腸復方對葡聚糖硫酸鈉誘導的急性潰瘍性結腸炎小鼠的干預作用

張榮棋,馮淬靈,戴 中,張銀麗

(1. 北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700;2. 北京大學人民醫院,北京 100044)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性非特異性腸道炎性疾病,病變主要涉及直腸和結腸,呈連續性彌漫性分布,臨床癥狀常見反復發作的腹瀉、腹痛、黏液膿血便,重癥患者可發生中毒性巨結腸、直腸結腸癌變、消化道出血、腸穿孔等并發癥,危及患者生命。我國UC的患病率約為11.6/10萬[1],且近年來呈現爆發性增長趨勢。本病病因和發病機制不清,病程長、易反復,暫無根治方法,常用藥物包括美沙拉秦、皮質類固醇、免疫抑制劑、生物制劑等[2]。中醫藥治療UC有悠久的歷史,積累了大量經典方劑,如芍藥湯、白頭翁湯、參苓白術散、駐車丸等[3]。腸復方是北京大學人民醫院中醫科治療UC的協定處方,對美沙拉秦治療失敗的UC患者仍有效,能夠緩解活動期UC患者的臨床癥狀,促進鏡下黏膜修復,但腸復方治療UC的機制尚不明確,故本研究通過觀察腸復方對葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導急性UC小鼠的疾病活動指數(DAI)及結腸組織炎癥程度的影響,以期為腸復方的臨床應用及機制研究提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠40只,6～8周齡,體重(20±2)g,由北京華阜康生物科技公司提供,許可證號:SCXK(京)2019-0008。小鼠飼養于北京大學人民醫院動物實驗室,飼養環境為屏障級,溫度26 ℃,濕度(40±5)%,通風條件良好,12 h光照/黑暗交替,自由飲食、飲水,適應性飼養7 d。實驗方案已獲得北京大學人民醫院倫理審查委員會批準(批準號:2022PHE035),實驗操作流程嚴格按照實驗動物管理規定進行。

1.2實驗藥物 腸復方組成:黃芪15 g、赤芍15 g、白芍15 g、白頭翁15 g、馬齒莧15 g、黃連6 g、白花蛇舌草15 g、炒槐花15 g、茜草15 g、金銀花15 g、地榆炭15 g,上述劑量為60 kg成年人1 d藥量,顆粒劑購自北京康仁堂,稱取顆粒重量約為41.15 g。美沙拉秦緩釋顆粒,上海愛的發制藥有限公司,國藥準字H20143164,規格:500 mg×10袋/盒,60 kg成人1 d藥量為4 g。根據《藥理實驗方法學》[4]中標準體重小鼠(20 g)與成人(60 kg)給藥劑量換算公式,可以確定小鼠的腸復方顆粒給藥量約為0.17 g/d,美沙拉秦給藥量約為0.016 g/d,根據小鼠標準灌胃量0.1 mL/10 g,可計算腸復方給藥濃度約為0.85 g/mL,美沙拉秦給藥濃度約為0.08 g/mL。實驗時,用蒸餾水溶解中藥顆粒,制備所需藥物濃度;美沙拉秦緩釋顆粒用研磨缽研磨過篩后稱取所需量,用蒸餾水配置成混懸液。上述配置好的藥液儲存于4 ℃冰箱,使用前恢復至室溫、搖晃均勻。

1.3主要試劑 DSS(分子量36～50 kDa,AbMole,貨號:M9443-50g);糞便隱血定性檢測試劑盒(鄰聯甲苯胺法,Leagene,貨號:TC0511-300T);通用型組織固定液(主要成分為4%多聚甲醛,Servicebio,貨號:G1101-3ML);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(Servicebio,貨號:G1076-500ML);小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)酶聯免疫檢測試劑盒(Servicebio,貨號分別為GEM0004、GEM0001、GEM0008、GEM0002);Actin、閉合蛋白-1(Claudin-1)、閉合小環蛋白-1(ZO-1)、HRP-山羊抗小鼠、HRP-山羊抗兔(Servicebio,貨號分別為GB12001、GB112543、GB111402、GB23301、GB23303);TBST緩沖液(Servicebio,貨號:G2150-1L)。

1.4主要器材 電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,ME203E/02],高速組織研磨儀(Servicebio,KZ-II),臺式高速冷凍離心機(大龍,D3024R),渦旋混合器(Servicebio,MX-F),酶標檢測儀(BioTeK,Epoch),多功能型搖床(水平+鐘擺+3D)(Servicebio,DS-3D100),電泳電源(可編程)(Servicebio,SPW-6S),抗體孵育盒(Servicebio,G9055-4),化學發光儀(CLINX,6100)。

1.5實驗方法 使用隨機數字表將小鼠隨機分為空白組、模型組、腸復方組、美沙拉秦組,每組10只。實驗第1～7天,模型組、腸復方組、美沙拉秦組小鼠自由飲用蒸餾水配置的3%DSS溶液,空白組小鼠自由飲用蒸餾水,期間至多3 d更換1次飲用水,以確保水質潔凈。于實驗第8天撤除3%DSS溶液,恢復蒸餾水自由飲用。實驗第8～14天,腸復方組給予0.85 g/mL的腸復方顆粒溶液灌胃,美沙拉秦組給予0.08 g/mL的美沙拉秦緩釋顆粒混懸液灌胃,空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃,均1次/d,連續7 d。

1.6樣本采集與處理 實驗第14天灌胃后,禁食不禁水24 h,于第15天將所有小鼠以CO2安樂死。處置小鼠后迅速解剖,取出從肛門到盲腸末端的結腸和直腸段,測量長度后,于結腸遠端剪取0.5 cm置于4%多聚甲醛溶液中固定以進行后續組織病理分析,剩余結腸組織通過取樣管收集并儲存于液氮中,用于后續ELISA及Western blot檢測。

1.7檢測指標及方法

1.7.1DAI 從實驗第1天開始,參照Cooper等[5]的方法,每天觀察小鼠精神狀態、毛發稀疏程度、色澤、飲食狀態、大便形態和肉眼血便情況,測量體重,以糞便隱血定性檢測試劑盒(鄰聯甲苯胺法)檢測糞便隱血情況,并計算DAI。DAI=(體重下降分數+糞便性狀分數+隱血分數)/3,得分范圍0～4分,0分代表正常,4分代表炎癥最大活動度。具體評分標準見表1。

表1 潰瘍性結腸炎疾病活動指數(DAI)評分標準

1.7.2結腸長度 取出小鼠肛門到盲腸末端的結腸和直腸段,于坐標紙上拉直(但不拉伸)后測量長度。

1.7.3結腸組織病理評分 從固定液中取出各組小鼠結腸組織樣本,常規石蠟包理切片,行HE染色,由病理學專家于顯微鏡下盲法評估炎癥細胞浸潤程度及上皮組織損傷情況,參考Obermeier等[6]的評分標準(見表2),以兩項分數之和為組織病理評分。

表2 潰瘍性結腸炎組織病理評分標準

1.7.4結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平 取適量結腸組織,置于勻漿器進行勻漿,離心,取上清液,按照 ELISA 試劑盒說明書操作,使用酶標儀,在450 nm波長處以空白對照孔調零后測各孔吸光值,根據標準品的濃度和吸光值做標準曲線,然后根據標準曲線方程計算出樣本濃度。

1.7.5結腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:取適量結腸組織,剪碎后置于勻漿管中,加入蛋白酶抑制劑、裂解液后于冰上進行充分勻漿、裂解,離心后收集上清,獲取總蛋白溶液;將蛋白溶液與還原型蛋白上樣緩沖液混合,經沸水浴變性后,配置分離膠,上樣電泳,轉膜,封閉,倒掉封閉液后加入配置好的一抗稀釋液(Actin、ZO-1、Claudin-1稀釋比分別為1∶2 000,1∶1 000,1∶3 000),于4 ℃孵育搖床過夜,回收一抗,TBST緩沖液快速洗脫3次,每次5min,將二抗用TBST按照1∶5 000的比例進行稀釋后加入孵育槽中,搖床慢搖,室溫孵育30 min,TBST緩沖液快速洗脫3次,每次5 min,將洗脫并吸干水分的PVDF膜進行化學發光,曝光完成之后,保存原始圖為TIFF格式,用AIWBwellTM分析軟件進行數據分析,計算指標灰度值/內參灰度值,即蛋白相對表達量。

1.8統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據統計分析,計量資料如果符合正態分布且方差齊,兩兩比較采用t檢驗,多組之間比較使用標準單因素方差分析、Tukey的多重比較;數據符合正態分布但方差不齊,比較使用Brown-Forsythe和Welch單因素方差分析、Dunnett的T3多重比較;數據不符合正態分布的使用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1一般情況 整個實驗過程,空白組小鼠飲食、飲水正常,體重呈增長趨勢,活動狀態良好,反應靈敏,毛色潔凈光澤,無腹瀉和血便,便隱血實驗為陰性。實驗第2天,各造模組部分小鼠便隱血試驗陽性;實驗第3天,各造模組部分小鼠大便變軟;實驗第4天,各造模組小鼠體重普遍較前下降,便隱血試驗普遍陽性;實驗第7天,小鼠普遍出現飲食飲水減少,精神不佳,毛發光澤變差且脫毛增加,活動度降低,排稀便且粘肛門,可見肉眼血便等;實驗第8～14天,腸復方組和美沙拉秦組小鼠上述癥狀均較模型組減輕。

2.2DAI 開始造模后,除空白組外,各造模組小鼠的DAI持續升高,于實驗第7天達到峰值,且均明顯高于空白組(P均<0.05),各造模組之間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。停止造模、開始灌胃后,各造模組小鼠的DAI均逐漸下降。于實驗第14天,模型組DAI明顯高于空白組(P<0.05);腸復方組、美沙拉秦組DAI均明顯低于模型組(P均<0.05),且與空白組比較差異均無統計學意義(P>0.05),腸復方組與美沙拉秦組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 實驗過程中空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠疾病活動指數DAI評分

圖2 空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠實驗第7天、第14天疾病活動指數DAI評分

2.3結腸長度 各造模組小鼠結腸長度均明顯短于空白組(P均<0.05);腸復方組與美沙拉秦組小鼠結腸長度均明顯長于模型組(P均<0.05),腸復方組與美沙拉秦組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸外觀及長度

2.4結腸組織病理形態及病理評分 空白組小鼠結腸黏膜上皮連續完整,排列規則,隱窩結構正常,未見中性粒細胞和淋巴細胞浸潤,無病理損傷表現。模型組小鼠結腸結構破壞嚴重,杯狀細胞、隱窩結構大面積缺失,炎性細胞浸潤明顯,病理評分明顯高于空白組(P<0.05)。與模型組比較,腸復方組及美沙拉秦組小鼠結腸組織結構損傷較輕,炎性細胞浸潤減少,病理評分明顯降低(P均<0.05),腸復方組與美沙拉秦組病理評分比較差異無統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織HE染色病理形態及病理評分

2.5結腸組織中TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平 與空白組比較,模型組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6水平均明顯升高(P均<0.05),IL-4、IL-10水平均明顯降低(P<0.05);與模型組比較,腸復方組和美沙拉秦組小鼠結腸組織中TNF-α、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05),IL-4、IL-10水平升高,但差異均無統計學意義(P均>0.05);腸復方組和美沙拉秦組TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖5。

圖5 空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中炎癥因子水平

2.6結腸組織中ZO-1和Claudin-1蛋白表達情況 模型組小鼠結腸組織中ZO-1和Claudin-1蛋白相對表達量與空白組比較差異均無統計學意義(P均>0.05);腸復方組和美沙拉秦組小鼠結腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達量較模型組升高,但差異均無統計學意義(P均>0.05),且腸復方組和美沙拉秦組ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖6。

圖6 空白組和急性潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白表達情況

3 討 論

現代醫學認為UC的發病機制涉及遺傳易感性、環境因素、腸道菌群紊亂、免疫反應失調、上皮屏障缺陷等,其中免疫反應失調與炎癥因子調控異常密切相關,是UC發病的重要機制之一。炎癥因子包括促炎因子及抗炎因子,主要由免疫細胞合成,健康狀態下腸黏膜中促炎因子和抗炎因子處于平衡的穩態,病理狀態下由于調控炎癥因子的信號通路功能失常,導致腸黏膜促炎因子和抗炎因子之間的平衡被打破,進而出現炎癥級聯反應[7]。TNF-α是一種關鍵的促炎因子,其可促進中性粒細胞、巨噬細胞的增生、成熟和活化,進而刺激單核細胞、血管內皮細胞等產生細胞因子,從而引起級聯反應,最終導致腸道的炎癥損傷[8]。IL-6與TNF-α關系密切,亦是重要的促炎因子,二者激活路徑相似、互相調節,共同參與UC腸道炎癥與免疫調節過程[9]。IL-4與IL-10作為Th2細胞分泌的抗炎因子,可通過抑制TNF-α等多種促炎因子的合成、參與誘導Treg細胞分化等途徑緩解UC腸道炎癥程度[10-11]。

上皮屏障缺陷亦是UC的重要發病機制之一。緊密連接蛋白是腸道黏膜的重要組成,由不同的咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)及閉合小環蛋白(ZOs)組成,將相鄰上皮細胞緊密連接,對維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性起重要調控作用[12]。腸上皮屏障完整存在的情況下,只有少數管腔抗原能夠進入固有層,此時黏膜能夠耐受并阻止炎性反應的產生;但當緊密連接蛋白的調控異常,上皮屏障發生缺陷,更多的管腔抗原進入固有層,使局部免疫細胞受到足量刺激時,就會導致腸道炎癥[9,13]。

近年來大量研究表明,中醫藥可通過修復腸道黏膜機械屏障、調控腸道微生物菌群、調節免疫反應等途徑改善UC臨床癥狀,促進黏膜愈合,改善生活質量,降低復發率等[14]。本團隊根據UC活動期反復發作腹痛、腹瀉伴黏液血便的臨床特點,認為其主要病機為濕熱蒸壅,氣滯毒聚于腸腑,阻遏氣機,久而化熱,灼傷腸絡,腐而成瘍,熱毒熾盛,下痢膿血。本實驗所用腸復方是由芍藥湯、白頭翁湯、槐花散等治療“痢疾”“便血”的經典方劑化裁而成,UC活動期應當以除腸中實邪為第一要務,故以黃連、白頭翁、馬齒莧、白花蛇舌草、金銀花清除腸中濕熱毒邪;再以白芍、赤芍、茜草、地榆炭涼血止痢,黃芪健脾益氣;諸藥合用以清熱解毒、涼血止痢、健脾益氣,共同調和腸道氣血,正所謂“調氣則后重自除,行血則便膿自愈”。現代藥理研究表明,黃連、馬齒莧、白花蛇舌草具有抗炎作用,可通過多種信號通路下調TNF-α、IL-6等促炎因子及IL-10等抗炎因子表達[15];黃芪、白芍亦能通過調節腸道免疫功能以減輕炎癥損傷,還可以上調Occludin、Claudin-1、ZO-1等蛋白表達,促進腸黏膜屏障修復[16-17];茜草、地榆炭能調節免疫功能,減輕局部炎癥反應[18-19]。

本實驗通過3%DSS自由飲用建立小鼠急性UC,該模型與人類UC類似,除了體重減輕、腹瀉及便血等典型癥狀外,結腸組織病理也常見UC病變特點,如遠端病變較近端重、黏膜損傷較表淺等。此外,結腸長度也可以作為衡量結腸宏觀炎癥嚴重程度的指標,炎癥程度高時,結腸長度縮短[20]。本研究中模型組小鼠體重減輕,伴有腹瀉、便血,DAI明顯升高,結腸明顯縮短,結腸上皮組織損傷嚴重、炎性細胞廣泛浸潤,結腸組織中TNF-α、IL-6水平升高,IL-4、IL-10水平降低,證實DSS可成功誘導急性UC;腸復方可改善DSS誘導的急性UC小鼠的癥狀,降低結腸組織中TNF-α、IL-6水平,減輕結腸組織炎癥程度,且其效果不劣于美沙拉秦。此外,本研究腸復方組小鼠結腸組織中ZO-1、Claudin-1蛋白相對表達量相比模型組有升高趨勢,推測腸復方可能通過上調結腸黏膜緊密連接蛋白表達,從而對黏膜屏障起到保護作用,但需要進一步驗證。

綜上所述,腸復方可調節DSS誘導的急性UC小鼠結腸組織炎癥因子表達,改善UC小鼠的癥狀,減輕結腸組織炎癥反應,同時可能對結腸組織黏膜屏障有一定保護作用,且其作用不劣于美沙拉秦,為臨床治療UC提供了額外的選擇,也為腸復方作用機制的進一步研究提供了參考,但腸復方具體通過何種信號通路對炎癥因子進行調控仍不明確,需要更深層次的研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。