利用X射線CT技術研究根系三維構型的進展

關鍵詞： 根系三維構型； X 射線CT； 圖像分割； 根系定量化

根系是植物在土壤中吸收養分、水分和氧氣的重要器官，其對錨定植物地上部、改變植物抗倒伏有重要的作用[1]。根系對土壤環境具有高度適應性，當感知到土壤中的氧氣、水分、養分、機械阻力等脅迫后，根系會及時作出響應，如改變生長角度[2]，增粗[ 3 ]、深扎[ 4 ]、向孔隙生長[ 5 ? 6 ]等以適應土壤環境的變化。同時，根系活動會影響其周圍土壤的物理、化學和生物性質[ 7 ]。對根系三維構型的可視化與定量化研究有助于了解根系生長動態，認識植物對土壤環境的適應機制以及根系與土壤的相互作用。

土壤是自然生態系統中植物根系生長的介質，由于土壤不透明且組成、結構復雜，研究其中生長的根系十分困難。很多研究中使用均質、透明的生長介質（凝膠[ 8 ]、瓊脂[ 9 ]） 來代替土壤，或者采用水培、砂培等方法來觀察根系的構型。但是由于這些介質的性質與土壤存在較大差異，導致研究結果與實際情況可能存在較大差異。為了獲取自然土壤中根系的結構，過去大多采用破壞性取樣的方式，包括挖掘法[10]和根鉆法[11?12]等，結合圖像獲取和分析來得到根系特征。這類方法雖簡單易行，但耗時耗力，且容易對根系造成損傷，經常無法獲取完整根系構型特征。Wu 等[13]在田間挖掘的同時，采用三維數字化儀結合圖像處理在田間原位獲得相對完整的玉米根系三維結構，能精細的獲得玉米軸根特征，但無法捕獲側根、根毛等細根信息，且該方法費時費力。微根管法是一種非破壞性的原位觀察植物根系的方法[14]，通過在土壤中裝入玻璃管或塑料管，配置攝像系統，動態觀察貼管壁根系（尤指細根） 的生長、衰老、死亡及分解等過程，獲得根系伸長率、根系密度、根表面積及根系數量等根系特征[15]。但微根管法只能獲取根管周圍根系的構型，是否能完全代表整株植物根系生長還存在疑問[16]。探地雷達法[17]通過電磁波對土壤中具有不同介電常數物質的響應特征來實現對目標的探測，該方法主要用于研究大型植物根系，對細根探測靈敏度較低。

非破壞性獲取土壤中三維根系構型方法近年來得到了快速的發展，其中核磁共振成像（MRI） 和X射線斷層成像（compute tomgraphy，CT） 可無損分析根系三維結構。核磁共振法[18]通過強磁場和射頻場獲取樣品的3D 數據集，然后通過圖像分析將根系從土壤中提取出來。然而，土壤中順磁性離子的存在會影響成像效果，從而不能分析植物的細根。X 射線CT 掃描是一種快速、無損、非破壞性研究土壤中根系三維構型的方法，被認為是打開土壤“黑箱”的鑰匙，近年來在根系研究中得到了廣泛的應用[7， 19?20]。本文詳細介紹了利用X 射線CT 技術研究植物根系的原理和方法，對X 射線CT 掃描的關鍵環節、參數設置、圖像處理和分析的主要方法進行了總結，以期為根系構型相關研究提供參考。

1 X 射線CT 的基本原理及主要類型

1.1 X 射線CT 的基本原理

X 射線穿透樣品時能量會發生不同程度的衰減。當強度為Io 的X 射線穿過厚度為D 的某一均質物體后，射線強度由于物體的吸收和散射而衰減為I，并服從Beer-Lambert 定律：

式中：μ 為該物體的線性衰減系數，它取決于該物質的組成和密度。而當X 射線穿過厚度為D 的一組混合物質時，其衰減程度決定于光路內每一離散點上物質的衰減系數。用探測器檢測衰減后的投影信號并將其傳輸到計算機上。通過改變X 射線穿透的角度，可以獲取一組投影數據，通過重建算法可以計算出樣品內每一個離散點的線性衰減系數，根據線性吸收系數的差異，可以區分樣品內部不同物質的組成[19]。在土壤中，富含金屬的顆粒對X 射線的衰減作用最大，其次是石英砂、粘土礦物、有機質，最后是空氣，即土壤孔隙。根系的灰度值介于土壤基質和土壤孔隙之間（圖1），且與土壤有機質的灰度值較接近，同時還受土壤含水量等因素的影響[7]。

1.2 用于根系掃描研究的X 射線CT 主要類型

根系構型研究中應用的CT 主要包括醫用CT、工業顯微CT 和同步輻射顯微CT 等類型。不同類型CT 的X 射線類型、空間分辨率、適用范圍等存在較大差異[19] （圖2）。

醫用CT 的X 射線源和探測器繞著被掃描的物體轉動（圖2a），其錐形光束具有相對廣泛的能量范圍。醫用CT 優勢在于可以在相對較短的時間內進行掃描，且能夠掃描較大的樣品。但醫用CT 研究根系的缺點是分辨率較低[7]。Lontoc-Roy 等[21]利用醫用CT掃描了萌發5 天內的玉米根系，圖像空間分辨率為0.12 mm×0.12 mm×0.1 mm。Subramanian 等[22]利用醫用CT 掃描了生長3 周的玉米根系，分辨率為0.35 mm×0.35 mm×0.40 mm。Han[23]掃描了生長10 周的土豆根系，分辨率為0.176 mm×0.176 mm×0.2 mm。醫用CT 可以掃描野外采集的原狀大土柱。例如Hu 等[24]對不同類型草地的土柱樣品（直徑10 cm，高50 cm）進行掃描，分析根系的特征，分辨率為0.146 mm×0.146 mm×0.312 mm。

工業顯微CT 也是多色光源，X 射線源的能量范圍較寬。在掃描時，X 射線源和探測器固定，被掃描的樣品水平旋轉（圖2b）。工業顯微CT 的分辨率范圍較大，一般可以達到10～100 μm[20]，而且隨著技術的不斷發展，工業顯微CT 的分辨率還在提高。在根系結構研究中，工業顯微CT 的應用最普遍，目前已用于研究玉米、水稻、小麥、番茄等多種作物的根系[20]。不同類型工業顯微CT 可掃描樣品的大小和分辨率不同，因而其可研究的作物以及作物根系的生長期范圍也不相同。具體來說，小型的工業顯微CT 可掃描的樣品尺寸較小，因此多用于研究作物苗期的根系[25?26]。中型和大型的CT 可掃描的樣品尺寸較大，因此不僅能夠研究苗期的根系，還可以研究不同生育期的根系。

同步輻射顯微CT 的X 射線束是一束能量范圍很窄的射線。在掃描時，X 射線源和探測器固定，被掃描的樣品水平旋轉（圖2c）。同步輻射CT 的優勢在于掃描速度快，分辨率更高，其掃描樣品的尺寸也較小，因此多用于研究細根對某些特定元素的吸收[27?28]，鮮用于研究根系整體構型。Kurogane 等[29]成功從同步輻射CT 圖像中分割出了擬南芥的根系。Aravena 等[30]利用同步輻射CT 研究了根系壓實對根際水力學特性的影響。此外，同步輻射CT 在國內數量少，限制了其在根系結構研究方面的應用。

2 樣品準備、CT 掃描和圖像重建

2.1 樣品準備

三維根系構型的定量化研究通常使用原狀或填裝的土柱樣品，這些樣品來自田間取樣或室內培養試驗，在田間取樣或室內培養過程中需盡量減少對樣品的擾動，以免破壞根系構型。

土柱樣品大小直接影響CT 圖像質量與分辨率[31?32]。為了獲取土壤樣品中的根系整體結構，在CT 掃描過程中，X 射線需要穿透整個樣品后在探測器上成像。土壤樣品直徑越大，掃描分辨率相應越低，樣品內部細節信息損失越多。另外，樣品直徑越大，掃描過程中X 射線衰減程度越大，需要調高X 射線的強度以保證探測器收集到足夠的光子，從而保證成像質量。也有學者在不破壞樣品的情況下，只對樣品的感興趣區域進行成像，從而獲取更高的圖像分辨率[33]。因此，在樣品采集和準備過程中，就應該考慮到CT 掃描儀的要求和目標圖像的分辨率需求。

樣品容器、土壤含水量、土壤質地和緊實度等因素也會影響圖像質量和根系的可辨別程度。在田間取樣或室內培養試驗開始之前，需要選擇合適的樣品容器。選擇時應注意以下兩點：第一，在滿足試驗或取樣要求的前提下，容器壁越薄，越有利于X 射線穿透樣品；第二，避免使用金屬容器，因為金屬密度大，X 射線穿透時的衰減極強。研究者們大多數選擇低密度的PVC 或有機玻璃容器。土壤樣品的含水量太高或土壤顆粒過于緊密會影響根系的對比度，增加后期根系分割的難度。Zappala 等[34]建議采樣時土壤含水量應低于田間持水量。

2.2 CT 掃描和圖像重建（以工業顯微CT 為例）

在CT 掃描過程中，土柱樣品被固定在X 射線源和探測器之間的樣品臺上，并隨著樣品臺勻速旋轉360° （同步輻射顯微CT 樣品臺旋轉180°）。在此過程中，探測器采集若干張投影圖。隨后，通過重建算法將這些投影圖重建為由二維切片組成的三維圖像。圖像重建的算法包括標準的背投影算法[19]、迭代重建算法和深度學習重建算法等[35]，其中，背投影算法因計算效率高而被廣泛采用。

CT 設備的物理性能和掃描參數設定是影響圖像質量的重要因素。利用不同類型CT、不同掃描參數和分辨率研究植物根系的一些示例見表1。空間分辨率不僅由掃描樣品的直徑決定，還與CT 設備的射線源和探測器類型有關[45]。低空間分辨率會造成圖像中細根信息的缺失，不利于研究細根與土壤微環境間的交互作用[46]。Mairhofer 等[47]對玉米根系樣品和番茄根系樣品分別以25 和48 μm 的分辨率進行成像，發現從低分辨率圖像中提取到的玉米根系的表面積誤差較大，且損失的側根比番茄多。掃描電壓的高低決定了X 射線是否具有足夠的能量穿透樣品。能量過低會導致圖像噪聲多、對比度低，而能量過高同樣會降低圖像的對比度，增加了后續圖像處理時提取根系的難度。掃描電流控制著X 射線脈沖的強度，較大的電流可以提供更強的信號，有助于改善圖像質量。射束硬化也是掃描過程中較常見的現象。射束硬化是由于連續能譜的X 射線穿過樣品后，低能量射線優先被吸收，而高能量射線較易穿過樣品，因此在X 射線傳播過程中，平均能量變高，射線逐漸硬化。Ketcham 等[48]對掃描過程中出現的射束硬化給出了幾點解決辦法：第一，在射線源處使用銅或鋁濾波片；第二，減小樣品尺寸；第三，在圖像重建時進行校正。另外，掃描時長受采集圖像的張數和曝光時長等參數共同決定。一些CT設備具備快速掃描功能，極大地提高了掃描效率。但是，快速掃描是以降低圖像對比度為代價的，會增加圖像噪聲。而長時間的高功率掃描則會造成CT 設備中的鎢靶過熱，影響X 射線的穩定性，影響圖像質量。因此，選擇適當的掃描時間對獲取高質量圖像具有重要作用。總體而言，從CT 圖像中提取根系對圖像對比度的要求極高，這需要在設備的選擇和參數的設置上謹慎權衡。

3 從CT 圖像中提取根系的方法

圖像分割前的預處理（降噪、去偽影和均衡灰度等） 對后續根系的提取十分重要。圖像清晰度低是分割效果差的主要原因。Schluter 等[49]研究表明原始數據的缺陷，如噪聲、環狀偽影和強度不均一，可以用圖像增強方法去除。Sleutel 等[45]指出，處理圖像時使用濾波可以有效降低CT 圖像中的偽影，均值濾波可以消除圖像中灰度重疊部分[31]，Sigma 濾波可以降噪[50]。為了避免圖像分割時出現過度割或欠分割的現象，Hou 等[20]認為可以使用“形態濾波”對圖像進行預處理，在ImageJ 軟件中“MorphoLibJ”插件的“sizeopening 2D/3D”功能可以實現。此外，去噪也可以作為后處理應用于根系的提取上，最常用的后處理方法是腐蝕和膨脹（erosion/dilate） 或開和閉（opening/closing） 等形態學算法[51]。另一種后處理方法是基于體積大小的對象移除法，即刪除小于某一體積的所有單個對象。該功能可以使用VG Studio 軟件的“Operate”算法來過濾掉所有獨立于根系整體之外的獨立的對象（過度分割的非根系區域）。

通過圖像分割將根系從圖像中提取出來是圖像處理過程最關鍵的一步。根系分割的算法主要有全局閾值法、區域生長法、根系追蹤法和深度學習法等。根系分割方法也可以根據操作過程的不同歸納為手動法、半自動法和全自動法[20]。

全局閾值法（global thresholding） 是基于圖像灰度直方圖估算的聚類分析法[52]，聚類分析指的是聚合位于固定范圍內的所有像素對應的灰度值。該方法需要先確定圖像中根系的灰度值范圍，然后將這些范圍的灰度區域分割出來。然而，由于土壤是一個復雜的多相系統，土壤孔隙（空氣）、水分以及礦物顆粒的X 射線衰減系數不同， 密度高的礦物顆粒衰減系數最大（灰度值最高），對應的顏色最亮；孔隙的灰度值最低，顏色最暗；根系則介于二者之間（圖1）。因此，在CT 成像過程中，根系和其周圍土壤環境對X 射線的重疊衰減使得根系邊界不清楚，應用全局閾值法從土壤中提取根系難度很大，對圖像質量要求高。一些研究應用全局閾值法成功的從CT 圖像中分割出了根系。Pierret 等[52]應用CT 掃描技術結合全局閾值分割法從均質砂土中提取了栗樹和楓樹的主根信息，但提取出來的根系不連續。Kaestner 等[53]首先對CT 圖像進行了非線性濾波平滑去噪，再使用全局閾值法分割圖像并對分割出來的根系進行了膨脹運算，最終從均質砂土中提取出了主根及側根信息。然而，以上研究均是在均質砂土中進行的，對復雜的田間土壤效果不好。由于全局閾值法只能簡單的使用某一閾值對圖像進行分割，無法區分與根系具有相同灰度值的其他介質，因此可能更適應于均質材料或均勻分布的填裝土中根系的提取。

區域生長法（region growing） 是常用的提取根系的方法之一。與全局閾值法相比，采用自適應閾值法的區域生長法可以從非均質土壤中分割根系。區域生長法首先在某一區域內判斷并選擇根系為種子點，通過自動對比灰度值并應用不同生長條件來提取該區域內與種子點相連的所有根系[54]。Fang 等[41]利用VG StudioMax 3.4 軟件的“region growing”功能從填裝的水稻土中提取了水稻幼苗根系，進而計算得到了根系的體積、表面積、根長等參數，這些參數與洗根后利用根系掃描儀得到的數據具有很好的相關性。Pfeifer 等[37]采用相同的方法對田間未擾動土壤取樣后進行CT 掃描和圖像處理，提取到了植物的主根系。近期，我們通過室內盆栽試驗研究了成熟水稻根系和蚯蚓洞的關系，并成功提取到了較為完整的成熟水稻根系（圖3）。然而，由于土壤的非均質性和偽影的存在，整個土體中的局部閾值往往不一致。因此，需要不斷手動選取種子點并調整閾值范圍，以更準確的提取出根系。

根系追蹤法（root tracking） 是將整個三維的CT圖像視為沿Z 軸排序的一系列X?Y 水平橫截面切片，然后通過某種算法沿著Z 軸自上而下或自下而上依次追蹤每張橫切面切片內根系的運動軌跡[55?56]，該算法的優點是既可以基于根系對X 射線的衰減值[54]，也可以基于根系的形態來追蹤根系[51]，極大地縮減了處理圖像的時間。與全局閾值法不同的是，根系追蹤法不需要考慮根系與其周圍土壤環境對X 射線的重疊衰減問題。然而，應用根系追蹤法無法提取到不連續的根系。RootViz 是由Davidson 開發的自動追蹤根系的軟件[57]，Tracy 等[58]利用該軟件成功從模擬壓實的填裝土柱中提取到了較為完整的小麥根系，該研究還將RootViz3D 與VG StudioMax2.0 軟件（區域生長法） 提取到的根系進行對比，發現RootViz3D 可以提取到更多的側根信息。此外，Mairhofer 等[59]基于水平集算法開發了Rootrak 軟件，并提取了多種植物的根系。利用Rootrk 提取根系時受人為操作和根系類型的影響較小，受CT 圖像質量（圖像噪聲） 的影響較大，當出現根系追蹤失敗時，需要人為進行干預并重新初始化。

深度學習法（deep learning） 是基于類神經網絡算法的機器學習方法，屬于人工智能的分支。深度學習法在計算機、醫學乃至植物表型領域廣泛應用。Wieland 等[60]將深度學習算法應用在了三維根系的圖像分割上，該技術可以處理對比度較低的CT 數據， 但分割出的根系不是很完整且雜質較多。Soltaninejad 等[61]開發了一種基于多分辨率編碼—解碼原理的深度學習法，可以自動從CT 土壤圖像中提取出較為復雜的小麥根系，實現了從幼苗根系到復雜根系的突破。深度學習算法具有不受人為影響、自動化程度高的優點，但是其局限性是需要大量的數據集用于訓練。

除上述工作外，研究者們還開發了自動或半自動分割根系的軟件。Flavel 等[36]開發了一個半自動化分割根系的ImageJ 插件—Root1，不僅較為完整地提取到了小麥根系，還自動計算出了根系的形態學參數，如根系長度和角度[36]。同樣是基于ImageJ 軟件平臺，Gao 等[40]開發了一種新的半自動化根系分割工具Rootine v.1，該算法是基于根系的管狀形態對根系進行分割。在根系的提取和分割精度方面，Rootine v.1 優于Root1 和Region growing 方法。Gao 等[40]應用Rootine v.1 成功分割出了直徑小于90μm 的玉米細根信息。然而，在Rootine 中，應用“tubeness”算法之前需對根系表面進行平滑預處理，最終可能會影響根系表面積等指標的準確性。其次，Rootine 中的算法需要輸入大量人為校準后的參數。Phalempin 等[ 6 2 ]開發了一個新的版本Rootinev.2，該算法的分割精度得到了進一步提高，并且減少了輸入參數的數量。

4 三維根系構型定量化方法

將根系從CT 圖像中分割出以后，就可以計算根系相關參數，量化根系構型。Iyer-pascuzzi 等[ 8 ]和Clark 等[9]提出了一系列可測量的根系參數，其中包括根系體積、根系凸包體積、根系表面積、根系長度和根系平均直徑等（表2）。此外，根系空間分布特征可以用根系角度、最大伸長深度等參數來表征。這些參數原則上都是基于CT 圖像中根系對應的像素點來計算的。例如，根系體積可以通過計算體素總個數并乘以單個體素的大小來獲取。根表面積可以通過Marching Cubes 算法[63]將等值面提取為三角形網格，并將網格中所有三角形的面積相加，從而獲得表面積。上述計算根系體積和表面積的方法被Rootrak 和VG Studio 等軟件采用[64]。根系長度通常需要通過對提取出來的根系進行骨架化（圖4a），然后對每條骨架的路徑距離（branch distance） 求和得到根系總長度，該參數可以利用ImageJ 軟件獲取[26， 39]。根系平均直徑可以通過ImageJ 軟件的“thickness”功能獲取（圖4c），該方法的原理是擬合三維根系空間中的最大球體，球體直徑作為相應的根系直徑。上述根系長度和平均直徑的獲取方法被Fang 等[ 4 1 ]和Xiong 等[26]研究所采用。根系角度由穿過根系的兩個極值點和垂直平面的直線之間的夾角表示，該參數可用VG Studio 軟件中的角度工具手動測量出每條根的角度（圖4b），因此該方法比較適用于結構相對簡單的根系。根系角度也可由ImageJ 中“analyzeskeleton”插件獲取根系分支（骨架） 的兩個端點的坐標，從而根據空間向量方法計算分支與平面的夾角。根系的凸包體積（convex hull volume） 使用QuickHull[ 6 5 ]算法獲得，表征根系的整體形狀和大小。該指標可以用來比較和區分不同植物的根系[8]。最大伸長深度表示根系生長達到的最大垂直距離，可利用ImageJ 軟件的“analyze particle”插件獲取。

三維根系定量化的方法已被許多研究報道，Wieland 等[60]利用VG Studio MAX 軟件的區域生長法提取出根系，進而得到了根系的體積和平均直徑。Atkinson 等[6]在獲取小麥根系三維結構的基礎上， 量化了根系對土壤中生物孔隙的利用率。Phalempin 等[44]應用Rootine v.2 軟件從圖像中分割出玉米根系后，再用ImageJ 軟件的“skeletonize （2D/3D）”和“local thickness”插件分別獲取了根系長度和直徑，發現在不受水分和養分等脅迫的填裝土壤中，根系不會優先利用根孔下扎。為了更加高效地定量根系構型，Mairhofer 等[ 5 9 ]開發的半自動化軟件—Rootrak，除了可以追蹤根系外，Rootrak 也可以直接獲取三維根系的參數，比如根系凸包體積，最大根系深度和寬度等。為了獲取更多表征根系的指標，Mairhofer 等[66]又開發了一個專門定量根系參數的軟件—RooTh，該軟件需要導入已分割好的根系圖像，通過對根系圖像進行骨架化，從而獲得根系體積、表面積、長度、角度等參數， 可以很好地對RooTrak 軟件獲得的數據進行補充。

5 展望

對外部環境變化的機制和植物與土壤的交互作用。X 射線CT 技術是室內研究根系三維構型的有效方法，且得到了廣泛的應用。然而，從CT 圖像中提取根系的算法在實際應用中仍存在很多問題。對于復雜的田間土壤樣品，活根系與未完全分解的根系或秸稈的X 射線衰減系數差異較小，與根系周圍土壤水分、顆粒有機碳等的衰減系數也比較接近，導致通過圖像分割方法區分它們的難度很大。根據根系的形態、連通性并結合灰度值等各類特征，開發提取根系的算法，準確獲取根系的三維構型，仍將是CT 技術用于根系研究的重要方向。此外，不同研究中采用的定量根系構型的指標體系、計算方法等不太一致，限制了不同研究間的對比；而采用相同的指標體系則會有助于不同研究間的比較和研究者之間的交流。

X 射線CT 掃描設備近年來發展很快，但是目前無法在野外直接應用，原位監測田間根系動態生長過程及根系行為等方面的研究仍存在技術瓶頸。從田間采集用于室內CT 掃描的樣品可能會破壞根系整體構型。此外，CT 設備所能掃描的樣品尺寸有限，且存在分辨率和樣品尺寸的矛盾。X 射線CT 硬件設備的創新和發展，對其在根系研究中更加廣泛和有效的應用具有重要意義。