從網(wǎng)絡藥理學分析馬齒莧-地錦草藥對配伍治療潰瘍性結腸炎作用機制

*基金項目：安徽省教育廳高校自然科學研究重點項目（KJ2020A0445）

第一作者簡介：李晶晶（1997-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治脾胃病。

△通信作者：王睿，E-mail：dsf221@163.com

摘要：目的" 運用網(wǎng)絡藥理學技術探討馬齒莧-地錦草藥對治療潰瘍性結腸炎（UC）作用機制。方法" 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取馬齒莧-地錦草的有效活性成分，利用Uniprot3.7.2數(shù)據(jù)庫預測活性成分作用靶點，通過Gene-Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取疾病基因，將藥物與疾病基因取交集后利用STRING數(shù)據(jù)庫研究二者相關性，并根據(jù)結果分析其潛在作用機制。結果" 經(jīng)過篩選得到目標藥對關鍵靶點蛋白61個和分子信號通路169條，基因本體（GO）功能富集分析顯示主要有炎癥反應、凋亡過程的負調(diào)控、脂多糖的細胞反應等生物過程；京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示馬齒莧-地錦草治療UC主要通過腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、核因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路等發(fā)揮作用。結論" 馬齒莧-地錦草藥對治療UC具有多靶點、通路復雜、層次分明的特點，馬齒莧-地錦草潛在作用機制為日后臨床治療UC提供理論依據(jù)，并拓展了臨床運用中醫(yī)藥治療UC的思路。

關鍵詞：馬齒莧-地錦草藥對；網(wǎng)絡藥理學；潰瘍性結腸炎；信號通路；作用機制

中圖分類號：R516.1""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1007-2349（2024）04-0058-08

Analysis of the Action Mechanism of Portulacae-Quinquefolia Pairs in theTreatment of Ulcerative Colitis by Network Pharmacology

LI Jing-jing1， WANG Rui2， CHA An-sheng2， LI Yi-fang3， WANG Fang1， HU Zi-zhao1

（1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China; 2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Tradition Chinese Medicine， Hefei 230032， China; 3. School of Nursing， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230022， China）

【Abstract】Objective： To explore the action mechanism of Portulaca-Quinquefolia pairs in the treatment of ulcerative colitis （UC） by network pharmacology. Methods： The active ingredients of Portulaca and Quinquefolia were obtained through TCMSP database， the target of active ingredients was predicted by using Uniprot3.7.2 database， and disease genes were obtained through Gene-Cards database and OMIM database. After the intersection of herbs and disease genes， the correlation between them was studied by using STRING database. The potential mechanism of action was analyzed according to the results. Results： After screening， 61 key target proteins and 169 molecular signaling pathways were obtained. Gene ontology （GO） functional enrichment analysis showed that the main biological processes were inflammation， negative regulation of apoptosis and cell reaction of lipopolysaccharide. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis showed that Portulaca-Quinquefolia pairs played its role in the UC treatment mainly through tumor necrosis factor （TNF） signaling pathway， nuclear factor κB signaling pathway， toll-like receptor signaling pathway and NOD-like receptor signaling pathway. Conclusion： Portulaca-Quinquefolia pairs have the characteristics of multiple targets， complex pathways and distinct layers in the treatment of UC patients. The potential action mechanism of Portulaca-Quinquefolia pairs provides a theoretical basis for the future clinical treatment of UC， and expands the clinical application of TCM in the treatment of UC.

【Key words】Portulaca-Quinquefolia Pairs; Network Pharmacology; Ulcerative Colitis; Signal Pathway; Action Mechanism

潰瘍性結腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸病，在不同程度上引起結、直腸黏膜及黏膜下層的連續(xù)性、融合性炎癥反應。其特點是遷延難愈且反復發(fā)作，隨著病程延長，UC患者結腸癌風險隨之增加［1］。UC具體發(fā)病機制尚未明確，但現(xiàn)代研究已證實，環(huán)境、基因、腸道微生物及自身免疫等因素參與UC的發(fā)病過程［2］。目前，現(xiàn)代醫(yī)學治療UC主要采取對癥治療，雖短時間內(nèi)緩解率高，但隨著治療方法的臨床研究不斷加深，越來越多的問題被提出如生物制劑治療周期的長度與限度、預后效果及不同藥物的適用情況和不良反應等仍有待解決［3］。

中醫(yī)將UC歸屬于“久痢”“腸澼”“泄瀉”“便血”等范疇。其病機以脾虛為本，濕熱瘀毒蘊結腸道為標，治療上應遵循“發(fā)時指標，平時治本”的原則，以健脾化濕，活血化瘀為基本大法。地馬煎劑為安徽省中醫(yī)院治療UC院內(nèi)方，具有健脾化濕、活血解毒之效。相關研究已證實地馬煎劑灌腸治療UC 可有效對抗氧化應激，改善炎癥反應［4］。其中馬齒莧、地錦草是方中主要藥對，中醫(yī)認為二者均可清熱解毒，涼血止血止痢。相關研究表明馬齒莧、地錦草具有抗炎、抗氧化，免疫調(diào)節(jié)的作用，促進損傷修復，改善患者結腸黏膜微循環(huán)，減輕UC癥狀［5-7］。二者配伍治療UC活動期效果顯著，但關于馬齒莧-地錦草配伍治療UC具體作用機制尚不明確。因此，本研究希望通過網(wǎng)絡藥理學進一步探討分析馬齒莧-地錦草藥對治療UC的作用機制，為臨床用藥和研究提供參考依據(jù)。

1" 資料與方法

1.1" 馬齒莧-地錦草藥對的成分信息篩選及匯總" 利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology And Analysis Plat-form，TCMSP），收集馬齒莧、地錦草主要化學成分，設定口服生物利用度（OB≥30％）、類藥性（DL≥0.18），篩選藥對符合條件的活性成分與相關靶點信息。

1.2" 活性成分作用靶點的獲取及收集" 將整理出的“馬齒莧-地錦草”藥物活性成分作用靶點信息，輸入Uniprot數(shù)據(jù)庫，設定來源物種為“human”，整理出相關基因數(shù)據(jù)，獲得活性成分作用靶點。然后利用Cytoscape 3.9.1 軟件將活性成分與靶點進行可視化分析。

1.3" 潰瘍性結腸炎關鍵靶點的收集" 運用Gene-Cards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取UC相關疾病靶點，然后將兩個數(shù)據(jù)庫所得靶點數(shù)據(jù)去重整合。

1.4" “化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡構建" 利用Venny 2.1.0軟件獲取藥物與疾病分別對應的靶點的重合部分，即可得出藥物治療UC的關鍵靶點數(shù)據(jù)。

1.5" 構建關鍵靶點PPI網(wǎng)絡" 利用STRING在線數(shù)據(jù)庫平臺，搜索藥對得到其治療UC的關鍵靶點蛋白互作（PPI）關系，然后將所得數(shù)據(jù)導入Cytoscape中進行可視化分析，并繪制與之相應的PPI網(wǎng)絡圖。

1.6" 關鍵靶點生物過程及通路分析" 通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，從中獲取關鍵靶點的生物學信息，并分析其作用機制。

2" 結果

2.1" 馬齒莧藥對-地錦草的活性成分信息" 通過搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到馬齒莧、地錦草化學成分分別為54個、38個。設定OB≥30%且DL≥0.18，篩選出馬齒莧、地錦草的潛在有效活性成分10個、12個，去重后共20個。見表1。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取馬齒莧、地錦草的活性成分作用靶點分別為394個、255個，將活性成分的作用靶點導入Uniprot，篩選出符合人類相關并已證實的基因，經(jīng)過去重后共得到330個靶點對應基因。

2.2" “活性成分-靶點” 網(wǎng)絡構建分析" 將馬齒莧、地錦草的有效活性成分進行編號，發(fā)現(xiàn)二者共同有效活性成分兩個，即圖2中所示 A1、A2，分別代表kaempferol、quercetin。將19個二者有效活性成分及365個成分靶點對應基因導入Cytoscape 3.9.1軟件構建網(wǎng)絡及可視化分析，見圖1。

2.3" 潰瘍性結腸炎的關鍵靶點篩選" 通過Gene-Card平臺收集疾病相關靶點5139個，篩選符合Relevance score≥7.38的靶點323個；利用OMIM數(shù)據(jù)庫收集UC相關靶點基因531個，將兩個數(shù)據(jù)庫結果去重，最終得到784個。

2.4" “藥物靶點-疾病靶點” 的網(wǎng)絡構建及可視化分析" 利用Venny 2.1.0軟件將相對應的365個藥物靶點與784個疾病靶點取交集后得到61個共同靶點基因。見圖2。關鍵靶點具體為：PTGS1、PTGS2、RELA、CCND1、EGF、PPARG、TNFRSF1A、PLA2G4A、PTEN、SELP、TNFRSF1B、AKT1、VEGFA、BCL2、MMP2、CASP8、MMP1、HMOX1、CYP3A4、CTNNB1、F3、PIK3CG、BAX、NOS2、IKBKB、TNF、XDH、STAT1、ICAM1、SELE、VCAM1、GSTP1、EGFR、CDKN1A、MMP9、IL10、IL6、TP53、ERBB2、IL2、IFNG、IL4、CD40LG、MET、MMP3、IL1B、CCL2、CXCL8、DUOX2、SERPINE1、IL1A、MPO、NCF1、CHEK2、CLDN4、CRP、CXCL10、SPP1、IGF2、ALB、F2。

2.5" “馬齒莧-地錦草”治療UC的PPI網(wǎng)絡分析" 利用STRING數(shù)據(jù)庫平臺得到上述61個藥物-疾病靶點蛋白互作圖。見圖3。將置信度設置為大于0.4，然后將得到的61個關鍵靶點蛋白導入Cytoscape 3.9.1軟件行可視化分析，并繪制網(wǎng)絡圖。見圖4。其中排名前10位的關鍵靶點為：TNF、AKT1、IL6、PTGS2、VEGFA、ALB、IL1B、CCL2、TP53、CXCL8。

2.6" 關鍵靶點的GO富集分析" 對關鍵靶點基因在DAVID網(wǎng)站中進行GO富集分析共獲得559個。其中生物過程463個、細胞組分38個、分子功能58個，分別選取前10個。結果見圖5。主要涉及炎癥反應、凋亡過程的負調(diào)控、脂多糖的細胞反應、基因表達的正調(diào)控、蛋白磷酸化的正調(diào)控、對藥物的反應、細胞增殖的正向調(diào)節(jié)、凋亡過程的正向調(diào)控、轉錄的正調(diào)控，DNA模板正調(diào)控等。

圖5" 關鍵靶點富集分析

2.7" KEGG通路分析" 將關鍵靶點基因在DAVID網(wǎng)站中行KEGG通路分析。得到Plt;0.05靶點關聯(lián)的通路有168條，其中主要發(fā)揮作用的通路有：癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、核因子κB信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、炎癥性腸病信號通路等。如圖6。

3" 討論

現(xiàn)代研究表明中草藥以多成分多靶點共同發(fā)揮作用、不良反應少，可作為補充和替代療法治療UC［8-9］。本研究通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)篩選，得到馬齒莧-地錦草藥對潛在活性成分共22個，共同活性成分為槲皮素和山奈酚，二者均具有抗炎、抗氧化等生物活性。其中，山奈酚可有效減少機體炎性因子的合成與釋放，增強抗炎因子的轉錄活性，維持腸黏膜機械屏障的完整［10-11］。槲皮素是一種與山奈酚相關的黃烷醇，其發(fā)揮作用改善結腸炎癥損傷主要藥理作用表現(xiàn)在抗炎，抗氧化和止血［12］。

馬齒莧-地錦草的藥物靶點與疾病靶點去重整合后得到61個靶點基因。這些關鍵靶點在UC治療過程中的作用如下：IL-6與TNF均可誘導免疫細胞活化參與調(diào)控腸道局部炎癥反應。TNF具有抗感染、調(diào)節(jié)免疫、促進細胞增殖分化等積極作用，但TNF水平顯著升高時，可與多種細胞因子共同發(fā)揮作用，誘導機體炎癥介質(zhì)的釋放，引起炎癥反應［13］。相關研究表明，IL-6過度表達可誘導局部炎性病變［14］。由此得出，UC病變的嚴重程度與TNF與IL-6表達水平呈正相關。此外，研究發(fā)現(xiàn)IL-6可能與結腸癌發(fā)病有關，IL-6的濃度可反映腫瘤大小、是否轉移及生存率［15］。研究表明受巨噬細胞中的炎癥介質(zhì)刺激，PTGS2可動態(tài)調(diào)節(jié)急性期炎癥的發(fā)生與發(fā)展，與炎癥調(diào)控、細胞凋亡及組織損傷有關［16］。由此得出PTGS2、IL-6及TNF等炎癥反應相關的基因，是通過抗炎作用和免疫調(diào)控來達到治療UC的目的。

隨后對61個關鍵靶點基因進行KEGG通路分析得到168條通路。其中NOD樣受體信號通路是免疫細胞識別病原體，主要通過介導NF-κB通路、MAPK通路和自噬通路參與抗菌免疫應答。此外，NOD樣受體還有獨特的與適應性免疫應答的連接通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起作用［17-18］。Toll樣受體信號通路失調(diào)可誘導慢性炎癥及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，其異常激活又可導致NF-κB信號通路的激活和TNF、IL-6等炎癥介質(zhì)的過度表達，從而誘發(fā)炎癥反應的發(fā)生［19］。研究發(fā)現(xiàn)通過NF-κB信號通路發(fā)揮對UC炎癥修復，是通過抑制其磷酸化和乙酰化［20］。綜上，馬齒莧-地錦草藥對改善UC炎癥損傷主要是通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)。

參考文獻：

［1］劉維新，張紳，任益，等.潰瘍性結腸炎及潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌小鼠模型中血管生成因子的表達及其與血管新生的關系［J］.中國醫(yī)科大學學報，2013，42（3）：231-234.

［2］Piovani D，Danese S，Peyrin-Biroulet L，et al.Environmental Risk Factors for Inflammatory Bowel Diseases：An Umbrella Review of Meta-analyses.Gastroenterology.2019 Sep；157（3）：647-659.

［3］林軒永.潰瘍性結腸炎治療現(xiàn)狀及進展［J］.臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2020，7（12）：191-193.

［4］李一芳，王睿，查安生，等.地馬煎劑對腸道濕熱型潰瘍性結腸炎8-異前列腺素F2α的調(diào)控作用研究［J］.陜西中醫(yī)藥大學學報，2019，42（4）：86-90.

［5］王婷婷，文今福，金松南.地錦草的化學成分及藥理作用研究進展［J］.泰山醫(yī)學院學報，2012，33（8）：629-632.

［6］常思橋.地錦草多糖的提取分離、體外發(fā)酵特性及其對潰瘍性結腸炎的保護作用研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2021.

［7］張彩虹，鐘浩明.地錦草片治療潰瘍性結腸炎效果觀察［J］.海峽藥學，2007（10）：100-101.

［8］Cao F，Liu J，Sha BX，et al.Natural Products：Experimental Efficient Agents for Inflammatory Bowel Disease Therapy.Curr Pharm Des，2019，25（46）：4893-4913.

［9］Lin Z，Wu H，F(xiàn)u Y，et al.Application of Herbaceous Medications for Inflammatory Bowel Disease as a Complementary and Alternative Therapy.Inflamm Bowel Dis，2019，14；25（12）：1886-1895.

［10］Al-Brakati A，Albarakati AJA，Lokman MS，et al.Possible Role of Kaempferol in Reversing Oxidative Damage，Inflammation，and Apoptosis-Mediated Cortical Injury Following Cadmium Exposure.Neurotox Res，2021，39（2）：198-209.

［11］Yang L，Li H，Yang M，et al.Exploration in the Mechanism of Kaempferol for the Treatment of Gastric Cancer Based on Network Pharmacology［J］.Biomed Res Int，2020，（21）：5891016.

［12］董麗華.叉分蓼抗?jié)冃越Y腸炎的物質(zhì)基礎與作用機制研究［D］.南昌：江西中醫(yī)藥大學，2019.

［13］毛靖偉，唐海英，王英德.MMP-1、TIMP-1和TNF-α在潰瘍性結腸炎中表達的意義［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（8）：738-743.

［14］辛群，孫擎，葛現(xiàn)才，等.IL-6和IL-23在潰瘍性結腸炎患者腸粘膜中的表達及意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2015，15（8）：1471-1473.

［15］王倩，范文濤.馬齒莧多糖對潰瘍性結腸炎相關性結腸癌IL-6/STAT3信號通路的影響［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8（10）：1256-1258.

［16］Hellmann J，Tang Y，Zhang MJ，et al.Atf3 negatively regulates Ptgs2/Cox2 expression during acute inflammation. Prostaglandins Other Lipid Mediat，2015：116-117.

［17］林巧衛(wèi)，張思，陸維祺.NOD樣受體介導的信號轉導通路及其與腫瘤關系的研究進展［J］.中國癌癥雜志，2019，29（3）：223-228.

［18］Yamamoto-Furusho JK，Santiago-Hernández JJ，Pérez-Hernández N，et al.Interleukin 1 β（IL-1B）and IL-1 antagonist receptor（IL-1RN）gene polymorphisms are associated with the genetic susceptibility and steroid dependence in patients with ulcerative colitis［J］.J Clin Gastroenterol，2011，45（6）：531-5.

［19］劉恒辰，張新宇.Toll樣受體信號通路作為結直腸癌潛在治療靶點的研究進展［J］.實用腫瘤學雜志，2019，33（2）：188-192.

［20］李玎玎，劉朝霞.穴位埋線通過SIRT1/NF-κB信號通路對潰瘍性結腸炎腸道屏障功能的影響［J］.上海針灸雜志，2023，42（2）：182-189.

（收稿日期：2023-05-17）