蒙藥材蜀葵花質(zhì)量標準研究

岳 海,塔 娜,2,高 寒,2,郭寶鳳,2*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥標準研究重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

蜀葵花為錦葵科植物蜀葵Althaea rosea(Linn.)Cavan.(Malvaceae)的干燥花[1],蜀葵入藥歷史悠久,始載于《爾雅》,收錄在《中藥大辭典》、《本草綱目》、《全國中草藥匯編》等醫(yī)學著作。蜀葵花具有清熱,利尿,利水,固精,止血。可用于尿閉,腎熱,膀胱熱,水腫,滑精,月經(jīng)過多[2]。蜀葵花的質(zhì)量標準目前收載在內(nèi)蒙古蒙藥材標準中,檢驗項目僅有性狀、顯微鑒別、理化鑒別,質(zhì)量標準較低,無法有效控制其質(zhì)量[3]。本研究采用性狀、顯微和薄層色譜鑒別法對蒙藥材蜀葵花進行真?zhèn)味ㄐ澡b別,采用2020年版《中國藥典》通則中收載的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物的方法測得,采用高效液相色譜法(HPLC)對其含量進行測定,為蒙藥材蜀葵花的質(zhì)量標準的提升提供可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ME5 型百分之一電子天平(賽多利斯);BSA型萬分之一電子天平(賽多利斯);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美);DM 3000型顯微鏡(LEICA); U3000型高效液相色譜儀(賽默飛)。

1.2 試藥

山奈素、槲皮素對照品均購于為中國食品藥品檢定研究院,山柰素對照品(批號:110861-202214,純度97.4%);槲皮素對照品(批號:100081-201610,純度99.8%);甲醇為色譜純,水為高純水,其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

本研究所用蜀葵花藥材,經(jīng)我院郭寶鳳副主任藥師鑒定為錦葵科植物蜀葵Althaea rosea(Linn.)Cavan.(Malvaceae)的干燥花。樣品信息見表1所示。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 蜀葵花的性狀鑒定

不同采集地區(qū)蜀葵花藥材性狀特點基本一致,描述為本品多皺縮卷曲,呈不規(guī)則圓柱形或扇形,長2～4.5 cm,直徑1～2 cm。有的有花萼和副萼,花萼杯狀,5裂,裂片三角形,長1.5～2.5 cm;副萼6～7裂,長5～10 mm,兩者均呈黃綠色至黃褐色,并被有較密的星狀毛。花瓣皺縮卷曲,紫紅色或暗紫色,單瓣或重瓣,展平后呈倒卵狀三角形,爪有長髯毛。雄蕊多數(shù),花絲聯(lián)合成筒狀;花柱上部分裂成絲狀。氣微,味微苦。

2.2 蜀葵花的顯微鑒別(粉末特征)

本品粉末紅紫色。花粉粒圓球形,直徑110～170 μm,表面具刺狀雕文。非腺毛為星狀毛,多破碎,完整者由3～9單細胞組成,單個細胞長80～700 μm。草酸鈣簇晶甚多,直徑10～20 μm。螺紋導管較多。見圖1。

圖1 蜀葵花花粉末特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取本品粉末約1 g,加石油醚(60～90℃)30 mL,水浴加熱回流40分鐘,棄去石油醚,藥渣揮干,加乙醇40 mL,超聲處理40分鐘,放冷,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇 1mL使溶解,即得供試品溶液。對照藥材溶液的制備:取自制蜀葵花對照藥材1g,同供試品溶液的制備方法制得蜀葵花對照藥材溶液。吸取前述溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上;以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置的下層溶液展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在110℃加熱至斑點顯色清晰,供試品色譜中,在與蜀葵花對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。見圖2。

圖2 蜀葵花薄層色譜鑒別

2.4 水分、灰分、浸出物含量測定

按照《中國藥典》(2020年版)的方法,對7批蜀葵花樣品的水分、總灰分、酸不溶性灰分進行檢查,以70%乙醇為溶劑,按照浸出物測定法(通則2201)項下熱浸法測定浸出物。結果見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性、浸出物測定結果

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件[4]

C18色譜柱(250mm×4.6mm 5μm);以甲醇-0.4%磷酸(45:55)為流動相;流速為 1.0 mL/min;檢測波長為360 nm;理論板數(shù)按山柰素色譜峰計算應不低于6000。

2.5.2 對照品溶液的制備

取山柰素對照品適量,精密稱定,加80%甲醇制成每1mL含20 μg的溶液,即得。

2.5.3 供試品溶液的制備

精密稱取取本品粉末約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入80%甲醇50 mL,稱定重量,水浴加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液25 mL,置具塞錐形瓶中,加鹽酸5 mL,置水浴中加熱水解1 h,放冷,轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,加80%甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.5.4 專屬性試驗

精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀。供試品色譜中,在與山柰素對照品色譜峰相同保留時間處出現(xiàn)色譜峰,且光譜圖一致。表明該含量測定方法專屬性好。以DAD檢測器對供試品溶液中被測成分山柰素峰進行純度檢查,結果峰純度為999.73。表明該方法測定蜀葵花樣品中山柰素峰為單一成分。結果見圖3。

圖3 蜀葵花高效液相色譜圖

2.5.5 線性關系考察

取山柰素對照品溶液(濃度為:21.62 μg/mL),分別以不同體積(2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL、25.0 μL、30.0 μL)注入高效液相色譜儀,按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定,以峰面積對進樣量做線性回歸分析。結果山柰素在10.81 ng～135.13 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關系。回歸方程為:Y=0.0471X-0.0288,r=0.9999。

2.5.6 精密度試驗(重復性)

取同一樣品(2號)粉末(過三號篩)6份,各約1.0g,精密稱定,分別按“2.5.1和2.5.3”項下條件進行測定,各進樣10 μL,計算含量(mg/g),6份樣品山柰素含量的 RSD 為1.58%,結果表明該實驗方法、儀器性能穩(wěn)定。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗

取按“2.5.3”項下制得的同一供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24 h進行測定,記錄峰面積,山柰素峰峰面積RSD為1.12%,表明該法制得的溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性。

2.5.8 準確度試驗

精密城稱取重復性試驗的樣品(2號,2.729 mg/g)6份,每份約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入山柰素對照品溶液10ml(濃度為0.1244 mg/mL),精密加80%甲醇40 mL,按上述方法測定,計算加樣回收率,結果見表3。

表3 山柰素加樣回收率試驗結果

2.5.9 耐用性試驗

更換三個廠家(島津、安捷倫、迪馬)的色譜柱,按上“2.5.1”項下的色譜條件,對同一份樣品進行測定,分離度均大于1.5,測得的含量的RSD%為0.17%,表面該方法的柱耐受性好。

2.5.10 樣品含量測定

分別稱取7批蜀葵花樣品,平行稱2份,每份約1.0 g,按“2.5.3”、“2.5.1”項下方法測定7批蜀葵花樣品中山柰素含量。結果顯示,7批蜀葵花樣品中山柰素含量為0.12%～0.49%,均值為0.26%,見表4。將蒙藥材蜀葵花的限度暫定為按干燥品計算,含山柰素(C16H12O6)不得少于2.0 mg/g(0.20%)。

表4 蜀葵花中山柰素含量測定結果

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

考察了甲醇、乙酸乙酯、丙酮和乙醇為溶劑超聲提取法進行鑒別,結果色帶干擾嚴重,無法準確檢識,故采用石油醚脫色素后,再用乙醇為溶劑超聲提取的方法、同時對比研究兩種展開劑:乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水(20:1:1:1)和三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10 ℃以下放置過夜的下層溶液,對比研究兩種顯色劑:5%香草醛硫酸溶液和10%硫酸乙醇溶液,最終選取出分離度好,斑點信息全面的方法。

3.2 浸出物測定

照《中國藥典》2020年版(通則2201)項下的水溶性浸出物測定法和醇溶性浸出物測定法,分別以水、30%乙醇、70%乙醇和乙醇為溶劑,進行試驗研究,因蒙藥材蜀葵花含有大量黏液細胞,水與30%乙醇溶液為浸出溶劑時,液體黏度大,過濾非常慢,無法操作,70%乙醇溶液比乙醇為溶劑時提取效率高,故以70%乙醇溶液為溶劑,熱浸法測定浸出物含量。

3.3 含量測定中指標的選擇

在含量測定試驗中,同時以槲皮素、山柰素為檢測指標進行研究[5-9],

結果供試品色譜中,雖然在槲皮素對照品色譜峰相同保留時間處有色譜峰出現(xiàn),但光譜圖不同,故未建立槲皮素的含量測定方法。在與山柰素對照品色譜峰保留時間相同位置處有出現(xiàn)色譜峰,且光譜圖一致,建立山柰素的含量測定方法。

3.4 含量測定中供試品溶液制備方法

分別考察了不同提取方法(超聲提取、回流提取、索氏提取)、不同提取時間(0.5h,1h,1.5h)及酸解效率考察(加鹽酸3 mL、5 mL、7 mL)對蒙藥材蜀葵花中山柰素的提取效率影響。結果確定最佳提取方法為80%甲醇加熱回流提取1 h,酸解方法為加鹽酸5 mL酸解1 h,提取效率最高。