石蠟包埋組織,用顯微切割機(jī)將石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脫蠟,再用梯度乙醇(100%～75%)脫水。用雙蒸水沖洗后,將切片放入蘇木精溶液中浸泡3～5 min,然后用曙紅溶液染色5 min。最后用中性樹膠裝片。HE染色圖像由計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)捕獲,該系統(tǒng)由放大倍率為400×的顯微鏡組成。

1.5.6 Western blot法檢測(cè)大鼠損傷側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白表達(dá) 取50 g大鼠右側(cè)大腦皮層,用RIPA裂解液提取其蛋白,使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,取上清液加入5×SDS-PAGEA蛋白上樣緩沖液和PBS制成樣本儲(chǔ)存液。將樣本加入電泳槽中進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉,隨后分別加入IL-1β一抗(1∶1 000)、IL-18(1∶8 000)和β-actin(1∶1 000),4 ℃慢搖過夜,次日洗膜后加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h(1∶20 000),加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影。Image J軟件計(jì)算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值,作為目的蛋白的最終表達(dá)水平。

1.5.7 免疫熒光法檢測(cè)大鼠損傷側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18陽性表達(dá) 取5 μm腦切片后經(jīng)二甲苯脫蠟,無水乙醇等修復(fù)抗原。羊血清封閉,滴入一抗IL-1β(1∶50)抗體或IL-18(1∶200)抗體,放入染色暗盒中,孵育過夜,隨后加入稀釋過的FITC的羊抗兔二抗(1∶100)IgG。孵育1 h后,染核封片,熒光顯微鏡(200×)觀察染色結(jié)果并拍照分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

各組大鼠造模后1 d、14 d及21 d神經(jīng)功能缺損情況見表1。造模后1 d,除假手術(shù)組外,各組評(píng)分均呈上升趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠mNSS神經(jīng)損傷功能評(píng)分比較

造模后第14天及第21天mNSS評(píng)分結(jié)果顯示各組大鼠得分均有所下降,但模型組評(píng)分明顯高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,各電針組評(píng)分均明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組得分最低。見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織形態(tài)比較

應(yīng)用FJB染色和HE染色觀察腦組織病理改變,首先,筆者團(tuán)隊(duì)采用FJB染色法對(duì)TBI大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞退行性變異情況進(jìn)行檢測(cè),見圖1。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)的FJB陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),經(jīng)過電針治療后,各電針組海馬區(qū)FJB陽性細(xì)胞數(shù)量較模型組有所減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且電針1組與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注:綠色熒光染色代表腦組織中神經(jīng)元壞死細(xì)胞,尺標(biāo)長(zhǎng)度=50 m。圖1 FJB染色結(jié)果

表2 各組大鼠FJB相對(duì)表達(dá)水平比較

此外,在HE染色中假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰完整,形態(tài)正常,顏色淡染均勻,未見病理損傷灶;而與假手術(shù)組比較,模型組大鼠大腦右側(cè)海馬區(qū)有明顯的病理改變,主要表現(xiàn)為右側(cè)海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞核皺縮坍塌,或有空泡樣改變。與模型組比較,電針1組、電針2組和電針3組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)腦組織病變程度有所改善,主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多、細(xì)胞核皺縮坍塌以及空泡樣改變減少,且與其他電針組比較,電針1組的改善情況更趨近于假手術(shù)組。結(jié)果顯示,電針治療可以減輕TBI后海馬區(qū)的病理改變,且干預(yù)時(shí)間越早,療效越顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)HE染色結(jié)果(標(biāo)尺=200 m)

2.3 各組大鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)比較

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)在造模后第21天進(jìn)行,結(jié)果見表3,分析各組大鼠短期記憶訓(xùn)練中對(duì)新物體探索時(shí)間比以及偏好指數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在探索時(shí)間比中,與假手術(shù)組比較,模型組探索時(shí)間比值較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后電針組探索時(shí)間比值均有所提升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在短期記憶訓(xùn)練的偏好指數(shù)測(cè)試中,與假手術(shù)組比較,模型組的偏好指數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,電針1組的偏好指數(shù)略高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);電針2組、電針3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)記憶偏好指數(shù)及探索時(shí)間比統(tǒng)計(jì)比較

短期記憶訓(xùn)練結(jié)束后24 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期記憶訓(xùn)練,結(jié)果顯示在探索時(shí)間比中,與假手術(shù)組比較,模型組探索比比值顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較電針組的探索比比值均較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且3個(gè)電針組與假手術(shù)組比較,結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);但相比之下電針1組的比值略高于電針2組以及電針3組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在長(zhǎng)期記憶訓(xùn)練的偏好指數(shù)測(cè)試中,模型組的偏好指數(shù)明顯低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,電針組的偏好指數(shù)均有所回升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且電針1組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

水迷宮實(shí)驗(yàn)在造模后第28天開始,包括定位航行試驗(yàn)以及空間探索實(shí)驗(yàn)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中,筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)各組大鼠逃避潛伏期進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn),隨著訓(xùn)練日期增加,各組大鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均明顯減少。各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)前4 d逃避潛伏期分析結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而經(jīng)過電針治療后,各電針組的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)較模型組均明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組逃避潛伏期時(shí)長(zhǎng)與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠水迷宮前4 d尋找平臺(tái)潛伏期時(shí)長(zhǎng)

表4 各組大鼠水迷宮1～4 d潛伏期時(shí)長(zhǎng)比較

在空間探索實(shí)驗(yàn)中對(duì)撤除平臺(tái)后各組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組比較,模型組穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01);與模型組比較,電針1組、電針2組和電針3組穿越平臺(tái)的次數(shù)均增加(P<0.05);電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)最后1 d穿越平臺(tái)次數(shù)比較

比較分析各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)第1天以及第4天從同一下水點(diǎn)下水后的游泳軌跡圖,結(jié)果顯示,隨著訓(xùn)練日期的增加,各組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間以及路徑均有所縮短,較之于其他組,假手術(shù)以及電針1組大鼠尋找平臺(tái)的軌跡更為清晰明確,花費(fèi)的時(shí)間最短,見圖4。這些研究結(jié)果表明,電針治療能夠有效改善TBI后學(xué)習(xí)與記憶能力,其改善程度與電針干預(yù)時(shí)間的早晚密切相關(guān)。

圖4 各組鼠水迷宮第1 d和第4 d游泳軌跡代表圖

2.5 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較

Western blot結(jié)果見圖5,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見表6,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18的表達(dá)明顯上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后電針1組、電針2組和電針3組IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)均有所下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且電針1組IL-1β、IL-18表達(dá)和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白水平

表6 各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)結(jié)果

2.6 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-18陽性表達(dá)比較

筆者團(tuán)隊(duì)通過免疫熒光檢測(cè)各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18表達(dá)情況,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠患側(cè)大腦皮層中IL-1β、IL-18的分布均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后各電針組IL-1β、IL-18的分布有所減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組下降的更為明顯,值得注意的是,電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,電針治療能夠有效抑制促炎因子的表達(dá),有助于緩解TBI大鼠神經(jīng)炎癥。見圖6、表7。

注:a.各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β分布情況;b.各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-18分布情況。紅色熒光表示各蛋白陽性表達(dá),藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核,標(biāo)尺=20 m。圖6 免疫熒光染色結(jié)果

表7 各組大鼠右側(cè)大腦患側(cè)皮層IL-1β、IL-18分布結(jié)果

3 討論

TBI是全世界導(dǎo)致年輕群體發(fā)病和死亡的主要原因之一,對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。據(jù)報(bào)道,TBI后損傷涉及大腦皮質(zhì)的額葉、顳葉、頂葉、枕葉以及海馬等多個(gè)區(qū)域,會(huì)對(duì)患者的執(zhí)行功能、前瞻性記憶功能、延遲記憶功能、命名、注意力與定向力等方面造成嚴(yán)重影響,最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙[14]。本研究結(jié)果顯示TBI模型大鼠均存在神經(jīng)功能缺損、學(xué)習(xí)與記憶功能減退現(xiàn)象,且TBI大鼠海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少、大量神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)退行性變異等病理變化,腦組織中促炎因子IL-1β、IL-18表達(dá)水平顯著上升。電針“內(nèi)關(guān)”“風(fēng)池”“水溝”可以降低TBI大鼠mNSS神經(jīng)功能評(píng)分,提高其學(xué)習(xí)與記憶能力,減輕腦組織病理變化情況,抑制神經(jīng)炎癥,這與既往相關(guān)研究結(jié)果一致[15-18]。既往研究結(jié)果表明TBI是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一,其繼發(fā)的認(rèn)知障礙作為該疾病的常見臨床癥狀在過去幾十年中受到的關(guān)注日益增多。然而,TBI后認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制還未明晰[19]。因此,迫切地需要找到更加有效的治療策略來緩解這一疾病的發(fā)展。筆者團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果表明,電針治療可以改善TBI大鼠的認(rèn)知障礙水平,其部分原因是通過對(duì)神經(jīng)炎癥的抑制作用,且據(jù)結(jié)果推測(cè),越早干預(yù)對(duì)疾病的改善程度越明顯。

從中醫(yī)角度分析,TBI后認(rèn)知障礙多屬于中醫(yī)學(xué)的“呆病”“健忘”“善忘”等范疇[20],有學(xué)者[15]認(rèn)為,頭為諸陽之會(huì),內(nèi)涵腦髓,一旦損傷則腦髓震動(dòng),瘀阻清竅,清陽濁陰升降失調(diào)而發(fā)為健忘癡呆等。由此可見TBI后認(rèn)知障礙的發(fā)生與腦密切相關(guān)。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載:“人始生,先成精,精成而腦髓生”“頭者,精明之府,頭傾視深,精神將奪矣”,闡明腦與人體精神活動(dòng)發(fā)生發(fā)展密不可分[21],同時(shí)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中還有記載:“心者,君主之官,神明出焉”“神氣舍心,魂魄并具,乃成為人”,心與神志密不可分[22]。后世醫(yī)家張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中提出:“人之神明,原在心與腦兩處”,由此可知人的精神意識(shí)思維皆與心、腦密不可分。目前也有學(xué)者提倡腦心同調(diào)治療神志、認(rèn)知等疾病。腦心同治法對(duì)于疾病的臨床治療具有極大的指導(dǎo)意義,如魏寶鈺[23]運(yùn)用清腦益智方,通過心腦同治法探討其改善血管性癡呆大鼠腦血流量的相關(guān)機(jī)制,結(jié)果顯示,清腦益智方能夠激活腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK/eNOS信號(hào)通路而促進(jìn)NO的合成,同時(shí)舒張腦微血管和改善心功能,從而增加血管性癡呆大鼠的腦血流量,改善其認(rèn)知功能。李潔等[24]在腦心同治治療思路下,選用內(nèi)關(guān)、水溝與神門等穴位聯(lián)合利培酮治療精神分裂癥患者,結(jié)果顯示其具有改善患者注意力、語言能力、記憶力、視空間及執(zhí)行能力等認(rèn)知方面的優(yōu)勢(shì)作用,卓佳兵等[25]通過心腦同治針刺法結(jié)合認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練,顯著改善了腦梗死患者的認(rèn)知能力。本研究選取風(fēng)池、水溝和內(nèi)關(guān)3個(gè)穴位,其中“風(fēng)池”穴位于腦后部,是足少陽膽經(jīng)的腧穴,該穴具有補(bǔ)腦益智、醒腦開竅的作用[26];“水溝”屬督脈,督脈“入屬于腦”,此穴是醒腦開竅針刺法的主穴之一,具有開竅啟閉、醒腦神調(diào)臟腑的作用;“內(nèi)關(guān)”穴為手少陰心包經(jīng)之絡(luò)穴,心包經(jīng)代心受邪,針刺此穴可起到滋養(yǎng)心神、疏通氣血的作用。內(nèi)關(guān)穴其下有正中神經(jīng),而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中正中神經(jīng)電刺激可起到治療意識(shí)和認(rèn)知障礙的作用,從側(cè)面為內(nèi)關(guān)治療認(rèn)知和意識(shí)障礙提供了科學(xué)性依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)選用的風(fēng)池穴、內(nèi)關(guān)穴及水溝穴,通過調(diào)理心或腦的功能,腦心同治,共奏醒腦開竅、調(diào)神益智之功效,對(duì)TBI后認(rèn)知障礙起到改善作用[27-28]。

根據(jù)既往的實(shí)驗(yàn)及臨床結(jié)果顯示,介入時(shí)間點(diǎn)是針刺療效的決定性因素之一,目前臨床上應(yīng)用針刺治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中等腦病多在恢復(fù)期,確定發(fā)病早期針灸治療的有效性將擴(kuò)大臨床上針灸的干預(yù)窗口期。已有研究者發(fā)現(xiàn)早期針刺介入能更好地改善腦卒中患者的臨床癥狀,他們推測(cè)發(fā)病6～48 h是針刺介入腦卒中的最佳時(shí)期[29-30]。劉勇等[31]為研究針刺介入時(shí)機(jī)對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞中特異性磷酸酶(PTEN)、高磷酸化蛋白激酶(p-AKT)以及磷酸化糖原合酶激酶(p-GSK3)表達(dá)的影響,分別在造模后2 h、72 h以及168 h進(jìn)行針刺。結(jié)果顯示造模后2 h進(jìn)行針刺治療能夠更好地抑制缺血性中風(fēng)大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡,保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)元細(xì)胞,療效較好。課題組前期研究表明造模后即刻開始針刺能降低大鼠血清(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)GFAP和S-100B蛋白水平,還可提高TBI大鼠腦內(nèi)GLT-1 mRNA的表達(dá),抑制谷氨酸興奮毒性,減輕神經(jīng)炎癥,降低細(xì)胞凋亡,從而減輕腦損傷,明顯減輕大鼠腦損傷的程度[27,32],但仍缺乏關(guān)于電針不同介入時(shí)間對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后認(rèn)知障礙影響的研究。本研究經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)造模后即刻開始針刺相比造模后第3天、造模后第7天針刺,能更顯著地改善認(rèn)知功能。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)表明電針介入時(shí)間越早,即傷后即刻開始針刺對(duì)TBI后認(rèn)知障礙的療效最好,具體表現(xiàn)在降低IL-1β、IL-18的表達(dá),減少炎癥和神經(jīng)細(xì)胞死亡數(shù)量,改善神經(jīng)功損傷,提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和水平,這為臨床上何時(shí)應(yīng)用針刺治療TBI患者提供科學(xué)依據(jù)。后續(xù)在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,筆者團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步深入探討電針治療TBI后認(rèn)知障礙的機(jī)制,為針刺的有效性和科學(xué)性提供依據(jù)。