益氣固表丸對慢性阻塞性肺疾病細胞模型線粒體中SIRT5表達的影響

蒙 婷,徐 丹,米葉斯爾·買買提艾力,荊 晶,李風森1,

(1. 新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊 830011;2. 新疆維吾爾自治區第八人民醫院,新疆 烏魯木齊 830000;3. 新疆醫科大學第四附屬醫院/國家中醫臨床研究基地,新疆 烏魯木齊 830000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)發病機制復雜,近年來大量研究發現線粒體功能異常也是導致COPD的機制之一,調控線粒體功能成為研究COPD的一個重要方向[1]。SIRT5主要位于線粒體中,是通過去乙酰化抗氧化劑、線粒體維持和能量代謝蛋白來調節細胞應激反應的關鍵介質,有較明顯的去琥珀酰化作用[2-3]。而SIRT5調控的琥珀?；c線粒體功能密切相關,琥珀?；瘏⑴c線粒體功能障礙是許多疾病的一個共同因素[4-6]。益氣固表丸是在六君子湯的基礎上加減化裁而來,具有健脾益肺、化痰止咳的功效,是治療COPD的有效藥物,起效機制與氧化還原過程、細胞能量凋亡過程的負向調節等生物學過程、細胞成分組成有關[7]。但益氣固表丸是否可以影響線粒體發生琥珀?；瘡亩纳艭OPD線粒體功能障礙尚不明確,故本研究通過SIRT5調控COPD細胞模型發生琥珀?；?探究了益氣固表丸對COPD細胞線粒體琥珀酰化的影響,進一步從分子生物學方面為COPD的臨床治療思路及用藥提供科學依據。

1 實驗材料與方法

1.1細胞及藥物 人支氣管上皮樣細胞16HBE 購自中橋新舟;益氣固表丸由黨參、炒白術、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風組成,益氣固表丸含藥血清為前期大鼠實驗制備的凍存血清。

1.2試劑及儀器 KM培養基(Hyclone,USA);胎牛血清(FBS,Hyclone,USA);青鏈雙抗(上海生工);二甲基亞砜(DMSO,USA)、Lipofectamine?RNAi MAX Reagent、Trizol(Thermo,USA);SYBRGreen PCR試劑盒(Thermo,F-415XL,USA);反轉錄試劑盒(Thermo,K1622,USA);線粒體膜電位試劑盒(abcam,C2003S,中國);ATP ELISA試劑盒(abcam,S0026,中國);96孔培養板及6孔培養板(Costar,USA);酶標檢測儀(Thermo, MK3,USA);細胞培養箱(Thermo,Scientific8000,USA);低溫冷凍離心機(Sigma,3K15,USA);Real-time檢測儀(ABI-7500,USA);渦旋混合器(Scientific Industries);RT-6100 酶標儀(雷杜,rt6100,中國);熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,IX7,日本)。

1.3COPD細胞模型建立 在37 ℃、5%CO2條件下,將16HBE細胞接種于含有FBS和青鏈雙抗的KM培養基中培養。選用紅云紅河煙草集團的紅河牌香煙(每支香煙焦油含量11 mg,煙氣煙堿含量 1 mg,煙氣一氧化碳含量13 mg),點燃后將過濾嘴端接注射器,將600 mL煙霧注入含25 mL的玻璃瓶中,即為100%香煙煙霧提取物(CSE)原液。CSE在實驗前30 min制備,經過濾除菌后,用KM培養基稀釋為1.25%,2.5%,5%,10%,20%的濃度分別處理1×105個/mL 16HBE細胞6 h、12 h、24 h、48 h。每個濃度細胞培養至預定時間,每孔加入20μLMTT(5 mg/mL),37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養4 h,吸取孔內培養上清液,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min,用連續光譜酶標儀(波長492 nm)測定各孔的吸光度值,計算細胞抑制率[(1-實驗組OD值/空白組OD值)×100%],選取CES的最佳干預濃度和時間用于后續實驗。

1.4細胞siRNA轉染、RT-qPCR篩選SIRT5最佳敲降靶序 將COPD細胞分為COPD組、COPD+siRNA 空轉組、COPD+siRNA119組、COPD+siRNA 120組、COPD+siRNA 141組。每組調整細胞濃度為2×105個/mL,通過Lipofectamine?RNAi MAX Reagent 轉染siRNA SIRT5,用Trizol提取細胞線粒體總RNA,用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA,采用SYBR Green PCR試劑盒進行RT-qPCR,以GAPDH作為內參基因。SIRT5引物序列:上游為5’-GGAGCAAGGAGCCCAACGCCGGGCA-3’,下游為5’-CCACAAGAGGTACATCGAGTTTTAA-3’;GAPDH引物序列:上游為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,下游為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。用2-ΔΔCT方法分析SIRT5mRNA相對表達量。并利用RT-qPCR驗證轉染效率,選取轉染編號最佳的siRNA120用于后續實驗。

1.5細胞分組干預 實驗設6組:正常組16HBE細胞常規培養;COPD組COPD造模細胞常規培養;COPD+siRNA空轉組取COPD細胞,siRNA空轉染后培養;COPD+siRNA SIRT5組取COPD細胞,采用最佳的siRNA120轉染后培養;COPD+益氣固表丸組取COPD細胞,加入20%益氣固表丸含藥血清培養;COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組取COPD細胞,采用最佳的siRNA120轉染后,加入益氣固表丸含藥血清培養。

1.6檢測指標及方法

1.6.1細胞形態 在電子顯微鏡下觀察各組細胞形狀、透亮度、折光性及密度。

1.6.2線粒體膜電位 將各組細胞按1×106個/mL的濃度重懸于培養基中;加入配置好的JC-1染液;在細胞培養箱中按37 ℃、5%CO2的條件孵育10～30 min;用培養基重懸細胞,再離心收集,重復2次,以洗滌細胞;在激發波長488～505 nm、發射波長515～575 nm條件下,采用流式細胞儀檢測熒光信號的強度。當線粒體膜電位較高時,JC-1聚集在線粒體基質內,產生紅色熒光;當線粒體膜電位下降時,J為單體不聚集在線粒體基質內,產生綠色熒光。使用Image J計算熒光強度。

1.6.3細胞內活性氧(ROS)含量 細胞按1×106個/mL重懸于培養基中,加入配置好的10 μmol/L DCFH-DA工作液, 37 ℃孵育30～60 min;1 000×g離心5～10 min收集細胞,用PBS 洗滌1～2次,離心收集細胞沉淀物用于熒光檢測;將收集好的細胞用PBS重懸,在激發波長485～500 nm、發射波長525 nm條件下進行流式細胞儀檢測,計算熒光強度。

1.6.4細胞中ATP含量 ATP反應液用10 mL含2 mmol/L EDTA的0.1 mol/L pH7.75 Tris-醋酸緩沖液稀釋;在細胞培養板中(每孔含100 μL細胞培養液),每孔加入0.1 mL ATP釋放因子,室溫中反應5 min;吸取0.1 mL細胞溶解物,加入到另一塊細胞培養板的各孔中,置于自動多孔熒光檢測儀中,用自動加樣器,每孔加入20 μL ATP反應液,酶標儀于636 nm處測各樣本吸光度值。

1.6.5細胞中SIRT5表達情況 按照1.4中方法檢測并計算各組細胞中SIRT5 mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1顯微鏡下細胞形態 正常組細胞折光性好,細胞膜邊界清晰,形態展開;COPD組和COPD+siRNA空轉組細胞皺縮變圓,細胞密度低,細胞狀態差; COPD+siRNA SIRT5組細胞狀態更差,細胞大量皺縮變圓,折光性變差,細胞膜邊界不完整,無展開形態;COPD+益氣固表丸組 、COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組細胞狀態明顯改善,細胞透光性變強。見圖1。

圖1 正常組和慢性阻塞性肺疾病細胞模型各組細胞形態(×400)

2.2顯微鏡下線粒體膜電位情況 與正常組比較,COPD各組紅色熒光減弱,綠色熒光增強,表明線粒體膜電位下降,線粒體出現功能障礙;與COPD組比較,COPD+益氣固表丸組 、COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組紅色熒光增強,綠色熒光減弱。見圖2。

圖2 正常組和慢性阻塞性肺疾病細胞模型各組電鏡下線粒體膜電位熒光情況(×400)

2.3線粒體膜電位及線粒體中ROS含量 與COPD組比較,COPD+siRNA SIRT5組線粒體膜電位明顯降低(P<0.05),ROS含量明顯升高(P<0.05);與COPD組和COPD+siRNA SIRT5組比較,COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組線粒體膜電位均明顯升高(P均<0.05),ROS含量均明顯降低(P均<0.05)。見圖3。

圖3 正常組和慢性阻塞性肺疾病細胞模型各組線粒體膜電位及線粒體中ROS含量

2.4細胞中ATP含量 COPD各組ATP含量均明顯低于正常組(P均<0.05),且COPD+siRNA SIRT5組ATP含量明顯低于COPD組(P<0.05); COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5 +益氣固表丸組ATP含量均明顯高于COPD組和COPD+siRNA SIRT5組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 正常組和慢性阻塞性肺疾病細胞模型各組細胞中ATP含量

2.5細胞中SIRT5 mRNA相對表達量 COPD各組SIRT5 mRNA相對表達量均明顯低于正常組(P均<0.05),且COPD+siRNA SIRT5組SIRT5 mRNA相對表達量明顯低于COPD組(P<0.05);COPD+益氣固表丸組和COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組SIRT5 mRNA相對表達量均明顯高于COPD+siRNA SIRT5組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 正常組和慢性阻塞性肺疾病細胞模型各組細胞中SIRT5 mRNA相對表達量

3 討 論

西醫對于緩解COPD的臨床癥狀、延長急性發作的間隔期、縮短發作時間及減少發作次數的治療手段有限。隨著中醫治療優勢的不斷顯現,中藥在COPD的臨床治療中發揮了重要作用。中醫“治病必求于本”,本虛是決定COPD發生及發展的關鍵因素?！峨y經·六十九難》提示“虛則補其母”,脾為肺之母,脾主運化,其功能正常,才能化生精、氣、血、津液給人體提供足夠的養料,人體組織才能得到充分的營養。多數研究者運用培土生金的方法治療COPD穩定期取得了良好的療效,可以進一步改善患者的呼吸癥狀及全身癥狀[8-10]。張少華等[7]研究發現,具有脾虛特征的COPD 患者外周血有核細胞線粒體膜電位、細胞內活性氧含量異常,線粒體膜電位在肺脾氣虛組最低,細胞內活性氧含量在肺脾氣虛組最高,提示COPD 患者線粒體功能障礙與脾虛關系密切。益氣固表丸主要作用是健脾益肺,根據上述研究推測益氣固表丸可能改善COPD患者線粒體功能障礙。SIRT5是Sirtuin家族7個成員之一,是負向調控賴氨酸琥珀?；揎椀囊环N去琥珀?；竅11]。有研究發現,SIRT5可以將超氧化物歧化酶1(SOD1)賴氨酸123位點上的琥珀?；撊?降低細胞內的活性氧含量,說明琥珀?；种屏薙OD酶活性并影響其功能,通過上調SOD1的酶活性,可促進ROS的清除[12]。Sadhukhan等[13]報道,SIRT5敲除小鼠在禁食和運動條件下心臟出現脂肪酸代謝受損和ATP生成減少。Guedouari等[14]發現在能量缺失狀態下,線粒體伸長以逃避自噬降解,SIRT5缺失抑制了線粒體延伸,導致線粒體吞噬增加,表明SIRT5能保護線粒體在能量缺失狀態下不發生斷裂和降解。Li等[15]研究發現,SIRT5可能通過調控轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)和Bcl-2,減弱順鉑誘導的人腎HK-2細胞凋亡和線粒體損傷。

香煙煙霧是導致COPD發生及疾病進展的主要原因之一,可以干擾線粒體能量的產生,造成上皮細胞產生大量的ROS,引發氣道頑固性炎癥反應[16-17]。長期暴露于CSE的呼吸道上皮細胞的觀察結果顯示,CSE在線粒體形態學上引起了類似的畸變[18],這些形態學改變與線粒體功能障礙之間有潛在的聯系,包括ATP含量降低、線粒體膜電位下降、ROS含量升高[19]。本研究使用CSE誘導16HBE細胞損傷,結果顯示細胞內線粒體出現功能障礙,能量合成和轉化功能的下降導致細胞的形態及密度的改變,同時線粒體膜電位、ATP含量及SIRT5 mRNA相對表達量下降,ROS含量升高;COPD+益氣固表丸組與COPD組相比,細胞形態明顯改善,線粒體膜電位、ATP含量、SIRT5 mRNA相對表達量均明顯升高,ROS含量明顯降低,證明益氣固表丸可上調SIRT5表達,能夠改善細胞膜電位及線粒體功能障礙。另外與COPD+siRNA SIRT5組比較, COPD+siRNA SIRT5+益氣固表丸組線粒體膜電位、ATP含量、SIRT5 mRNA相對表達量均明顯升高,ROS含量明顯降低。因此推測益氣固表丸可能參與調控與SIRT5表達相關的某些重要通路或關鍵酶的活性,對SIRT5的表達起作用,也可能具有與SIRT5同樣的功能,參與調控琥珀酰化修飾,從而改善線粒體功能障礙。

綜上所述, SIRT5表達量與COPD線粒體功能障礙有關,其表達減少會加重COPD線粒體功能障礙,益氣固表丸可以通過上調SIRT5的表達而改善COPD線粒體功能障礙;在SIRT5缺失的情況下,益氣固表丸可能通過其他作用靶點影響SIRT5的表達調控COPD線粒體功能,SIRT5調控的琥珀?；赡苁且鏆夤瘫硗柚委烠OPD的新的作用靶點,有待進一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。