復(fù)合菌劑提高青藏高原羊糞和尾菜混合堆肥微生物多樣性并加快堆肥腐熟

關(guān)鍵詞： 青藏高原； 羊糞； 尾菜； 堆肥； 復(fù)合菌劑； 細(xì)菌多樣性

青藏地區(qū)大型畜牧區(qū)域和養(yǎng)殖場(chǎng)多，年羊糞產(chǎn)出量很大，由于在高原自然條件下難以降解，可能污染土壤、地下水等自然環(huán)境[1]。近年來，高原蔬菜種植面積和蔬菜總產(chǎn)量逐年遞增，在蔬菜收獲、儲(chǔ)存、加工、裝卸以及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)都產(chǎn)生大量的尾菜，尾菜堆放也造成空氣、土壤、水體等環(huán)境的危害[2]，亟需無害化處理。采用堆肥方法對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行滅菌和資源化利用，是減少農(nóng)業(yè)廢棄物直接排放造成的環(huán)境污染的綠色、高效途徑[3]。羊糞的主要成分是木質(zhì)纖維素，干物質(zhì)含量較高[1]，尾菜中含有大量糖類、半纖維素等有機(jī)物，碳氮比較低，含水量較高[4]，羊糞和尾菜堆肥都存在發(fā)酵溫度上升較慢，腐解過程長(zhǎng)等問題[5]。青藏地區(qū)常年氣溫較低，適合大規(guī)模堆肥的時(shí)間有限，加之氧氣稀薄、空氣干燥等氣候條件，會(huì)造成羊糞和尾菜這類纖維素含量較高的農(nóng)業(yè)廢棄物的堆肥進(jìn)程放緩，嚴(yán)重影響最終堆肥的品質(zhì)，甚至導(dǎo)致堆肥失敗。因此，研究低溫干燥環(huán)境中促進(jìn)羊糞和尾菜中木質(zhì)纖維素等有機(jī)質(zhì)降解的措施，對(duì)青藏地區(qū)實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化利用具有重要意義。

接種外源微生物是加快堆肥進(jìn)程，改善堆肥質(zhì)量的有效手段。堆肥原料組成和性質(zhì)不同，環(huán)境條件不同，需要添加的微生物菌劑也存在差異，研究結(jié)果表明添加復(fù)合菌劑的效果往往要好于單一菌劑[6]。大多市售微生物接種劑中適應(yīng)低溫干燥高原環(huán)境的較少，針對(duì)羊糞和尾菜這類原料堆肥特性的菌劑研究和開發(fā)也較少。本研究利用從青藏地區(qū)自然環(huán)境中分離篩選出的具有良好有機(jī)物分解能力的5 株耐冷菌，與1 株高效纖維素降解菌制備了復(fù)合菌劑，對(duì)比市售復(fù)合菌劑，在青藏地區(qū)進(jìn)行為期60 天的堆肥，通過測(cè)定堆肥過程中的溫度、pH、電導(dǎo)率（EC）、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、種子發(fā)芽指數(shù)（GI） 等指標(biāo)，驗(yàn)證復(fù)合菌劑對(duì)堆肥升溫以及腐熟度的促進(jìn)效果，并對(duì)微生物多樣性進(jìn)行考察分析，分析復(fù)合菌劑對(duì)羊糞尾菜堆肥的降解效率，以期為青藏高原羊糞及尾菜有機(jī)廢棄物資源化處理菌劑的開發(fā)提供菌種資源和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 供試羊糞及尾菜

供試羊糞由青海省專用肥料有限公司提供，為在牧場(chǎng)地面采集的羊板糞；尾菜由西寧市蔬菜技術(shù)服務(wù)中心提供，在蔬菜種植基地收集并經(jīng)適當(dāng)曬干；羊板糞和尾菜以質(zhì)量比8∶1 進(jìn)行混合，堆肥原料所用羊糞含水率49.5%、總有機(jī)碳（TOC） 30.23%、總氮（TN） 2.02%、C/N 為15。

1.2 菌劑來源及組成

試驗(yàn)所用菌株主要為分離于青藏地區(qū)畜禽糞便、土壤和尾菜等自然環(huán)境中的菌株，在0℃～5℃能夠生長(zhǎng)繁殖，耐受最高溫度為20℃ 左右，確定其具有降解蛋白質(zhì)、纖維素和固氮的特性，通過分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定其為耐寒短桿菌（Brevibacteriumfrigoritolerans），金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.），產(chǎn)堿普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens），蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），蕈狀芽孢桿菌（Bacillusmycoides），以及1 株具有高效纖維素降解能力的放線菌（Streptomyces sp.）。將6 種菌以基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行混合發(fā)酵，復(fù)合活菌數(shù)為107 CFU/mL。混合菌液與玉米芯粉按照1.5∶1 的比例混合，避光風(fēng)干48 h，即可獲得堆肥復(fù)合菌劑。市售商品菌劑主要由芽孢桿菌、光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種菌復(fù)合而成。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

場(chǎng)地由青海省專用肥料有限公司提供，于2022年8—9 月在該廠廠房進(jìn)行，羊板糞和尾菜以質(zhì)量比8∶1 進(jìn)行充分混合后，分為3 組用于處理：不加菌劑自然發(fā)酵（CK），添加市售堆肥發(fā)酵劑（T2），添加自行制備的復(fù)合菌劑（T3）。每個(gè)處理加水調(diào)整堆體水分含量至50%～60%，堆成直徑3 m、高度1.5 m左右的錐形體，每堆約重5 t，發(fā)酵持續(xù)60 天。

1.4 指標(biāo)測(cè)定方法

每天10：00 和16：00，使用數(shù)字測(cè)溫計(jì)分別測(cè)定堆體四周及堆芯（取樣深度0.8 m） 溫度，取平均值用于進(jìn)一步分析。

在堆肥發(fā)酵的0、7、14、20、25、50、60 天取樣，每個(gè)堆體均從同深度橫向多點(diǎn)取樣后混合，以提高樣品代表性和同質(zhì)性，取回的樣品分為兩部分，一部分風(fēng)干用于理化性質(zhì)分析，另一部分液氮速凍后于?80℃ 超低溫保存箱中保存，用于分子生物學(xué)分析。

堆肥樣品采用樣水比1∶5 浸提過濾，pH 計(jì)測(cè)定pH，電導(dǎo)率儀測(cè)定EC 值。恒重烘干法測(cè)定樣品含水率，灼燒減量法測(cè)定有機(jī)碳（HJ 761—2015）[7]。風(fēng)干堆肥樣磨碎后，凱氏定氮法測(cè)定全氮含量；氯化鉀溶液提取—分光光度法（HJ634—2012） 測(cè)定NH4+-N、NO3?-N 和NO2?-N 含量[8]。

稱取發(fā)酵第62、82 天的新鮮堆肥樣品5 g 于蒸餾水中，以1∶10 比例混合，搖床振蕩浸提2 h，靜置后，用濾紙過濾得到上清液。取濾紙放入滅菌的培養(yǎng)皿中，放入20 粒油菜種子（Brassica campestrisL.）[9]，加入5 mL 堆肥濾液于培養(yǎng)皿中，以加入蒸餾水作空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，期間補(bǔ)充1 次濾液，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定種子發(fā)芽率和根長(zhǎng)。根據(jù)公式計(jì)算種子發(fā)芽指數(shù) （GI）：

G I （ % ） = （處理組平均發(fā)芽率×處理組平均根長(zhǎng)）/（對(duì)照組平均發(fā)芽率×對(duì)照組平均根長(zhǎng)）×100

1.5 微生物群落分析

DNA 提取使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit （OmegaBio-tek， Norcross， GA， U.S.） 試劑盒，DNA 質(zhì)量檢測(cè)后，開展后續(xù)試驗(yàn)。

V1～V9 區(qū)域細(xì)菌16S rRNA 基因使用引物27F5′–AGRGTTYGATYMTGGCTCAG–3′ 和1492R5′–RGYTACCTTGTTACGACTT–3′[10]擴(kuò)增，2% 瓊脂糖凝膠電泳回收擴(kuò)增產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences， Union City， CA，U.S.） 進(jìn)行純化。純化后的擴(kuò)增片段由上海凌恩生物科技有限公司用QuantiFluor? -ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，并按相應(yīng)比例混和，基于PacBio平臺(tái)進(jìn)行三代測(cè)序，構(gòu)建PacBio 文庫。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SMRT Link （ver9.0） 對(duì)原始讀取序列進(jìn)行處理，獲得一致性CCS 序列（circular consensus sequencing），使用UPARSE （ver 7.1） 對(duì)OTUs 進(jìn)行聚類（基于98.65% 的相似性），并使用UCHIME 識(shí)別并去除嵌合序列。采用RDP 分類器對(duì)silva 數(shù)據(jù)庫中每個(gè)16SrRNA 基因序列與silva （SSU132） 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫的系統(tǒng)發(fā)育隸屬關(guān)系進(jìn)行分析，置信閾值為70%[ 1 1 ]。采用Mothur v.1.21.1 進(jìn)行稀疏分析[12]，計(jì)算Chao1、ACE 和Shannon 多樣性指數(shù)，并計(jì)算各樣本中不同微生物群落在綱及種水平上的不同組分的相對(duì)豐度。使用群落生態(tài)包R-forge （Vegan2.0） 進(jìn)行基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析（PCoA） 并將分析結(jié)果可視化。使用R （v4.2.0） 繪制花瓣圖，分析不同處理組中重疊和唯一的OTUs，說明堆肥過程中不同處理之間細(xì)菌多樣性的變化。使用R vegan 軟件包進(jìn)行單因素排列方差分析 （PERMANOVA），以評(píng)估試驗(yàn)處理對(duì)細(xì)菌群落的影響。

所有測(cè)定均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均值采用 95% 置信水平下最小顯著性差異（least significant difference，LSD） 檢驗(yàn)評(píng)估處理間的差異。如果Plt;0.05，差異顯著，反之則認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用冗余分析（RDA） 方法，探討環(huán)境因素與細(xì)菌群落之間的關(guān)系。采用單因素方差分析（ANOVA） 檢驗(yàn)，評(píng)估樣本間多樣性指數(shù)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Plt;0.05 時(shí)被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌劑對(duì)堆肥溫度、pH、含水率和總有機(jī)碳含量的影響

由圖1 可知，CK、T2、T3 處理的初始溫度分別為33.1℃、34.3℃ 和34.7℃。T3 處理升溫速度最快，在堆肥第3 天就達(dá)到47.8℃，此時(shí)CK 和T2 處理溫度分別為41.3℃ 和36.9℃。此后堆肥的溫度上升緩慢，在堆肥第17 天，T3 處理首先進(jìn)入高溫期（gt;50℃），比CK 處理提前5 天，T2 處理堆體溫度始終未達(dá)到50℃。T3 處理在高溫期保持了16 天，CK處理組僅保持10 天。

堆肥的初始pH 為7.64，各處理組在堆肥前20 天變化幅度較大，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在堆肥前8 天pH 升高至8.06～8.30，一般認(rèn)為是堆肥初期微生物活性迅速升高，氨化作用造成蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)不斷被分解所至[1]。之后pH 逐漸降低至7.42～7.56。堆肥20 天后3 個(gè)處理pH 趨于穩(wěn)定，至堆肥結(jié)束時(shí)，3 個(gè)處理堆肥的pH 處于7.37～7.62，符合國(guó)家有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)要求[13]。

含水率影響著堆肥的氣體交換和微生物的代謝活性。在堆肥進(jìn)程中，各處理組的含水率呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，至堆肥結(jié)束時(shí)，T 3 處理的含水率最低，為41.8%，CK 和T2 處理分別為48.5% 和47.3%。表明復(fù)合菌劑接種實(shí)現(xiàn)的高溫堆肥促進(jìn)了堆肥含水率的下降，水分的喪失可能是堆肥升溫造成的水分蒸發(fā)以及微生物代謝繁殖的消耗所致[14]。

T3 處理的總有機(jī)碳在發(fā)酵前7 天有明顯的下降，繼而下降緩慢趨于穩(wěn)定，在堆肥結(jié)束時(shí)總有機(jī)碳略有回升，達(dá)到24.3%。T2 和CK 處理在堆肥7 天后才開始有明顯的下降，堆肥20 天后總有機(jī)碳值較為穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)CK 與T2 處理總有機(jī)碳分別為25.7% 和25.4%。T3 處理最終總有機(jī)碳含量最低，說明接種自制復(fù)合菌劑促進(jìn)了總有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化。

2.2 復(fù)合菌劑對(duì)堆肥氮素轉(zhuǎn)化的影響

如圖2 所示，各處理組的全氮隨著堆肥進(jìn)程總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。堆肥初期，CK、T2 處理全氮在初期略有上升后出現(xiàn)下降，而T3 處理不斷上升；高溫期后至堆肥50 天，CK、T2 處理全氮增加而T3 處理明顯降低； 堆肥50 天之后，各處理全氮有明顯的回升，在堆肥結(jié)束時(shí)，CK、T2、T3 處理的全氮分別為21.4、23.1 和19.7 g/kg。總的看來，堆肥前半個(gè)月為氮素?fù)p失較快的時(shí)期，后期全氮的上升是由于有機(jī)物的降解而產(chǎn)生的濃度效應(yīng)，即有機(jī)物的降解速率大于全氮的損失速率[15]。

各組NH4+-N 變化基本是堆肥前50 天為升高階段，之后為降低階段。T2 處理在堆肥第7 天達(dá)到峰值230 mg/kg，CK 和T3 處理則均在堆肥14 天達(dá)到峰值，分別為209 和233 mg/kg，差異顯著（Plt;0.05）。堆肥結(jié)束時(shí)，CK 和T2 處理NH4+-N 出現(xiàn)較明顯的回升，T3 處理NH4+-N 含量最低，為45.6 mg/kg，分別為CK 組和T2 組的29.4% 和31.6%，與CK 和T2 處理差異極顯著（Plt;0.0001）。CK 與T2 處理分別為155.1 和144.1 mg/kg，無明顯差異（Pgt;0.05）。NH4+-N含量的降低可以作為良好堆肥進(jìn)程和腐熟過程的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)[16]。

NO2?-N 是硝化作用的中間產(chǎn)物，在堆肥初始階段低于500 mg/kg，處在較低水平，在堆肥7 天后出現(xiàn)明顯升高，NH4+ -N 被微生物的硝化作用轉(zhuǎn)化為NO2?-N，CK 組NO2?-N 含量在堆肥14 天達(dá)到峰值1102 mg/kg，T2 和T3 處理在堆肥20 天達(dá)到峰值，分別為863 和830 mg/kg。隨著堆肥溫度的快速升高，抑制了硝化細(xì)菌的活性，堆肥20 天后各處理NO2?-N 含量均明顯降低，隨后在腐熟期的堆肥50 天開始再次降低，CK、T2、T3 處理最終NO2?-N 含量分別為218、283 和344 mg/kg，T3 處理NO2?-N 含量顯著高于CK 處理（Plt;0.05）。

3 個(gè)處理的NO3?-N 含量均隨著堆肥進(jìn)程不斷上升，并在高溫期達(dá)到平穩(wěn)，T3 處理在堆肥25 天達(dá)到峰值1280 mg/kg，而后處于平穩(wěn)下降狀態(tài)[17]，堆肥結(jié)束時(shí)保持在1223 mg/kg。與之相反，CK 和T2 處理因?yàn)槎逊蕼囟缺萒3 處理低，且其底物NH4+ -N 充足，仍有較多的NH4+-N 被轉(zhuǎn)化為NO2?-N 后繼續(xù)轉(zhuǎn)化為NO3?-N，因此CK 和T2 處理NO3?-N 含量在堆肥25 天后仍不斷增加，并在堆肥50 天才達(dá)到峰值，分別為1248 和1415 mg/kg，之后，CK 和T2 處理的NO3?-N 含量急劇下降，在堆肥結(jié)束時(shí)分別降到291 和438 mg/kg，遠(yuǎn)低于T3 處理。這也可能與CK 和T2 處理在堆肥50 天后的有機(jī)碳含量高有關(guān)[18]。

2.3 復(fù)合菌劑對(duì)堆肥腐熟度的影響

一般情況下堆肥過程中合適的C/N 在20∶1～30∶1[19]，低C/N 會(huì)釋放更多的可溶性鹽[20]，導(dǎo)致堆肥電導(dǎo)率 （EC） 值的增加。堆肥C/N 變化如圖3 所示，由于本試驗(yàn)原料初始C/N 較低，堆肥全過程各組C/N 均低于20，且隨著堆肥進(jìn)程不斷降低。在結(jié)束時(shí)，CK、T2、T3 處理的C/N 分別為11.98、11.00和12.39，均小于25，符合堆肥腐熟度的要求[21]。堆肥過程各處理組的EC 值總體呈上升趨勢(shì)，至堆肥結(jié)束時(shí)，CK、T2、T3 處理的EC 值分別為3.61 、3.69和3.75 ms/cm，均低于4.00 ms/cm。

對(duì)60 天的樣品進(jìn)行種子發(fā)芽指數(shù)GI 的測(cè)定，與純水對(duì)照相比，CK、T2、T3 處理GI 分別達(dá)到110.1%、92.7% 和129.2%，均達(dá)到有機(jī)肥腐熟標(biāo)準(zhǔn)（gt;70%），以接種復(fù)合菌劑的T3 處理最高（圖4）。

2.4 堆肥微生物多樣性分析

2.4.1 多樣性分析 由圖5 可知，接種復(fù)合菌劑后，T3 處理樣品在高溫和腐熟階段，讀取到的序列Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均高于CK 和T2 處理。在堆肥過程中，T2 和T3 處理的α-多樣性變化趨勢(shì)與CK 處理有所不同，反映了接種外源微生物對(duì)發(fā)酵過程有影響。稀釋曲線 （rarefaction curve） 是從樣本中對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU 的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。隨著測(cè)序樣本的增加，各處理組的稀釋曲線均逐漸趨于平緩，說明樣品中的大部分16S rRNA 基因已經(jīng)被檢測(cè)，測(cè)序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠。等級(jí)豐度曲線（rank abundance curve） 用于同時(shí)解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長(zhǎng)度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。T3 和CK 處理在高溫階段的樣品物種組成最為豐富，也更加均勻；同時(shí)腐熟期的T3 處理在物種組成上要比CK 和T2 處理更加豐富和均勻。

基于Bray-Curtis 距離矩陣的PCoA 分析結(jié)果（圖6） 表明，3 個(gè)處理的細(xì)菌群落在堆肥初始階段沒有顯著差異，進(jìn)入高溫階段后差異開始增大，在堆肥的腐熟階段差異達(dá)到最大。其中，T3 處理在高溫階段和腐熟階段的差異比其他處理在這兩個(gè)階段的差異要小，有可能是T3 處理堆肥腐熟期高溫期早期微生物群落組成已開始趨于穩(wěn)定。綜上所述，加入復(fù)合菌劑使堆肥中細(xì)菌群落的演替發(fā)生了區(qū)別于自然發(fā)酵組CK 和市售商品菌劑組T2 的顯著變化。

如圖7 所示，CK 處理的特異OTU 數(shù)量從堆肥開始時(shí)的449 個(gè)，增加到結(jié)束時(shí)的542；T2 處理從4 1 2 個(gè)增加到6 6 7 個(gè)，T 3 處理從4 0 8 個(gè)增加到739 個(gè)。T3 處理特異OTU 數(shù)量的增加明顯高于CK 和T2 處理（Plt;0.05）。在堆肥開始時(shí)，3 個(gè)處理之間的特異OTU 數(shù)量沒有明顯差異。在嗜熱和成熟階段，T3 處理的特定OTU 數(shù)量明顯高于CK 和T2 處理（Plt;0.05），表明接種自制復(fù)合菌劑增加了堆肥過程中的細(xì)菌豐度和特定細(xì)菌多樣性。

2.4.2 添加復(fù)合菌劑對(duì)堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

圖8 顯示，3 個(gè)處理堆肥各時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌種均為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes） 和擬桿菌門（Bacteroidetes）。變形菌門隨著堆肥進(jìn)程不斷減少，但在整個(gè)堆肥過程中的相對(duì)豐度均最高。擬桿菌門相對(duì)豐度隨著堆肥進(jìn)程升高。3 個(gè)處理組在堆肥初始階段群落結(jié)構(gòu)相似，隨著堆肥進(jìn)程逐漸產(chǎn)生差異，差異主要集中在厚壁菌門、芽單胞菌屬（Gemmatimonadota），放線菌門（Actinobacteriota） 和綠彎菌門（Chloroflexi）。堆肥初始階段T3、CK、T2 處理厚壁菌門豐度分別為8.2%、13.9%、9.8%；堆肥結(jié)束時(shí)T3 處理厚壁菌門豐度增加到18.2%，而CK 和T2 處理明顯降低到2.6%、7.0%。厚壁菌門是堆肥中碳水化合物水解的關(guān)鍵細(xì)菌，可以在高溫下生長(zhǎng)。復(fù)合菌劑中的蕈狀芽孢桿菌（Bacillusmycoides） 屬于厚壁菌門，因而T3 處理高溫期堆肥溫度較高，高溫階段持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，厚壁菌門相對(duì)豐度的增加可能與加入的蕈狀芽孢桿菌（Bacillusmycoides） 有關(guān)。鏈霉菌屬（Streptomyces sp.） 屬于放線菌門（Actinobacteriota），T3 組該菌屬相對(duì)豐度的升高可能與復(fù)合菌劑中加入了鏈霉菌屬有關(guān)。T2、CK 處理在高溫階段芽單胞菌屬（Gemmatimonadota）相對(duì)豐度分別達(dá)到12.2% 和23.2%，而T3 處理僅有8.6%，芽單胞菌屬與反硝化作用有關(guān)，其豐度的差異可以部分解釋各處理組在N 素轉(zhuǎn)化上的差異。綠彎菌門（Chloroflexi） 是一種兼性厭氧反硝化菌[22]，厭氧環(huán)境可增強(qiáng)其反硝化作用，T2、CK 處理中較高的綠彎菌門相對(duì)豐度部分解釋了T2 和CK 處理在堆肥結(jié)束時(shí)樣品氨態(tài)氮升高、硝態(tài)氮降低的現(xiàn)象。

各處理組在屬水平的細(xì)菌群落組成如圖9 所示。嗜冷桿菌（Psychrobacter） 是一種特化或兼性細(xì)菌，適宜生長(zhǎng)溫度在15℃ 以下，僅在堆肥初始階段大量存在。嗜冷桿菌與unclassified Longimicrobiaceae 在以往研究報(bào)道中并不常見，推測(cè)為本地土著菌屬。添加商品菌使unclassified Longimicrobiaceae 的相對(duì)豐度在高溫期達(dá)到22.8%，高于同時(shí)期的CK 處理（12.0%） 和T3 處理（8.4%）。norank_f_norank_o_SBR1031 屬于厭氧菌科屬[23]，與水解酸化有關(guān)，具有難降解有機(jī)質(zhì)（ROM） 降解能力[24?25]。T2 和CK 處理腐熟階段norank_f_norank_o_SBR1031 相對(duì)豐度分別為14.0% 和13.5%，顯著高于T3 處理的7.7%，可能是由于與CK 和T2 處理相比，T3 處理中TOC 的降解較為充分，缺少norank_f_norank_o_SBR1031 的代謝底物。

2.5 環(huán)境因素關(guān)聯(lián)性分析

如圖10 所示，第一軸解釋了種群–環(huán)境關(guān)系中37.38% 的微生物種群豐度變化量，第一和第二軸共同解釋了57.71% 的微生物種群豐度變化量。環(huán)境因素中含水率、pH 和有機(jī)質(zhì)降解率（OM-loss） 都是影響細(xì)菌群落變化的顯著因素（Plt;0.05），且pH 的影響最顯著。環(huán)境因子pH 和OM-loss 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測(cè)與堆肥過程中有機(jī)酸和銨離子的積累有關(guān)。同時(shí)pH 也被認(rèn)為是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一，由于pH 與嗜冷桿菌（Psychrobacter） 和假單胞菌（Pseudomonas） 的豐度呈顯著正相關(guān)，pH 可能是造成堆肥初始階段各處理組中這些細(xì)菌豐度較高的主要原因。藤黃單胞菌（Luteimonas） 和大腸桿菌志賀氏菌屬（Escherichia_Shigella） 的豐度與NO3?-N的含量和溫度這兩個(gè)環(huán)境因子呈正相關(guān)，與含水率、pH 和NH4+-N 呈負(fù)相關(guān)，且與CKB、T2B、T3B樣本點(diǎn)距離較近，意味著它們?cè)诙逊实母邷仄谪S度較高，且有可能與反硝化作用有關(guān)。unclassified_Longimicrobiaceae 與OM-loss 顯著正相關(guān)，說明了堆肥的有機(jī)質(zhì)降解在很大程度上與其代謝繁殖有關(guān)。

3 結(jié)論

在青藏地區(qū)羊糞尾菜混合堆肥中添加自行篩選制備的復(fù)合菌劑，加快了堆肥進(jìn)入高溫期，并延長(zhǎng)了高溫停留時(shí)間；復(fù)合菌劑中的纖維素降解菌促進(jìn)了羊糞、尾菜中的有機(jī)物降解，減弱了腐熟階段的反硝化作用，提高了堆肥中氮素含量，GI 值達(dá)到129.2%，高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求（70%）。

復(fù)合菌劑的添加提高了堆肥中微生物群落的相對(duì)豐度和多樣性，其中的鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）提高了放線菌門（Actinobacteriota） 水平，有助于纖維素的降解；嗜冷桿菌（Psychrobacter） 在堆肥初始階段有助于堆肥發(fā)酵過程的啟動(dòng)。較低的綠彎菌門（Chloroflexi） 在一定程度上減少了銨態(tài)氮的反硝化損失。堆肥有機(jī)質(zhì)降解與unclassified_Longimicrobiaceae豐度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，說明了堆肥有機(jī)質(zhì)降解在很大程度上與unclassified_Longimicrobiaceae 代謝繁殖有關(guān)。