基于網絡藥理學和分子對接技術探討淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的作用機制

徐艷紅,金 鑫,郭一沙,劉 睿

(1. 天津中醫藥大學中藥制藥工程學院,天津 301617;2. 天津中醫藥大學現代中醫藥海河實驗室,天津 301617;3. 武警后勤學院,天津 300309;4. 武警特色醫學中心,天津 300162)

支氣管哮喘簡稱哮喘,哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的呼吸系統疾病,其臨床癥狀表現為反復發作的喘息、呼吸困難、胸悶和咳嗽等[1-2]。世界衛生組織發布的《全球哮喘負擔報告》顯示全球大約有3億人口患有哮喘疾病,估計到2025年世界范圍內將增加至4億哮喘患者[3]。哮喘疾病是僅次于癌癥的全球第二大致死和致殘疾病。西醫對哮喘的治療主要通過皮質激素類藥物緩解哮喘的急性發作,但是患者若長期服用此類藥物,容易產生不良反應甚至致使病情加重[4]。哮喘與中醫“哮病”理念有著緊密的聯系,其主要的發病機制歸結于肺部有痰,痰因肺脾腎功能失常,津液凝聚而成。現代中醫研究支氣管哮喘常基于肺和腎虛、痰濕疾病來討論氣道炎癥、氣道重塑等病理特征然后提供不同的預防和治療方法。中醫藥在治療哮喘方面獨具特色,不僅能通過抑制氣道炎癥和舒張支氣管來治療哮喘,而且在治療哮喘的同時還能提高患者的自身免疫力[5-6]。中藥淫羊藿味辛、甘,性溫,歸肝、腎經。不僅具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效[7],還具有抗衰老、增強免疫的功效[8]。女貞子甘、苦,性涼,歸肝、腎經,具有滋補肝腎、明目烏發的功效[9]。根據中醫“久病成虛”“緩則治本”的理論,平補腎中陰陽立法的藥對淫羊藿-女貞子是名老中醫徐輝光教授積30余年臨床之經驗而精選創制[10],臨床4∶3配伍作為支氣管患者緩解期用藥。研究發現淫羊藿和女貞子配伍能減輕哮喘大鼠氣道重塑的病理改變,改善膠原沉積和杯狀細胞增生的現象[11]。目前尚未有系統研究淫羊藿-女貞子治療哮喘作用機制的相關報道。本研究利用網絡藥理學及分子對接技術探討淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的核心成分以及作用機制,為淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的藥效物質基礎和作用機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1淫羊藿、女貞子的活性成分及靶點的獲取 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索中藥淫羊藿、女貞子的化學成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug likeness,DL)這兩個重要的藥代動力學參數對其進行初步篩選。通過篩選標準“OB≥30%,DL≥0.18”篩選淫羊藿-女貞子藥對的活性化合物,整理化合物的名稱以及Mol ID等信息,并收集化合物的對應靶點。通過Uniprot(https://www.uniprot.org)數據庫對收集的靶點進行統一標準化,設置條件“Reviewed (Swiss-Prot)”并選擇人源性基因,獲得淫羊藿、女貞子成分靶蛋白對應的靶基因。

1.2哮喘相關靶點的獲取 利用GeneCards(https:/www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)和DisGeNet(https://www.disgenet.org/)數據庫以“asthma”“bronchial asthma”為關鍵詞,檢索并收集哮喘靶點。為了排除與疾病低關聯的靶點對于后續研究的干擾,在GeneCards中篩選Relevance score值大于中位數且種類為protein coding為篩選條件,以及在DisGeNet中將Score大于中位數的疾病靶點納入到本研究哮喘靶點的范圍,最后將從3個數據庫收集的哮喘靶基因去重、匯總后獲得哮喘作用靶點。

1.3淫羊藿-女貞子藥對與哮喘交集靶點的獲取將收集的淫羊藿、女貞子成分靶基因匯總去重后,獲得淫羊藿、女貞子及淫羊藿-女貞子藥對成分的靶基因,然后與哮喘疾病靶基因匯總,將其導入Venny 2.1.0在線平臺并繪制淫羊藿、女貞子以及藥對作用靶點與哮喘靶點的交集基因韋恩圖。將淫羊藿-女貞子藥對與哮喘疾病的交集靶點輸出作為淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的潛在靶點。

1.4構建“藥物-成分-靶點”網絡 通過Cytoscape 3.9.1軟件建立“藥物-成分-靶點”網絡,并通過可視化網絡拓撲分析獲得關鍵成分。利用軟件的附加功能計算網絡圖的度值(degree centrality,DC)和中間中心性(betweenness centrality,BC)和接近中心性(closeness centrality,CC)。將藥物、成分及靶點的作用關系進行網絡拓撲學分析并可視化,以此來評價淫羊藿-女貞子藥對中活性成分和對應靶點的重要程度,從而探討其所含的化合物治療哮喘潛在的作用機制。

1.5構建蛋白相互作用網絡圖 將淫羊藿-女貞子藥對與哮喘的交集靶基因上傳至STRING(https://cn.string-db.org/)數據庫,建立交集基因的蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)網絡。設定Organism為“Homo sapiens”,最低相互作用閾值為“medium confidence 0.400”,并隱藏網絡中沒有相互聯系的節點,下載tsv.格式的PPI網絡文件。利用Cytoscape 3.9.1軟件對PPI網絡進行可視化分析。基于CytoNCA插件以Degree值進行網絡拓撲分析,篩選核心靶點并繪制蛋白頻次條形圖。

1.6基因本體富集和通路分析 為了研究淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的潛在靶點的生物學功能,本研究使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov)數據庫進行基因本體(gene ontology,GO)富集和KEGG通路分析。將淫羊藿-女貞子藥對的成分靶基因與哮喘靶基因的交集基因上傳至DAVID數據庫,設定物種為人類,然后進行GO富集和信號通路分析,并借助微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對富集的結果進行繪圖。

1.7分子對接 將從1.4獲得的核心成分前6名與從1.5獲得的排名靠前的6個核心靶點進行分子對接。在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載核心活性成分的3D結構,經Chem 3D 20.0軟件能量最小化處理后保存為.pdb格式;從RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的晶體結構(PDB格式),IL-6(PDB ID:1ALU)、JUN(PDB ID:1JNM)、IL1B(PDB ID:6Y8M)、Akt1(PDB ID:6S9W)、VEGFA(PDB ID:4KZN)、TP53(PDB ID:7B4E);運用Pymol軟件對核心靶點進行去水和殘基配體、只保留裸蛋白的操作,再利用AutoDock 1.5.6軟件對核心靶點進行去水、加氫操作保存為.pdbqt格式,對核心成分進行去水、加氫和設置扭轉鍵操作保存為.pdbqt格式;最后運行AutoDock vina進行分子對接,將所有對接結果按照結合能大小排序,選擇結合能較小的對接結果輸出到Pymol軟件繪制對接結果的構象圖。

2 結 果

2.1淫羊藿-女貞子藥對活性成分以及靶點的獲取 利用TCMSP數據庫篩選淫羊藿-女貞子藥對的活性成分。從TCMSP數據庫檢索得到淫羊藿130個化合物,女貞子119個化合物。以篩選條件(OB≥30%,DL≥0.18)篩選得到淫羊藿-女貞子藥對活性成分33個,見表 1。其中淫羊藿包含23個活性成分,女貞子13個活性成分,3個共有成分即木犀草素(MOL000006-luteolin)、槲皮素(MOL000098-quercetin)、山柰酚(MOL000422-kaempferol)。利用Uniprot數據庫將從TCMSP數據庫獲得的靶點蛋白名稱轉化成基因名稱。將得到的人源性基因去重、匯總后,獲得淫羊藿-女貞子藥對共225個成分靶基因,其中淫羊藿成分靶基因217個,女貞子成分靶基因195個。

2.2哮喘疾病靶基因的收集 從Genecards數據庫收集得到1 382個哮喘疾病靶基因,OMIM數據庫得到43個哮喘靶基因,DisGenet數據庫得到792個哮喘靶基因,去重、匯總后共得到1 720個哮喘疾病相關的靶基因。

2.3淫羊藿、女貞子及淫羊藿-女貞子藥對與哮喘交集基因 將淫羊藿、女貞子成分靶基因以及哮喘靶基因上傳到在線韋恩圖繪圖平臺,獲取藥物成分與疾病的交集基因。通過在線韋恩圖(圖1A),得出淫羊藿活性成分與哮喘的共有靶基因125個,女貞子活性成分與哮喘的交集靶基因115個,淫羊藿-女貞子藥對活性成分與哮喘共有靶基因126個(圖1B),將126個靶基因視為淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的潛在靶點。

圖1 淫羊藿、女貞子以及藥對作用靶點與哮喘靶點的交集基因韋恩圖

表1 淫羊藿-女貞子活性成分的基本信息

2.4“藥物-成分-靶點”網絡構建 利用Cytoscape 3.9.1軟件構建淫羊藿-女貞子藥對的成分-靶點網絡圖,見圖2。在網絡圖中節點代表藥物、活性成分和作用靶點;節點間的連線連接藥物、成分和靶點,體現其相互關聯性。該網絡圖中有節點258個,邊612條。利用Cytoscape 3.9.1軟件的Network Analyzer功能對網絡圖進行分析,成分的平均Degree值為4.67,即每個成分約與5個靶點相連。對于網絡中的節點來說,一個節點的Degree值越大,表明其在網絡中的重要性越高,再結合網絡中成分節點的CC值和BC值來共同判斷節點的重要程度。按照“Degree值≥2倍中位數(Degree≥20)”篩選核心成分,槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、2,7-二氫高刺桐春(C-Homoerythrinan, 1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-, (3.beta.)-)、脫水淫羊藿素(Anhydroicaritin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等化合物可能是淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的關鍵成分,見表 2。

注:菱形節點表示淫羊藿-女貞子藥對的活性成分;圓形節點表示活性成分對應的靶點;六邊形節點表示中藥淫羊藿和女貞子

2.5PPI網絡構建 將126個淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的潛在靶點導入STRING數據庫,獲得PPI網絡數據,然后利用Cytoscape 3.9.1軟件對PPI網絡進行可視化分析,見圖3。并基于拓撲分析的參數篩選核心靶點,將Degree值≥2倍中位數(Degree≥68)的有效靶點定義為核心靶點,IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B等靶點可能是淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的關鍵靶點,見圖4。

圖3 淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘潛在靶點的PPI網絡

圖4 淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的核心靶點

表2 淫羊藿-女貞子藥對的核心成分及拓撲參數

2.6GO富集和KEGG通路分析 通過DAVID數據庫對126個淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的潛在靶點進行基因本體(GO)富集和KEGG通路分析。基因本體包含3個本體(ontology),分別為生物學過程(biological process,BP)、所處位置的細胞組成(cellular component,CC)和所發揮的分子功能(molecular function,MF)。基于P<0.05,共獲得493個生物過程(BP)條目,63個細胞組成(CC)條目,99個分子功能(MF)相關的條目,147條淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘潛在靶點富集的通路。

對排名前10的GO分析條目繪制柱狀圖進行分析(見圖5),結果顯示GO分析主要富集在對細胞增殖、基因表達的正向調節、凋亡過程的負向調節、血管生成、炎癥反應、對缺氧的反應等生物學過程,細胞外、膜筏、轉錄因子復合體和大分子復合體等細胞組成,以及酶結合、蛋白質結合、血紅素結合、細胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性等分子功能。

圖5 淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘潛在靶點的GO富集分析

對排名前20的信號通路繪制氣泡圖進行分析(見圖6),結果顯示淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘可能與AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(AGE-RAGE信號通路)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號通路)、PI3K-Akt signaling pathway(PI3K-Akt信號通路)、TNF signaling pathway(TNF信號通路)、Th17 cell differentiation(IL-17細胞分化)、C-type lectin receptor signaling pathway(C型凝集素受體信號通路)等通路有潛在關聯。

圖6 淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘潛在靶點的KEGG通路分析

2.7分子對接分析 一般認為結合能<0 kcal/mol提示配體與受體有一定的結合能力,結合能<-5 kcal/mol提示配體與受體有較好的結合活性。根據分子對接結果(見表3),除了β-谷甾醇、脫水淫羊藿素和2,7-二氫高刺桐春與VEGFA蛋白的結合能>-5 kcal/mol,核心成分與IL-6、Akt1、TP53、IL1B和JUN的結合能均<-5 kcal/mol,說明淫羊藿-女貞子藥對的有效成分與核心靶點具有較好的結合活性,并且有效成分與Akt1蛋白有很好的結合能力。此結果證明淫羊藿-女貞子藥對是通過藥物多成分-多靶點發揮治療哮喘的功效。利用Pymol軟件繪制對接結果的構象圖(見圖7)。

A:IL-6與木犀草素;B:Akt1與β-谷甾醇;C:TP53與脫水淫羊藿素;D:IL1B與木犀草素;E:VEGFA與木犀草素;F:JUN與槲皮素

表3 淫羊藿-女貞子藥對核心成分和核心靶點對接的結合能結果(kcal/mol)

3 討 論

《醫宗必讀》云:“腎為先天之本。”若腎臟精氣陰陽不足,即腎虛,則會使機體失衛,外邪趁機而入,肺為嬌臟,最易受邪,邪郁于肺衛,肺失宣降,從而誘發哮喘。中西醫結合專家沈自尹通過調查研究認為,哮喘患者普遍存在腎臟精氣陰陽不足的現象,部分患者表現為陰虛哮喘。淫羊藿、女貞子作為常用的延緩衰老的補腎中藥,兩藥配伍可平補腎中陰陽,用于腎虛型哮喘具有較好的治療效果。本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法,預測淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的藥效成分、靶點和通路,闡釋其作用機制,為淫羊藿-女貞子治療哮喘的進一步研究提供參考。

由藥物-化合物-靶點網絡圖可知,槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、脫水淫羊藿素等成分在網絡中具有重要作用,表明這些成分可能是淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的關鍵成分。槲皮素具有抑制組胺和促炎介質分泌的抗過敏作用。槲皮素可調節哮喘疾病中Th1/Th2的平衡,減少B細胞釋放抗原特異性IgE抗體發揮抗炎和免疫調節的作用,適用于哮喘的治療[12]。研究表明山柰酚在呼吸系統疾病模型(哮喘、急性肺損傷和慢性阻塞性肺疾病等)具有抑制黏液分泌、減輕氣道炎癥反應的作用[13-15]。木犀草素作為黃酮類化合物在哮喘疾病的治療中發揮抗炎、抗過敏和增強免疫的活性。木犀草素能夠影響多種炎癥相關通路的表達,減少炎癥因子的活性,以達到緩解炎癥的作用[16]。木犀草素可以通過抗氧化應激和抑制COX-2信號通路[17],抑制TLR4/NF-κB[18]途徑抑制氣道炎癥,還可以抑制MAPK通路改善哮喘大鼠的氣道重塑病理過程[19]。β-谷甾醇已被證明具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及潛在的抗哮喘作用,能夠改善卵清蛋白(OVA)誘導的哮喘豚鼠導致的肺功能障礙,減少肺泡灌洗液的炎性浸潤和抑制TNF-α、IL-4和IL-5的炎癥因子分泌改善Th2型氣道炎癥[20]。另外,β-谷甾醇通過抑制IL-17A的分泌和提高IL-35的水平而調節Th17/Treg免疫失衡[21]。脫水淫羊藿素對由脂多糖(LPS)誘導而活化的巨噬細胞釋放IL-6、TNF、MCP-1等促炎細胞因子的病理過程具有抑制作用[22],對活化的小鼠T淋巴細胞具有抑制作用以及抑制IL-6、IL-10等細胞因子分泌,表明脫水淫羊藿素具有潛在的免疫抑制作用[23]。

由PPI網絡可知,淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的核心靶點包括IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B、JUN等。IL-6是由巨噬細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等分泌的細胞因子,具有免疫調節作用、反應機體的炎癥反應和抗腫瘤效應。IL-6參與哮喘的發生發展,研究發現哮喘患者在急性發作時體內的IL-6明顯升高[24]。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)被激活。抑制Akt1的激活可以改善過敏性哮喘的氣道炎癥反應[25]。TP53是一種抑癌基因,遲發性哮喘患者外周血中叉頭盒狀O轉錄因子3(FOXO3)和TP53的mRNA表達有明顯差異,可能與DNA甲基化的調節有關。FOXO3和TP53甲基化是預測遲發性哮喘患者血液中的生物標志物,并且可能是遲發性哮喘的診斷和臨床治療的有效靶點[26]。血管內皮生長因子A(VEGFA)存在于血管內,是由血管內皮細胞分泌產生,在血管通透性和肺血管增殖方面發揮重要作用,影響哮喘氣道重塑發展的病理過程[27]。IL1B可以增加內皮細胞對嗜中性粒細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等細胞的黏附力,而內皮細胞遍布于全身各處,是炎癥反應中各類物質相互作用的交匯點。另外,IL1B能促進炎癥細胞的活性,尤其是單核細胞,調節炎性細胞的轉運和活化而參與炎癥反應[28]。JUN家族包含c-JUN、JUNB、JUND蛋白,c-JUN也是轉錄因子AP-1家族的成員,是AP-1復合物中最具有轉錄活性的轉錄因子,AP-1與DNA結合后調控多種基因的表達,可以通過調節VEGF、基質金屬蛋白酶等因子的表達,參與哮喘氣道重塑的發展變化[29]。

由KEGG通路分析可知,與哮喘相關的通路有AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等。AGE-RAGE信號通路是一種重要的炎癥通路,該通路可以激活NF-κB傳導途徑,促進炎癥因子釋放(比如TNF-α),參與哮喘的發生、發展[30]。IL-17信號通路參與中性粒細胞誘導的哮喘[31]。PI3K-Akt信號通路通過調控嗜酸性粒細胞浸潤、氣道杯狀細胞增生和黏蛋白MUC5AC等細胞和細胞因子的表達而參與氣道黏液高分泌過程[32]。TNF信號通路通過調控氣道炎癥和氣道重塑參與哮喘的病理變化過程。Th17細胞在炎癥發生過程中可以分泌大量IL-17,誘導巨噬細胞的聚集,引發炎癥反應[33]。Th17細胞通過誘導IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達,參與哮喘等疾病的發生[34]。

本研究借助網絡藥理學和分子對接技術,預測了淫羊藿-女貞子藥對治療哮喘的主要活性成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、2,7-二氫高刺桐春、脫水淫羊藿素等,可能通過作用于IL-6、Akt1、TP53、VEGFA、IL1B等靶點以及作用于IL-17通路、PI3K-Akt通路和TNF通路等多個信號通路發揮治療哮喘的作用。但由于篩選成分時未考慮多種成分之間的相互作用,以及數據庫信息存在滯后性和不全面性,使得研究具有一定的局限性,后期需要進行分子生物學實驗對網絡藥理學和分子對接預測的結果進行驗證,以明確其作用機制。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。