苦碟子總黃酮基于PI3K/AKT信號通路對冠心病心絞痛大鼠血管內皮功能的影響

曾靜 雷玉華 楊淑蓉 華曉芳 周慧 黃晶

冠心病也稱為“冠狀動脈性心臟病”,該病的產生與冠狀動脈粥樣硬化緊密相關,容易使機體冠脈血管腔內出現阻塞、痙攣及狹窄,當心肌缺血缺氧時常常會出現心絞痛,當心肌壞死時則會進展為心肌梗死,在>40歲的中老年人群中比較多見,尤其是處于腦力工作者占大多數且隨著國內經濟、社會逐漸發展,人民的生活質量提升、飲食習慣轉變以及人口的老齡化情況,該病對人們身體健康造成嚴重危害的常見病,其死亡率及患病率呈不斷上升的趨勢,且患病年齡逐步趨于年輕化[1-3]。而冠心病心絞痛屬于醫學“心痛”、“胸痹”的范疇內,在中醫上將癥狀特征常歸納為胸痛、胸悶窒息、喘息嚴重、悲痛徹心等[4-5]。苦碟子總黃酮屬于中藥苦碟子內所提取的有效成分,有研究發現,苦碟子注射液在治療冠心病心絞痛中獲得了比較明顯的效果,但具體何種成分起到作用尚未清晰[6]。基于此,本文采用苦碟子總黃酮對冠心病心絞痛大鼠病癥予以干預,效果顯著,其機制可能與PI3K/AKT信號通路相關,報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級45只SD大鼠,體重17～25 g,平均(21.45±2.60)g,由深圳灣實驗室提供,動物許可證號:SYXK(粵)2022-0287,所有大鼠均在濕度40%～65%,溫度20～23℃的標準鼠籠里飼養,光照24 h,明暗交替12 h,飼養過程中大鼠自主飲食。適應性飼養5 d后進行試驗。本試驗均嚴格按動物實驗標準操作,且獲得醫院委員會批準。

1.2 藥品 苦碟子總黃酮由通化華夏藥業有限責任公司提供,純度≥90%,應用時選取無菌0.9%氯化鈉溶液配制相應濃度的苦碟子總黃酮溶液,需注意現用現配,并儲存于干燥、密封避光的環境中。

1.3 方法

1.3.1 建模與分組:在適應性喂養5 d后選取20只作為對照組,其余65只參照文獻[7]建立冠心病心絞痛模型,用自制的高脂飼料持續性喂養10周,高脂飼料為正常的飼料內放入3%的膽固醇(TC)、0.5%的膽酸鈉、10%的蛋黃粉、10%的豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶,35 g/d。對照組大鼠使用正常的飼料養育,35 g/d。后在大鼠尾靜脈抽血做樣本,采取動物自動生化分析儀(廠家:山東博科科學儀器有限公司,型號:BK-200VET型)測定大鼠總膽固醇(TC)、三酯甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)表達予以證實模型建立成功,共60只大鼠建模成功,將建模成功的60只大鼠隨機分為模型組、苦碟子總黃酮低劑量組、苦碟子總黃酮高劑量組3組,每組20只。

1.3.2 給藥干預:建模完成后,開始進行給藥。對照組、模型組予以注射用水(4 mL)進行灌服,苦碟子總黃酮低劑量組給予注射用水+1.0 mg/mL苦碟子總黃酮進行灌胃,苦碟子總黃酮高劑量組給予注射用水+2.0 mg/mL苦碟子總黃酮進行灌胃。1次/d,連續飼養10周,觀察大鼠情況。

1.4 觀察指標

1.4.1 樣本采集:收集大鼠心臟中5 mL的血液樣本,以離心半徑6 cm、轉速2 500 r/min,離心處理15 min,提取上層血清,-65℃低溫環境存儲備檢。在大鼠腹部注入戊巴比妥后斷頸處死,取其心臟,收集周圍結扎的心肌組織,制成樣本,于-75℃冰箱內保存,備用。

1.4.2 病理組織學觀察:取大鼠心肌組織,放進4%多聚甲醛溶液內予以固定,并使用梯度乙醇脫水,埋于石蠟內,制作切片,厚度為3 μm,后制作成玻片標本,放入蘇木精于室溫狀態下培養10～15 min,滴加0.5%的曙紅溶液在室溫狀態下培養3～5 min,應用HE染色試劑盒進行染色,于光鏡下觀察病理組織的形態學變化。

1.4.3 血管內皮功能、心肌酶、炎性因子指標表達檢測:采用ELISA法檢測一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,首先經包被液將蛋白稀釋至最佳含量,保持5℃過夜后,待檢,后經反復沖洗、稀釋,洗3～5次,4 min/次,上述步驟反復試驗3～5次,后放入終止制劑發生反應,使用酶標儀(廠家:山東三體儀器有限公司,型號:ST-MB96S)測量460 mm處的吸光值,依據標準的曲線觀察并計算4組大鼠NO、ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達水平,試劑盒分別由優利科(上海)生命科學有限公司、博輝生物科技(廣州)有限公司、艾美捷科技有限公司、北京伊塔生物科技有限公司提供,貨號分別為YLK-EDS001、EK-R37841、GBS-IT7209、SY6352、GBS-IT7716、GBS-IT6570進行檢測。其檢測步驟均由專業醫師按說明書操作進行。

1.4.4 PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達量檢測:采用免疫印跡法測定4組大鼠心肌組織中PI3K、Akt水平表達,取4組大鼠心肌組織,冰上溶解約15 min后,以100 mg∶1 mL的比例置于相應體積的蛋白清液內進行裂解反應,于5℃靜置3～5 min后,將4組樣本放入勻漿機中使其均勻的研磨加以萃取總蛋白,應用BCA法對蛋白液體含量進行測定,試劑盒由(天根生化科技(北京)有限公司,貨號:PA115-01)提供,計算樣本數據,后取含量為45 μg的總蛋白樣本用凝膠(10%)行電泳分離(75～125V,90～100 min),后在100 mV的穩定電壓下和PVDF膜行濕轉移,加入牛血清白蛋白(5%)在室溫狀態下培養1 h,后將以1∶500比例稀釋的PI3K、Akt放進分離后的蛋白質內,于5℃下培養過夜后,接著在沖洗后于室溫環境下滴入二抗培養1 h,放于顯示儀下,加入化學發光制劑,進行1～2 min顯影后操作,獲取數值,重復試驗3次。內參為β-actin。應用Image J軟件分析4組SPF級大鼠相對應的條帶灰度值。

2 結果

2.1 病理組織學觀察 對4組大鼠心肌組織切片染色用光鏡觀察,對照組的心肌細胞形態正常、結構較為完整、細胞核均勻染色,心肌纖維整齊排列,無顯著變化;模型組細胞核縮小或消失,心肌細胞發生變性,部分心肌纖維出現斷離,散亂排列心肌間質中存在較多的炎性細胞入侵,伴有水腫、充血情況;苦碟子總黃酮低、高劑量組相較于模型組,心肌纖維排列、心肌細胞結構形態有所改善,充血、炎癥及水腫情況明顯緩輕。見圖1。

對照組 模型組 苦碟子總黃酮低劑量組 苦碟子總黃酮高劑量組

2.2 4組大鼠血管內皮功能表達比較 與對照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的ET-1表達升高,NO表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的ET-1表達降低,NO表達上升,差異有統計學意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組的ET-1表達下降,NO表達升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血管內皮功能表達比較 n=20,

2.3 4組大鼠心肌酶水平表達變化比較 與對照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的CK-MB、LD表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,苦碟子總黃酮低、高劑量組的CK-MB、LD表達下降,差異有統計學意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組對比,苦碟子總黃酮高劑量組的CK-MB、LD表達下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心肌酶水平表達變化比較 n=20,U/L,

2.4 4組大鼠炎性因子水平表達變化比較 與對照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低、高劑量組的TNF-α、IL-6表達上升,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的TNF-α、IL-6表達降低,差異有統計學意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組的TNF-α、IL-6表達下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠血清炎性因子表達變化比較 n=20,pg/mL,

2.5 4組大鼠PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達量 與對照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低、高劑量組PI3K、AKT表達均有所下降,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的PI3K、AKT表達均有所升高,差異有統計學意義(P<0.05);與苦碟子總黃酮低劑量組比較,苦碟子總黃酮高劑量組PI3K、AKT表達均有所升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖2。

表4 4組大鼠PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達量 n=20,

圖2 PI3K/AKT信號通路蛋白Western blot圖;A 對照組;B 模型組;C 苦碟子總黃酮低劑量組;D 苦碟子總黃酮高劑量組

3 討論

出現在冠狀動脈中的栓塞、創傷、結締性組織疾病、先天性畸形及炎癥等均會使心肌缺氧、缺血,上述癥狀廣義而言均屬冠心病范圍。世界衛生組織對冠心病常分為五大類別,包括心絞痛、無病灶心肌缺血、心肌梗死、猝死及缺血性心臟病[8-10]。中西醫診治冠心病心絞痛主要包含以下內容:調整飲食習慣;少鹽清淡;對高血糖、高血壓及高血脂等癥狀給予有效的抑制;實施針灸或藥物的診療;重建血管進行治療等方面[11-12]。

苦碟子總黃酮屬于中藥苦碟子內的黃酮類化合物,其有抗腫瘤、抗氧化應激等作用,可用于治療心腦血管系統病癥,且通過苦碟子注射液還可通過改善循環、血管擴張等途徑起到“化瘀活血”的效果,可有效改善心臟功能、緩解心臟血氧供應。苦碟子注射液能提升治療冠心病心絞痛的效果,但其除黃酮類化合物外,還包括腺苷等成分,而有關苦碟子總黃酮對冠心病作用的研究相對偏少[13]。ET-1、NO通過血管內皮細胞產生有較強拮抗作用的活性物質,為反映血管內皮功能的主要指標,二者比例紊亂可加重冠心病病癥的進展;且ET-1可造成冠狀動脈痙攣加劇,有導致心律失常、細菌細胞毒性作用;NO是一種血管舒張的重要因子,是通過分子氧及L-精氨酸在NO合成酶的刺激下產生[14]。CK-MB、LD均屬于心肌損傷有關的酶學指標,CK-MB主要分布在骨骼、心肌及平滑肌等組織細胞中,為評估心肌損傷程度的重要指標,可作為檢測冠心病的一種酶;LD為一類糖酵解酶,存在于所有組織細胞的細胞質中,心肌細胞內的活性相較于血清明顯升高,心肌細胞受損時可釋放至血液中,致使血液中水平上升,可作為評估心肌受損主要的非特異性指標[15]。IL-6、TNF-α是炎性反應加重、啟動因子,與動脈粥樣硬化發生及斑塊的穩定性密切相關,促進血管壁中炎性反應,促使動脈粥樣硬化產生,加速冠心病發展[16]。本研究發現,與對照組比較,模型組、苦碟子總黃酮低劑量組的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達升高,NO、PI3K、AKT表達降低(P<0.05);與模型組比較,苦碟子總黃酮低、高劑量組的ET-1、CK-MB、LD、TNF-α、IL-6表達降低,NO、PI3K、AKT表達上升(P<0.05),與有關學者[17]研究較相似。表明苦碟子總黃酮在冠心病心絞痛大鼠治療中可以有效調節機體中血管內皮功能,改善心肌酶水平,降低炎性反應,為臨床治療提供了有利參考。

PI3K屬于一類細胞中具有特異性催化磷脂酰肌醇的重要激酶,PI3K/AKT信號通路平衡失調常見于多項人類病癥中,包含心血管病癥、癌癥、神經性病癥及糖尿病[18]。AKT屬于一種在細胞中存活的主要調節性因子,可通過直接抑制蛋白凋亡或減緩轉錄因子產生促使凋亡得以有效調節[19]。本研究發現,在冠心病心絞痛大鼠機體中PI3K、AKT表達降低,通過苦碟子總黃酮對其進行干預,可使PI3K、AKT表達顯著上升,由此證實其作用機制與PI3K/AKT信號通路有一定關系。研究顯示,藥物在病情治療中,可通過對PI3K/AKT信號通路進行激活,有效降低TNF-α、IL-6表達,從而發揮心肌細胞保護作用,調節心肌細胞的病變程度,調節ET-1、NO表達,以改善血管內皮功能,最終起到治療冠心病心絞痛的作用[20-21],與本研究結果相似。表明通過苦碟子總黃酮對PI3K/AKT表達進行調控,能有效降低冠心病心絞痛大鼠體內的氧化應激反應,改善血管內皮功能,提升心肌細胞血供,減緩炎性反應,降低心肌細胞受損程度,促使病癥改善。

綜上所述,苦碟子總黃酮可通過調節PI3K/AKT信號通路降低炎性反應,進而改善機體血管內皮功能及減緩心肌組織損傷,對冠心病心絞痛大鼠起到有效緩解的作用。