促生菌種組合提高玉米根際土壤有益微生物基因豐度及促生效應研究

關鍵詞： 生物肥料； 促生機制； 植物根際促生菌； 合成菌群； 玉米

玉米是我國最重要的農作物之一，全國玉米種植面積占農作物播種面積的37%，其年產量高達27255.2 萬t[1]。玉米是高產喜肥作物[2]，然而，大量使用化肥破壞土壤結構，同時加劇環境負擔[3?4]。植物根際促生細菌 （PGPR） 是一類定殖于植物根際并能對植物生長產生促進作用的有益菌，在微生物肥料領域具有重要的應用價值[5]。PGPR 是最常用的微生物肥料的菌種來源[6]。研究發現，PGPR 菌肥與半量化肥共同處理黑青稞，供試的PGPR 菌肥大多數能顯著促進黑青稞生長、提高產量和改善營養品質[7]。然而，單一菌株施入土壤后，難以與土著微生物競爭[8]，不能在植物根系上很好地定殖，達不到預期的效果[9?10]。復合菌劑具有協同作用，通過分泌不同生理活性物質，影響植株的生理代謝活動，促進植物生長。以梭梭根際促生菌為主要菌源制備的復合菌肥，與單株菌肥相比，顯著提高了番茄產量且優化了番茄根際土壤特性[11]。由4 株促生菌組成的細菌聯盟，通過增加植物激素、土壤養分的有效性以及有益菌群的豐度，間接促進了植物的生長[12]。玉米施用生物菌肥能夠減少化肥用量并提高玉米產量[13]，但近年來，如何制備玉米根際促生合成菌群并研究其促生效應的相關報道較少。

本研究以前期從玉米根際篩選出的26 株優質PGPR，根據菌株的解磷、解鉀、固氮、分泌吲哚乙酸 （IAA） 和產鐵載體的特性，構建多個合成菌群。通過宏基因組測序，揭示玉米根際促生菌群對玉米的促生機制，為玉米根際促生菌肥的開發提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米為墾粘1 號，購自齊齊哈爾市勝利種子商店。

供試土壤采自黑龍江省齊齊哈爾市梅里斯區，土壤基本理化性質如下：有機質22.85 g/kg，全氮2.19 g/kg，有效磷4.12 mg/kg，速效鉀136 mg/kg，pH 為7.58。

供試菌株由齊齊哈爾大學微生物學實驗室提供。依據菌株具有的解磷、解鉀、固氮、分泌IAA和產鐵載體能力，構建合成菌群。具體信息如表1所示。

1.2 復合菌劑促生效果盆栽試驗

挑選健康、完整的玉米種子，放置于5% （v/v）次氯酸鈉中浸泡3 min，然后在70% （v/v） 乙醇中浸泡3 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3 次。種子在光照培養箱 （Thermo Scientific，美國） 中培養至芽長1～2 cm。將各功能菌株分別活化于牛肉膏蛋白胨培養基中，30°C、200 r/min 振蕩過夜，吸取適量菌液稀釋100 或1000 倍并在旋渦混合儀上混合均勻，用細菌計數板統計菌數，并計算原始菌液濃度，將菌液離心并收集菌體至10 mL 離心管中。將收集的菌體懸浮于1×磷酸鹽緩沖液 （PBS） 中，并將各菌株的懸浮液稀釋至108 CFU/mL。選擇無拮抗作用的菌株，根據表1 的原則進行組合構建，將各菌株的懸浮液等體積混合于50 mL 離心管中，制備成多菌株懸浮液。

此外，將表面滅菌并發芽的玉米種子浸泡在懸浮液中1 h，并用等量的滅菌PBS 緩沖溶液浸泡作為對照。將接種菌懸浮液的玉米種子用鑷子分別播種在滅菌土壤和未滅菌土壤中，進行盆栽試驗。盆栽試驗共設置10 個處理：MCK （滅菌土+滅菌水）、WCK （未滅菌土+滅菌水）、MC1 （滅菌土+合成菌群C1）、WC1 （未滅菌土+合成菌群C1）、MC2 （滅菌土+合成菌群C2）、WC2 （未滅菌土+合成菌群C2）、MC3 （滅菌土+合成菌群C3）、WC3 （未滅菌土+合成菌群WC3）、MC4 （滅菌土+合成菌群C4） 和WC4 （未滅菌土+合成菌群C4） 。在恒溫恒濕培養箱中培養9 天。輕輕將玉米幼苗從土壤中拔出，用流動水將根部清洗干凈后，測量其株高和鮮重，并用根系掃描儀分析其根長、根尖數和分叉數。

1.3 土壤施用復合菌劑試驗

采用同樣方法處理玉米種子，播種在滅菌和未滅菌土壤中。每5 天澆灌1 次菌株懸浮液（×108 CFU/mL，5 mL），待玉米幼苗生長至第15 天，將玉米幼苗輕輕拔出，刷去大塊土壤，搖晃去除多余土壤，僅保留緊貼根部約1 mm 的土壤，經離心、超聲振蕩后收集根際土壤[14]。收集促生效果最佳的菌群處理組及對照組玉米幼苗的根際土壤，用于宏基因組學測序。每個處理設置3 個重復。使用FastDNA?SPIN 試劑盒 （MP Biomedicals，Solon，USA），從0.5 g 土壤中提取總DNA[15]。使用Illumina NovaSeq 測序平臺進行宏基因組測序 （上海美吉生物醫藥科技有限公司）。使用SOAPaligner 軟件，將樣品中高質量reads與非冗余基因集比對，統計基因的豐度信息。使用Diamond 將非冗余基因集的氨基酸序列與NR 數據庫和KEGG 數據庫比對，并通過分類學信息數據庫獲得對應的物種注釋，同時獲得基因對應的KEGG 功能信息，使用KO、Pathway 對應的基因豐度總和計算對應功能類別的豐度。

1.4 統計分析

利用托普根系分析儀對根系數據進行分析，用Excel 進行數據整理。利用SPSS 26 軟件的Student’sT 檢驗方法在0.05 水平進行差異顯著性分析，采用Origin 2021 作圖。

2 結果與分析

2.1 復合菌群的促生效果分析

對C1、C2、C3 和C4 菌群的促生效果進行盆栽驗證，結果（圖1） 表明，C4 處理后的滅菌組（MC4）與對照組 （MCK） 相比，玉米幼苗的株高、地上鮮重、根鮮重、根長、根尖數和分叉數分別提高了28.97%、46.00%、59.99%、61.99%、62.27% 和46.70%。在未滅菌組 （WC4） 分別提高了27.49%、25.86%、50.13%、40.11%、62.26% 和82.55%。對根鮮重進行測定后發現，菌群C1 在未滅菌組中的促生效果最好，根鮮重提高了72.67%，而在滅菌組中C2 促生效果最好，根鮮重提高了81.23%。對4 個菌群的綜合能力進行分析，發現無論在滅菌組還是未滅菌組，菌群C4 都具有最強的綜合能力，其次是菌群C2、C1 和C3。

2.2 菌群C4 對根際細菌群落多樣性的影響

接種菌群C4 后玉米根際細菌屬水平的α 多樣性分析和β 多樣性分析結果（圖2） 顯示，在滅菌組中，MC4 的Chao 指數顯著高于MCK；在未滅菌組處理中，WC4 的Simpson 指數顯著低于WCK。這說明接種菌群C4 改變了土壤微生物α 多樣性及豐富度。

采用非度量多維尺度NMDS 進行微生物群落的距離分析，表征β 多樣性。在屬水平上，在滅菌與未滅菌處理中，應力函數值均為0.000，小于0.05 （圖2），能較好地揭示不同處理間細菌群落組成的差異，初步判斷復合菌群的接種影響了細菌群落的組成。

2.3 菌群處理對玉米根際微生物群落的影響

對相對豐度大于1% 的菌屬進行注釋，將相對豐度小于1% 的菌屬合并。圖3A 和3C 顯示，不同處理在屬水平上的土壤細菌群落組成存在差異。在滅菌組處理中，相對豐度較高的菌屬包括Massilia、Kosakonia、Duganella、Pseudomonas、Exiguobacterium、Stenotrophomonas 等。而未滅菌組中相對豐度較高的菌屬包括Actinbacteria、ChlorofLexi、Rubrobacter、Nocardioides、Arthrobacter 等。

對豐度前2 5 的菌屬進行了兩組比較分析，圖3B 和3D 顯示，在M C 4 處理中D u g a n e l l a、Pseudomonas、Klebsiella、Cellvibrio、Azoarcus、Fluviicola、Streptomyces、Delftia、Pseudoduganella、Dyadobacter 和Sphingobium 相對豐度與對照相比顯著上升，分別上升了37.53%、12.53%、46.24%、50.89%、109.63%、34.83%、101.67%、27.06%、26.09%、95.23% 和118.18%。在WC4 處理中，Lysobacter、Azospirillum、Pseudoxanthomonas、Pantoea、Pseudomonas 和Klebsiella 的相對豐度與對照相比顯著上升，分別上升了36.17%、45.45%、102.27%、17.9%、104.9% 和38.7%。

2.4 菌群C4 的成員在玉米根際中豐度變化分析

菌群C4 中包含2 株Enterobacter，4 株Klebsiella，1 株Bacillus 和1 株Lelliolttia，將這8 株菌所屬的4個菌屬與NR 數據庫進行對比，獲得了樣本物種的分類學注釋信息，注釋結果如圖4 所示。Enterobacter和Klebsiella 在MC4 和WC4 處理中的注釋豐度與對照相比均顯著上升，其中Enterobacter 注釋到的豐度最高。而Bacillus 和Lelliolttia 的注釋豐度與對照組相比雖略有上升，但未有顯著差異。

2.5 玉米根際土壤中促生相關基因的注釋結果及分析

基于KEGG 數據庫對宏基因組數據中的相關功能基因進行注釋，分別注釋了磷轉化相關基因（圖5A）、固氮相關基因 （圖5B）、IAA 合成、鐵載體轉運調控、碳循環及微生物對植物的影響相關基因（圖6） 的豐度。將注釋到的相關基因以Heatmap 圖的方式進行聚類分析。如圖5A 所示，在滅菌處理共篩選到34 個與有機酸合成、磷的溶解和轉運有關的基因。在未滅菌處理中共篩選到33 個相關基因，結果顯示，接種菌群C4 后，pho、gcd、phn、ugp、ppx等基因都在MC4 和WC4 處理組顯著富集。說明菌群C4 處理后的土壤中解磷相關功能基因的數量增多，可提升土壤中的磷轉化效率。圖5B 顯示，接種菌群C4 后，nif、vnf、nrt、nar 等與固氮及氮代謝相關的基因，在MC4 和WC4 處理組豐度顯著上升。說明接種菌群C4 后，可通過提升土壤中固氮基因的豐度來提高土壤的固氮活性。

對不同處理組中與IAA 合成、鐵載體轉運調控、碳循環及微生物對植物的影響的相關基因各10個進行了聚類分析（圖6），發現iaaH、iaaA、iro、bas、fhu 等基因都在菌群C4 處理后富集。因此，菌群C4 可以通過增加促生相關功能基因的豐度來豐富土壤功能，進而達到促生的效果。

2.6 玉米根際土壤中促生相關基因的溯源分析

為探索功能基因及功能菌株間的聯系，圖7 分別篩選了結果2.5 中在MC4 和WC4 處理組豐度均上升的部分功能基因 （nifK， nasA， nifH， norB， ugqB，phnW， phnJ），并對其進行微生物溯源分析，構建單個基因的基因集后進行物種注釋、功能注釋，得到攜帶相同功能基因但在分類上不同的微生物菌屬分類信息。并將追溯到的微生物 （屬水平） 豐度與功能基因豐度進行線性回歸方程擬合，得到相關性系數。結果表明，豐度上升的Pseudomonas 在7 個基因集中均被注釋到，在ugqB、phnW 的基因集中注釋到了與菌群C4 的部分成員相同的菌屬Klebsiella。相關系數的分析結果顯示，多數有益微生物菌屬豐度與功能基因豐度呈正相關。說明菌群C4 通過提高玉米根際土壤的有益菌屬豐度來富集促生相關功能基因，進而發揮其促生功能。

3 討論

合成菌群中包括多個微生物物種，功能不同的微生物菌株通過協同作用，為植物寄主提供多種利益，使植物更好地適應新環境，以改善植物生長并最終提高作物產量[16?17]。物種間可通過營養互補和代謝分工等不同的代謝作用，影響彼此之間的相互作用，進而影響菌群的作用效果[18?19]。

接種菌群C4 后，未滅菌與滅菌土壤中的細菌群落存在差異，這可能是由于在滅菌土壤中加入促生菌群后重塑了土壤微生物群落。Pseudomonas 被證明具有溶磷的作用[ 2 0 ]。Klebsiella 也被證明可在無氮環境中生長，溶解無機磷和鉀，并產生IAA 和鐵載體[21]。Duganella、Pseudoduganella、Delftia、Azoarcus 都被證明具有高效的固氮作用，并可以改善氮代謝[22?24]。Streptomyces 在土壤中無處不在，以產生次生代謝物而聞名，研究表明它會被特異性地招募到植物的根際和內圈[25]。以上菌屬均在本研究MC4 處理中被注釋到且豐度與對照相比顯著上升。Pantoea 和Azospirillum 可以提高固氮酶的活性，提高植物的產量[26]；Lysobacter 具有殺線蟲活性、產ACC 脫氨酶和促進植物生長的能力[27]；Enterobacter可通過固氮、產IAA 等作用促進玉米生長[28]。在WC4處理組中，Pantoea、Azospirillum、Lysobacter、Enterobacter 等有益細菌的豐度與對照相比顯著上升。其中Pseudomonas 和Klebsiella 在MC4 和WC4處理組中的相對豐度均顯著增加。顯著增加的菌屬大多是潛在的植物生長促進細菌，證明加入菌群可提高促生相關的有益菌的豐度，以此促進植物生長[29]。物種注釋的結果表明，菌群C4 所包含的4 個菌屬均可在根際土壤中被注釋到。其中，Enterobacter和Klebsiella 在MC4 和WC4 處理中的豐度均顯著增加，而Bacillus 和Lelliolttia 雖然注釋到但豐度變化不大，它們可以分泌植物生長激素和提高植物營養元素吸收來促進植物生長[30]。

本研究篩選了一些功能基因進而揭示菌群的促生機制。gcd、ppa 和ppx 是與磷增溶有關的基因，phoA 和phoD 與有機磷的礦化有關，ugpQ、phoB 和phoR 與磷酸鹽轉運蛋白有關[31?33]，pqq、gdh 與編碼膜結合的葡萄糖脫氫酶相關[34]，由PPX 基因編碼的外聚磷酸酶被證明，其在無機聚磷酸鹽降解成磷酸鹽的過程中發揮重要作用[35]。本研究基于宏基因組數據篩選了與解磷相關的基因，結果顯示，上述與解磷相關基因的豐度都在MC4 和WC4 處理中升高，說明菌群可能通過提升磷轉運相關基因的豐度，有效地獲取和競爭磷元素，利用微生物群落來提高可持續農業中的磷有效性。固氮基因家族nif 相關的基因都是固氮所必需的基因[36]，nir、nor 和nos 等基因都是參與氮循環的基因[ 3 7 ]。上述基因在接種菌群C4 后的豐度都得到提升，說明菌群C4 可能通過提升土壤中固氮基因的豐度來改善土壤的固氮活性，從而提高植物對氮元素的利用率。碳循環、微生物對植物的影響、IAA 合成及鐵載體的轉運與調控均是與植物促生密切相關的因素。fab、gdh、ppc 是參與碳循環和轉運的相關基因[37]。vir 基因家族與膜轉運、細菌分泌系統相關，tur 是植物?病原體相互作用相關途徑的重要基因，hcp 是能量代謝相關途徑的重要基因，imp、vgr 和vas 是與生物膜形成相關的基因，以上基因都是與微生物對植物的影響相關的基因[37]。iaaH、iaaA 等基因與IAA 的合成有關[38]；iro、bas、fhu 等基因與鐵載體合成、運輸及調節相關[39]；本研究結果表明上述基因在MC4 和WC4 處理中的豐度升高，證明菌群C4 還可能通過提高碳循環、微生物對植物的影響、IAA 的合成及鐵載體的轉運與調控相關功能基因的豐度，來實現對植物促生和保護植物健康的作用。

4 結論

復合菌群C4 為本研究中促生能力最強的菌群，菌群C4 顯著提高玉米幼苗的株高、鮮重、根長、根尖數和分叉數，影響玉米根際微生物的組成和功能，提高微生物群落的多樣性及豐富度，亦可以提升有益菌及相關功能基因豐度以促進玉米生長。因此，菌群C4 具有良好的促生能力，具備微生物復合菌肥開發的潛能。