基于脊髓背角自噬與凋亡探討推拿對神經病理性疼痛大鼠的作用機制

陳玲女,盧棟明,王天翊,鄭玉嬌,梁英業,楊 鵬,唐宏亮,龐 軍

(1. 廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001;2. 廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023;3. 防城港市中醫醫院,廣西 防城港 538000)

神經病理性疼痛是慢性疼痛常見原因之一,表現為自發性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛等。據統計,2020年全球神經病理性疼痛患病率高達10%[1]。該病發病率高,病理機制復雜,且常合并失眠、抑郁和焦慮等情感障礙,嚴重影響患者的健康[2-3]。神經損傷和炎癥是神經病理性疼痛多種生理和病理過程的基礎,會導致神經元興奮性增強,誘發疼痛形成[4]。炎癥在脊髓背角激活是神經病理性疼痛形成的關鍵,如何控制炎癥對神經病理性疼痛的影響是當下研究的熱點。近年研究表明,脊髓背角自噬與凋亡均參與了神經病理性疼痛的發生發展,并與炎癥密切相關,促進脊髓背角細胞自噬,可以減少促炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的釋放,并能抑制細胞凋亡[5];促進抗凋亡因子Bcl-2的表達可降低Caspase-3水平,在抑制凋亡發生的同時伴隨著TNF-α的降低[6-7]。由此可見,促進自噬或抑制凋亡均可減輕炎癥反應,緩解神經病理性疼痛,但二者之間存在相互拮抗、相互協同作用的關系[8],如何正確掌控二者的作用機制,明確二者在神經病理性疼痛中的內在聯系,有助于深入了解神經病理性疼痛的發病機制和突破治療上的困境。推拿治療疼痛由來已久,可有效緩解疼痛,且無不良反應[9-10]。課題組前期研究表明,推拿能通過激活自噬,促進IL-1β的清除,減輕疼痛[11];還可以通過抑制大鼠神經元凋亡,緩解疼痛的發展[12]。本研究旨在通過觀察推拿對神經病理性疼痛大鼠脊髓背角自噬相關因子與凋亡相關因子表達的影響,進一步明確推拿對神經病理性疼痛自噬與凋亡的協同調控作用,明確推拿發揮抑炎鎮痛作用的可能靶點。

1 實驗材料與方法

1.1動物 健康SPF級雌性SD大鼠30只,體重250～300 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004,使用許可證號:SYXK(桂)2019-0001。動物飼養于SPF級別動物房,室內安靜整潔,溫度、光照和通風恒定適宜,墊料飼料飲用水正常供應,平均每4 d更換墊料1次,每天更換飲用水及飼料1次,適應性喂養7 d。本實驗經廣西中醫藥大學倫理委員會審核并批準(倫理號:DW20230302-021)。

1.2試劑與儀器 兔抗大鼠Beclin1、LC3、Bcl-2、Caspase-3和β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),TNF-α ELISA試劑盒(廣西威諾科技有限公司),反轉錄試劑盒、SYB RGreen PCR熒光試劑(南京諾維贊生物科技有限公司)。按摩推拿手法模擬儀(中華人民共和國發明專利號:200710187403．1),von-Frey纖維絲(美國IITC公司),電泳儀(美國伯樂公司)。

1.3實驗方法 大鼠適應性喂養7 d后隨機分為正常組、假手術組、模型組、推拿組、假推拿組,每組6只。模型組、推拿組和假推拿組參照文獻[13]方法建立神經病理性疼痛模型:大鼠禁食12 h后按體重給予3%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后固定,備皮消毒,沿著脊柱方向切開皮膚,分離筋膜肌肉,鉗斷L4～6脊椎左側的橫突,暴露L5脊神經,用可吸收性縫合線結扎。假手術組僅暴露L5脊神經不結扎,正常組不進行手術。術后第1天開始,推拿組用布袋束縛大鼠后,采用按摩推拿手法模擬儀(設置刺激強度為4N),以點、撥、揉方法依次刺激膽經上環跳、陽陵泉、懸鐘穴共18 min(每側9 min),1次/d,連續干預14 d;假推拿組用布袋束縛大鼠后,輕撫其后肢18 min(每側9 min),1次/d,連續干預14 d;正常組、假手術組、模型組大鼠不進行干預,觀察14 d。

1.4檢測指標及方法

1.4.1機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應潛伏期 術前及術后第1,3,7,14 d干預后,用von-Frey纖維絲按刺激強度由小至大垂直刺激大鼠左后足底心,每個強度重復刺激5次,間隔時間為3 s,5次中出現3次及以上的縮足或舔爪反應記為陽性,實驗重復3次,取平均值作為最終的機械性刺激縮足閾值。于機械性刺激縮足閾值測定后適應1 h測定熱痛縮足反應潛伏期,熱板痛覺測試儀設為55 ℃,將大鼠放置于測試儀的封閉且透明玻璃盒內并啟動計時器,當大鼠出現快速抬足、頻繁舔足等現象時停止計時并做記錄,每只共測定3次,每次間隔2 min,取平均值作為最終的熱痛縮足反應潛伏期。

1.4.2血清TNF-α水平 術后第14天干預結束后,麻醉各組大鼠,采腹主動脈血,運用ELISA試劑盒檢測血清TNF-α水平。

1.4.3脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況 取-80 ℃保存的各組大鼠L4～6脊髓背角組織,采用Western blot技術檢測:采用BCA法蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,根據濃度用PBS稀釋液進行配平,按比例加入蛋白上樣緩沖液并充分混勻后100 ℃金屬浴10 min;將膠板、配置好的電泳液放入電泳槽,垂直向上拔出梳子,加入3 μL Marker標記物后根據測定的蛋白濃度,每孔加入30 μg蛋白質,120 V恒壓電泳,直到溴酚藍跑到凝膠底部;將切好的電泳凝膠與PVDF膜對齊放入轉膜槽中轉膜,300 mA轉60 min;室溫封閉PVDF膜15 min,用1×TBST溶液洗滌3次,每次10 min,再放入稀釋好的一抗溶液中4 ℃孵育過夜;洗滌3次后,將膜于二抗(HRP山羊抗兔IgG,1∶5 000)溶液中室溫孵育1 h;均勻滴加ECL試劑后,顯影儀掃描PVDF膜,并用Image J軟件分析條帶的光密度。參考目標蛋白條帶的光密度值和內參(β-actin)計算出每個目標蛋白的相對表達量。

1.4.4脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA表達情況 取-80 ℃保存的各組大鼠L4～6脊髓背角組織,采用RT-qPCR法檢測:提取RNA并測定濃度和純度,反轉錄成cDNA;以β-actin為內參,根據GenBank的基因序列設計引物(引物序列見表1),由捷尼斯生物科技有限公司合成并純化。PCR擴增反應的總體積為20 μL,包括2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 8.2 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL。反應條件:預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s(40個循環),溶解曲線95 ℃ 15 s、65 ℃ 1 min、97 ℃。采用2-ΔΔCT法計算Beclin1、Bcl-2 mRNA的相對表達量。

表1 目的基因引物序列

2 結 果

2.1各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應潛伏期比較 術前各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應潛伏期比較差異均無統計學意義(P均>0.05);術后第1天、第3天,模型組、推拿組、假推拿組大鼠機械性刺激縮足閾值均明顯低于同期正常組、假手術組(P均<0.05),熱痛縮足反應潛伏期均明顯短于同期正常組、假手術組(P均<0.05),模型組、推拿組、假推拿組之間機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應潛伏期比較差異均無統計學意義(P均>0.05);術后第7天、第14天,推拿組大鼠機械性刺激縮足閾值均明顯高于同期模型組和假推拿組(P均<0.05),熱痛縮足反應潛伏期均明顯長于同期模型組和假推拿組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠機械性刺激縮足閾值和熱痛縮足反應潛伏期

2.2各組大鼠血清TNF-α水平比較 模型組和假推拿組血清TNF-α水平均明顯高于正常組和假手術組(P均<0.05);推拿組血清TNF-α水平明顯低于模型組和假推拿組(P均<0.05),假推拿組與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠血清 TNF-α水平

2.3各組大鼠脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況比較 與正常組和假手術組比較,模型組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,推拿組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),假推拿組Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2 、Caspase-3蛋白相對表達量變化均不明顯(P均>0.05)。推拿組Beclin1、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯高于假推拿組(P均<0.05),Caspase-3蛋白相對表達量明顯低于假推拿組(P<0.05),推拿組與假推拿組LC3Ⅱ蛋白相對表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。圖3及圖4。

圖3 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達條帶

圖4 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量

2.4各組大鼠脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較 正常組和假手術組Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。模型組Beclin1 mRNA相對表達量均明顯低于正常組和假手術組(P均<0.05);Bcl-2 mRNA相對表達量明顯低于正常組(P均<0.05),但與假手術組比較差異無統計學意義(P>0.05)。推拿組Beclin1 mRNA相對表達量明顯高于模型組和假推拿組(P<0.05),模型組與假推拿組比較差異無統計學意義(P>0.05)。推拿組和假推拿組Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05),推拿組與假推組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 正常組、假手術組和神經病理性疼痛各組大鼠脊髓組織中Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量

3 討 論

神經病理性疼痛病理生理機制十分復雜,涉及多種細胞分子、因子以及信號通路等[14]。當神經病理性疼痛發生時,神經損傷會導致細胞釋放包括炎癥因子在內的各種介質,其中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子會引起炎癥級聯反應,通過調控各種離子通道的活性,放大并降低神經元興奮的閾值,增加痛覺敏感性,誘發并促進疼痛的發生[15]。TNF-α主要由巨噬細胞和單核細胞產生,激活后可引起炎性細胞聚集和炎性細胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等的釋放,進而介導全身炎癥反應[16],是啟動和維持神經性疼痛狀態的關鍵性病理因素之一,在神經病理性疼痛的發生和維持方面起著重要作用[17-18]。TNF-α還對細胞的激活、增殖和程序性死亡的啟動及維持具有重要作用,其可以促進Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達,抑制Bcl-2的表達,促進細胞凋亡[19];另外其過度表達時會抑制細胞自噬作用,產生炎性產物,促進細胞凋亡[20],但自噬與凋亡也可以影響TNF-α的產生與分泌,從而介導炎癥反應,所以促進自噬可以抑制TNF-α而起到抗凋亡的作用。

自噬與凋亡均是細胞維持內環境穩態的重要方式,自噬和凋亡存在共用的刺激因素和調節蛋白,聯系密切而復雜,在不同的條件下,自噬與細胞凋亡之間會產生協同或拮抗作用,但二者之間的協調與轉換機制目前仍未明確[21]。神經病理性疼痛與神經細胞自噬和凋亡密切相關,疼痛發生后,神經細胞會出現一系列病理反應,其中細胞產生的促炎因子引起炎癥反應,并激活自噬與凋亡,而自噬激活后可以反過來通過抑制促炎因子的分泌發揮抑制炎癥的作用[22-23]。既往研究報道,上調自噬相關因子Bcline1和LC3B表達和降低 IL-1β、TNF-α水平可明顯減輕神經病理性疼痛,說明自噬對神經病理性疼痛的產生和維持有重要作用,自噬被激活后可通過自噬小體吞噬損傷的細胞器,清除有害的炎性因子,減少炎癥因子的釋放,從而緩解疼痛反應[24-26]。Hu等[27]研究證實,通過減少脊髓神經元凋亡可以減少TNF-α的產生以及下調凋亡相關基因的表達,可以抑制炎癥反應和緩解神經病理性疼痛,證明神經元發生凋亡在神經病理性疼痛中起重要作用。馮濤等[28]研究報道,雷帕霉素可誘導神經病理性疼痛大鼠脊髓背角神經元自噬,抑制細胞凋亡,提示在促進神經病理性疼痛自噬的同時,對凋亡產生了抑制作用,表明在神經病理性疼痛中自噬與凋亡之間存在相互拮抗的關系。

Beclin1、Bcl-2是自噬與凋亡交互作用的重要調節子[29]。Beclin1是自噬體成核的關鍵調控因子之一,是調節自噬的關鍵靶點[30]。抗凋亡蛋白Bcl-2能夠直接或間接地抑制Cyt C的釋放,是細胞凋亡的關鍵蛋白,Beclin1可借由BH3結構域與Bcl-2結合進行交互,當交互作用發生時會抑制細胞自噬的發生;二者結合的破壞可以促進自噬,抑制細胞凋亡[31]。神經病理性疼痛發生后,疼痛及炎癥反應與Beclin1、Bcl-2的表達密切相關。

中醫認為神經病理性疼痛是由于內傷外感等所致的“痹證”“筋傷”。《靈樞·經脈》記載:“膽足少陽之脈……是主骨所生病者,頭痛頷痛,目銳痛,缺盆中腫痛……諸節皆痛。”足少陽膽經循行周身筋肉骨節,若少陽膽經經絡不通,氣血阻滯會導致經絡所過之處發生疼痛。同時《靈樞·根結》有“少陽為樞”的說法,認為通利少陽經可以使周身經絡氣血通暢調達。推拿治療疼痛由來已久,推拿通過各種手法良性刺激患者的痛處以及作用于相關臟腑經絡腧穴,可以疏經通絡、活血化瘀、行氣止痛和理筋整復。推拿少陽膽經可以促進氣血調和、經絡暢通,以達到治療痹證疼痛的作用[11,32]。《針灸甲乙經》中言“腰脅相引痛急,髀筋脛,腰痛不可屈伸,痹不仁,環跳主之,筋急,陽陵泉主之”。環跳穴是足少陽膽經與足太陽膀胱經的交會點,主“筋病”的同時還主“骨病”;陽陵泉為筋會,是足少陽膽經與周身筋脈的交會點,有強經絡、壯骨節之功效,主治下肢痿痹、麻木,膝腫痛等;懸鐘為髓會,主治頸項僵痛、胸脅疼痛、腰膝腿痛等。故選擇環跳、陽陵泉、懸鐘3個穴位對大鼠進行推拿手法干預。

本實驗中模型組與正常組比較,大鼠術后痛閾降低,血清TNF-α水平和脊髓組織中Caspase-3蛋白相對表達量均明顯增高,脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯降低,這說明發生神經損傷后,促炎因子TNF-α釋放增加,激活炎癥反應進而誘發疼痛,且自噬受到抑制,凋亡增加。推拿組大鼠干預第7天、第14天的機械性刺激縮足閾值均明顯高于同期模型組,熱痛縮足反應潛伏期均明顯長于同期模型組,且血清TNF-α水平和脊髓組織中Caspase-3蛋白相對表達量均明顯低于模型組,脊髓組織中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相對表達量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯高于模型組,說明推拿可減輕神經病理性疼痛,其可能是通過上調Beclin1和Bcl-2的表達、下調Caspase-3的表達,從而激活自噬,抑制凋亡,進而減少促炎因子的釋放,減輕炎癥反應而緩解疼痛。但本研究尚未能完整地揭示推拿對Beclin1和Bcl-2的具體作用機制,在研究的深度和廣度上尚有不足,未來需進一步完善相關研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。