酶輔助提取鹽膚木總?cè)乒に囇芯?/h1>
2024-05-23 02:00:16徐惠龍
北方藥學(xué) 2024年2期
賈 雯,林 瑤,徐惠龍,許 文,徐 偉
(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)
鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)是漆樹科鹽膚木屬植物,中醫(yī)藥理論認(rèn)為其有祛風(fēng)、化濕、消腫等功效,是中成藥舒冠通糖漿、復(fù)方滿山白糖漿、三七化痔丸等主要原料[1]。課題組前期研究表明,鹽膚木除了含有酚酸和黃酮外[1],還發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的三萜類成分[2-4],其三萜類成分具有良好的抗心衰和抗血栓等作用,如三萜rhuslactone,顯著改善冠心病斑馬魚心臟擴(kuò)大與靜脈竇淤血面積,治療作用與地高辛相當(dāng)[2-4],總?cè)铺崛∥镆部梢杂行б种迫私Y(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW620增殖和荷瘤小鼠腫瘤生長,表現(xiàn)良好的抗腫瘤作用[5-7]。但鹽膚木中三萜成分含量較低[4],前期開展鹽膚木三萜化學(xué)分離時(shí)發(fā)現(xiàn)其提取受到根、莖中木質(zhì)纖維的影響,提取得率較低,經(jīng)查閱文獻(xiàn),對于鹽膚木三萜類成分的提取工藝研究報(bào)道較少。
近年來,酶法已開始用于中藥中三萜類成分的輔助提取,尤其針對木質(zhì)纖維多的藥材,如靈芝中的三萜可經(jīng)纖維素酶水解細(xì)胞壁后促進(jìn)溶出[8],纖維素酶可酶解川木瓜細(xì)胞壁中的纖維素,木瓜蛋白酶能夠分解川木瓜細(xì)胞中游離蛋白,從而提高總?cè)频寐蔥9]。纖維素酶能破壞雞骨草、迷迭香等藥材的細(xì)胞壁,促進(jìn)三萜酸成分溶出[10-11]。鹽膚木根部有多層韌型木纖維,傳統(tǒng)的提取方法有效成分得率低,故本研究進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶輔助提取鹽膚木總?cè)乒に囇芯?為鹽膚木三萜類成分提取開發(fā)利用提供參考。
1 材料
1.1 儀器
電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號:DK-S24);紫外分光光度計(jì)(島津公司,日本,型號:島津UV-1800);pH計(jì)(北京明宸中寰科技有限公司,型號:ST2100/F)。
1.2 對照品及藥材
Rhuslactone對照品由實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)峰面積歸一法測定純度>98%。鹽膚木藥材經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室范世明正高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)的干燥根。
1.3 試劑
纖維素酶(50 U/mg,批號:A05GS144235);果膠酶(500 U/mg,批號:J12HS173783);半纖維素酶(20 U/mg,批號:S05M10H87186);中性蛋白質(zhì)酶(100 U/mg,批號:F25HS176360);木瓜蛋白酶(10 U/mg,批號:P10A11B110866)均購買于上海源葉生物科技公司,其他試劑為分析純。
2 方法和結(jié)果
2.1 總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線的建立和含量測定[12]
取rhuslactone對照品,加甲醇制成0.246 mg/mL溶液,作為對照品溶液。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.25、0.35、0.4、0.45 mL分別置于具塞試管中,水浴揮干,加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,60 °C水浴15 min,冰浴冷卻至室溫,吸取5.0 mL冰醋酸混勻。在最大吸收波長547 nm下測定吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo),rhuslactone質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0437X+0.0214,r=0.999 5。精密吸取鹽膚木提取上清液0.4 mL,水浴揮干,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜含量。
2.2 酶提取條件的單因素優(yōu)化
2.2.1 酶的種類選擇
稱取鹽膚木藥材5.0 g,置150 mL磨口錐形瓶中,加入16倍量純水,調(diào)節(jié)pH 5.0,改變酶的種類(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶),加入酶3000 U,以無酶組為對照,固定酶解溫度為50°C,酶解時(shí)間為60 min。酶解處理結(jié)束過濾,取濾渣加入20倍量80%乙醇溶液,回流提取2次,每次60 min,合并抽濾液,測定總體積。測定鹽膚木提取物總萜量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理所得提取物中的三萜提取量高于無酶對照組,其中纖維素酶組提取物中三萜含量最高,因此以纖維素酶提取鹽膚木總?cè)瞥煞?見圖1A。
圖1 酶提取法單因素考察結(jié)果
2.2.2 酶的添加量優(yōu)化
稱取鹽膚木藥材5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入纖維素酶,改變酶添加量(1000 U、2000 U、3000 U、4000 U、5000 U),固定酶解溫度為50°C,酶解時(shí)間為60 min。酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶的添加量為1000 U～2000 U時(shí),酶添加量與鹽膚木提取物總?cè)坪砍烧嚓P(guān),2000 U酶提取得到的鹽膚木提取物總?cè)坪孔罡?當(dāng)酶用量超過2000 U后,鹽膚木提取物總?cè)坪恐鸩浇档?見圖1B。
2.2.3 酶解酸堿度的優(yōu)化
稱取鹽膚木5.0 g,加水量同“2.2.1”,分別調(diào)節(jié)pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,加入3000 U纖維素酶,45 °C下酶解60 min,酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽膚木提取物三萜化合物的含量隨pH的增大而增加,當(dāng)pH大于5.5后,開始下降,見圖1C。
2.2.4 酶解溫度的優(yōu)化
精密稱取18份鹽膚木粗條5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入3000 U纖維素酶,分別在30、35、40、45、50、55 °C下,固定酶解時(shí)間為60 min,酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶解溫度介于30℃～45℃時(shí),酶解溫度與鹽膚木提取物三萜化合物含量成正相關(guān),酶解溫度超過 45 ℃后,轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān),見圖1D。
2.2.5 酶解時(shí)間的優(yōu)化
稱取鹽膚木5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入3000 U纖維素酶,固定酶解溫度為50 ℃,改變酶解時(shí)間(30、60、90、120、150 min),酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽膚木提取物總萜量隨酶解時(shí)間加長而增加,但當(dāng)酶解時(shí)間大于90 min后,趨于平緩,見圖1E。
2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化鹽膚木總?cè)铺崛」に?/h3>
基于單因素試驗(yàn),結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化鹽膚木總?cè)频奶崛」に?。選取酶的添加量、酶解pH值、酶解溫度及酶解時(shí)間等對鹽膚木中總?cè)铺崛〈嬖谥饕绊懙乃膫€(gè)因素為變量,鹽膚木總?cè)铺崛〉寐蕿轫憫?yīng)值,考察鹽膚木總?cè)频淖罴烟崛」に嚄l件,因素與水平表見表1,方案及結(jié)果如表2所示。
表1 因素與水平設(shè)計(jì)表
表2 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)
對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,得方程為:Y=1.17 + 0.030A-0.035B-0.012C-0.048D-9.750E-003AB-0.034AC + 0.023AD + 6.425E-003BC + 0.034BD-2.875E-003CD-0.19A2-0.13B2-0.092χ2-0.035D2,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中考察的四個(gè)因素對鹽膚木中三萜化合物的提取得率的響應(yīng)面三維立體圖結(jié)果見圖2。并對二次回歸方程進(jìn)行方差分析,發(fā)現(xiàn)在考察酶提取鹽膚木三萜的四個(gè)因素中,各因素對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笮槊附鈺r(shí)間>酶解pH值>酶的用量>酶解溫度,并且四個(gè)因素均達(dá)到顯著水平。并計(jì)算模型最優(yōu)參數(shù)為:酶的用量(A)為1 974.83 U、酶解pH值(B)為5.43、酶解溫度(C)為45.69 ℃、酶解時(shí)間(D)為75.91 min?？?cè)频寐世碚摓?.186 %。結(jié)合實(shí)際操作,調(diào)整最佳工藝:酶用量2000 U、酶解pH值5.4、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間75 min。
圖2 鹽膚木中總?cè)频寐实捻憫?yīng)面圖
2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證
以鹽膚木提取物中三萜含量為指標(biāo),按照最佳酶解工藝條件驗(yàn)證,試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算得到總?cè)破骄寐蕿?.186%,RSD為3.97%,表明實(shí)驗(yàn)所建立的二次回歸模型預(yù)測性良好,優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定性好,真實(shí)性強(qiáng),工藝穩(wěn)定可行。
3 討論
Rhuslactone是鹽膚木中含量最高的三萜、鹽膚木專屬性成分、代表性鹽膚木三萜,因此本研究選用rhuslactone作為對照品[4]。在酶提取法的單因素試驗(yàn)中,經(jīng)酶處理所得提取物中的三萜含量高于無酶對照組,其中纖維素酶提取作用最強(qiáng),這可能是由于纖維素是細(xì)胞壁中最主要的組成成分,因此纖維素酶對細(xì)胞壁的水解能力強(qiáng),而蛋白酶還作用于多糖上的糖蛋白,導(dǎo)致提取液中黏度增加,不利于三萜成分溶出[12]。酶添加量為2000 U時(shí)提取效率最高,可能原因是過量的酶會(huì)使鹽膚木中多糖物質(zhì)等大分子釋放增加,增加提取介質(zhì)的黏度,阻礙三萜化合物的溶出與擴(kuò)散,導(dǎo)致得率降低[13]。提取物中的三萜含量,隨著pH逐漸變高穩(wěn)步增加,而pH大于5.5后,提取效率快速下降,原因是不適宜纖維素酶發(fā)揮作用的pH,都會(huì)降低其活性,從而影響其水解鹽膚木細(xì)胞壁的能力,致使總?cè)铺崛×拷档蚚12]。45℃后三萜溶出明顯減少,原因是當(dāng)酶解溫度高于該酶發(fā)揮作用的適宜溫度后,酶的活性會(huì)降低[14]。隨著酶解時(shí)間加長,提取物中的三萜含量逐步增加,但時(shí)間多于90 min后趨勢轉(zhuǎn)為平緩,這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過短,則酶解過程不充分,酶解時(shí)間過長,則酶的活性降低[15]。
綜上,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本研究使用響應(yīng)面法優(yōu)化酶提取條件,確定了提取工藝中的最優(yōu)條件:選擇纖維素酶進(jìn)行酶解,添加2000 U(40 mg)纖維素酶,調(diào)節(jié)pH 5.4,45 ℃下酶解75 min。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn),該工藝合理可行。
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賈 雯,林 瑤,徐惠龍,許 文,徐 偉
(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)
鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)是漆樹科鹽膚木屬植物,中醫(yī)藥理論認(rèn)為其有祛風(fēng)、化濕、消腫等功效,是中成藥舒冠通糖漿、復(fù)方滿山白糖漿、三七化痔丸等主要原料[1]。課題組前期研究表明,鹽膚木除了含有酚酸和黃酮外[1],還發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的三萜類成分[2-4],其三萜類成分具有良好的抗心衰和抗血栓等作用,如三萜rhuslactone,顯著改善冠心病斑馬魚心臟擴(kuò)大與靜脈竇淤血面積,治療作用與地高辛相當(dāng)[2-4],總?cè)铺崛∥镆部梢杂行б种迫私Y(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW620增殖和荷瘤小鼠腫瘤生長,表現(xiàn)良好的抗腫瘤作用[5-7]。但鹽膚木中三萜成分含量較低[4],前期開展鹽膚木三萜化學(xué)分離時(shí)發(fā)現(xiàn)其提取受到根、莖中木質(zhì)纖維的影響,提取得率較低,經(jīng)查閱文獻(xiàn),對于鹽膚木三萜類成分的提取工藝研究報(bào)道較少。
近年來,酶法已開始用于中藥中三萜類成分的輔助提取,尤其針對木質(zhì)纖維多的藥材,如靈芝中的三萜可經(jīng)纖維素酶水解細(xì)胞壁后促進(jìn)溶出[8],纖維素酶可酶解川木瓜細(xì)胞壁中的纖維素,木瓜蛋白酶能夠分解川木瓜細(xì)胞中游離蛋白,從而提高總?cè)频寐蔥9]。纖維素酶能破壞雞骨草、迷迭香等藥材的細(xì)胞壁,促進(jìn)三萜酸成分溶出[10-11]。鹽膚木根部有多層韌型木纖維,傳統(tǒng)的提取方法有效成分得率低,故本研究進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶輔助提取鹽膚木總?cè)乒に囇芯?為鹽膚木三萜類成分提取開發(fā)利用提供參考。
1 材料
1.1 儀器
電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號:DK-S24);紫外分光光度計(jì)(島津公司,日本,型號:島津UV-1800);pH計(jì)(北京明宸中寰科技有限公司,型號:ST2100/F)。
1.2 對照品及藥材
Rhuslactone對照品由實(shí)驗(yàn)室自制,經(jīng)峰面積歸一法測定純度>98%。鹽膚木藥材經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室范世明正高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)的干燥根。
1.3 試劑
纖維素酶(50 U/mg,批號:A05GS144235);果膠酶(500 U/mg,批號:J12HS173783);半纖維素酶(20 U/mg,批號:S05M10H87186);中性蛋白質(zhì)酶(100 U/mg,批號:F25HS176360);木瓜蛋白酶(10 U/mg,批號:P10A11B110866)均購買于上海源葉生物科技公司,其他試劑為分析純。
2 方法和結(jié)果
2.1 總?cè)茦?biāo)準(zhǔn)曲線的建立和含量測定[12]
取rhuslactone對照品,加甲醇制成0.246 mg/mL溶液,作為對照品溶液。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.25、0.35、0.4、0.45 mL分別置于具塞試管中,水浴揮干,加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,60 °C水浴15 min,冰浴冷卻至室溫,吸取5.0 mL冰醋酸混勻。在最大吸收波長547 nm下測定吸光度值。以吸光度為縱坐標(biāo),rhuslactone質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0437X+0.0214,r=0.999 5。精密吸取鹽膚木提取上清液0.4 mL,水浴揮干,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算三萜含量。
2.2 酶提取條件的單因素優(yōu)化
2.2.1 酶的種類選擇
稱取鹽膚木藥材5.0 g,置150 mL磨口錐形瓶中,加入16倍量純水,調(diào)節(jié)pH 5.0,改變酶的種類(果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶),加入酶3000 U,以無酶組為對照,固定酶解溫度為50°C,酶解時(shí)間為60 min。酶解處理結(jié)束過濾,取濾渣加入20倍量80%乙醇溶液,回流提取2次,每次60 min,合并抽濾液,測定總體積。測定鹽膚木提取物總萜量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理所得提取物中的三萜提取量高于無酶對照組,其中纖維素酶組提取物中三萜含量最高,因此以纖維素酶提取鹽膚木總?cè)瞥煞?見圖1A。
圖1 酶提取法單因素考察結(jié)果
2.2.2 酶的添加量優(yōu)化
稱取鹽膚木藥材5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入纖維素酶,改變酶添加量(1000 U、2000 U、3000 U、4000 U、5000 U),固定酶解溫度為50°C,酶解時(shí)間為60 min。酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶的添加量為1000 U～2000 U時(shí),酶添加量與鹽膚木提取物總?cè)坪砍烧嚓P(guān),2000 U酶提取得到的鹽膚木提取物總?cè)坪孔罡?當(dāng)酶用量超過2000 U后,鹽膚木提取物總?cè)坪恐鸩浇档?見圖1B。
2.2.3 酶解酸堿度的優(yōu)化
稱取鹽膚木5.0 g,加水量同“2.2.1”,分別調(diào)節(jié)pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,加入3000 U纖維素酶,45 °C下酶解60 min,酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽膚木提取物三萜化合物的含量隨pH的增大而增加,當(dāng)pH大于5.5后,開始下降,見圖1C。
2.2.4 酶解溫度的優(yōu)化
精密稱取18份鹽膚木粗條5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入3000 U纖維素酶,分別在30、35、40、45、50、55 °C下,固定酶解時(shí)間為60 min,酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶解溫度介于30℃～45℃時(shí),酶解溫度與鹽膚木提取物三萜化合物含量成正相關(guān),酶解溫度超過 45 ℃后,轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)相關(guān),見圖1D。
2.2.5 酶解時(shí)間的優(yōu)化
稱取鹽膚木5.0 g,加水量同“2.2.1”,調(diào)節(jié)pH 5.0,加入3000 U纖維素酶,固定酶解溫度為50 ℃,改變酶解時(shí)間(30、60、90、120、150 min),酶解處理結(jié)束過濾,同“2.2.1”進(jìn)行總?cè)铺崛?進(jìn)行鹽膚木提取物總萜量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽膚木提取物總萜量隨酶解時(shí)間加長而增加,但當(dāng)酶解時(shí)間大于90 min后,趨于平緩,見圖1E。
2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化鹽膚木總?cè)铺崛」に?/h3>
基于單因素試驗(yàn),結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化鹽膚木總?cè)频奶崛」に?。選取酶的添加量、酶解pH值、酶解溫度及酶解時(shí)間等對鹽膚木中總?cè)铺崛〈嬖谥饕绊懙乃膫€(gè)因素為變量,鹽膚木總?cè)铺崛〉寐蕿轫憫?yīng)值,考察鹽膚木總?cè)频淖罴烟崛」に嚄l件,因素與水平表見表1,方案及結(jié)果如表2所示。
表1 因素與水平設(shè)計(jì)表
表2 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)
對表1數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,得方程為:Y=1.17 + 0.030A-0.035B-0.012C-0.048D-9.750E-003AB-0.034AC + 0.023AD + 6.425E-003BC + 0.034BD-2.875E-003CD-0.19A2-0.13B2-0.092χ2-0.035D2,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中考察的四個(gè)因素對鹽膚木中三萜化合物的提取得率的響應(yīng)面三維立體圖結(jié)果見圖2。并對二次回歸方程進(jìn)行方差分析,發(fā)現(xiàn)在考察酶提取鹽膚木三萜的四個(gè)因素中,各因素對總?cè)铺崛×康挠绊懗潭却笮槊附鈺r(shí)間>酶解pH值>酶的用量>酶解溫度,并且四個(gè)因素均達(dá)到顯著水平。并計(jì)算模型最優(yōu)參數(shù)為:酶的用量(A)為1 974.83 U、酶解pH值(B)為5.43、酶解溫度(C)為45.69 ℃、酶解時(shí)間(D)為75.91 min?？?cè)频寐世碚摓?.186 %。結(jié)合實(shí)際操作,調(diào)整最佳工藝:酶用量2000 U、酶解pH值5.4、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間75 min。
圖2 鹽膚木中總?cè)频寐实捻憫?yīng)面圖
2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證
以鹽膚木提取物中三萜含量為指標(biāo),按照最佳酶解工藝條件驗(yàn)證,試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算得到總?cè)破骄寐蕿?.186%,RSD為3.97%,表明實(shí)驗(yàn)所建立的二次回歸模型預(yù)測性良好,優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定性好,真實(shí)性強(qiáng),工藝穩(wěn)定可行。
3 討論
Rhuslactone是鹽膚木中含量最高的三萜、鹽膚木專屬性成分、代表性鹽膚木三萜,因此本研究選用rhuslactone作為對照品[4]。在酶提取法的單因素試驗(yàn)中,經(jīng)酶處理所得提取物中的三萜含量高于無酶對照組,其中纖維素酶提取作用最強(qiáng),這可能是由于纖維素是細(xì)胞壁中最主要的組成成分,因此纖維素酶對細(xì)胞壁的水解能力強(qiáng),而蛋白酶還作用于多糖上的糖蛋白,導(dǎo)致提取液中黏度增加,不利于三萜成分溶出[12]。酶添加量為2000 U時(shí)提取效率最高,可能原因是過量的酶會(huì)使鹽膚木中多糖物質(zhì)等大分子釋放增加,增加提取介質(zhì)的黏度,阻礙三萜化合物的溶出與擴(kuò)散,導(dǎo)致得率降低[13]。提取物中的三萜含量,隨著pH逐漸變高穩(wěn)步增加,而pH大于5.5后,提取效率快速下降,原因是不適宜纖維素酶發(fā)揮作用的pH,都會(huì)降低其活性,從而影響其水解鹽膚木細(xì)胞壁的能力,致使總?cè)铺崛×拷档蚚12]。45℃后三萜溶出明顯減少,原因是當(dāng)酶解溫度高于該酶發(fā)揮作用的適宜溫度后,酶的活性會(huì)降低[14]。隨著酶解時(shí)間加長,提取物中的三萜含量逐步增加,但時(shí)間多于90 min后趨勢轉(zhuǎn)為平緩,這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過短,則酶解過程不充分,酶解時(shí)間過長,則酶的活性降低[15]。
綜上,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本研究使用響應(yīng)面法優(yōu)化酶提取條件,確定了提取工藝中的最優(yōu)條件:選擇纖維素酶進(jìn)行酶解,添加2000 U(40 mg)纖維素酶,調(diào)節(jié)pH 5.4,45 ℃下酶解75 min。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn),該工藝合理可行。
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