不同光照時長處理對柚果皮有色層香豆素代謝的影響

摘" " 要：柚是我國南方地區重要的水果，表皮富含大量的香豆素，極易受到外界環境的影響，但其光響應效果尚不明確。為探究香豆素在柚表皮中的光響應機制，通過設置12、24、36、48 h共4個不同光照時長處理來探究光照對柚果皮有色層香豆素代謝的影響。本研究以貢水白柚和矮晚柚為試材，采用靶向代謝組學的檢測方法共檢測到21種香豆素，隨后對貢水白柚、矮晚柚對照組和處理組果皮有色層中香豆素的代謝差異進行比較分析。結果表明：在貢水白柚和矮晚柚果皮有色層共同積累的21種香豆素中，相對含量較高且存在顯著差異的香豆素為佛手柑素、橙皮油內酯、蛇床子素。不同光照時長處理對貢水白柚果皮有色層中佛手柑素、橙皮油內酯、蛇床子素、總香豆素的積累有顯著影響，對矮晚柚果皮有色層中王草酚、佛手柑素、橙皮油內酯、蛇床子素、總香豆素的積累有顯著影響。通過PCA分析顯示，經過不同光照時長處理的貢水白柚和矮晚柚果皮有色層中總香豆素的相對含量被明顯區分開。綜上，光照處理會改變貢水白柚和矮晚柚果皮有色層中香豆素的積累特征，并且矮晚油相較貢水白柚大量積累王草酚和二氫歐山芹素。以上研究結果為揭示光照對柑橘香豆素代謝的調節機制奠定了基礎，為提升柑橘藥用品質提供了全新的思路。

關鍵詞：柚；果皮；香豆素；光照時間；靶向代謝組學

中圖分類號：S666.3" " " " "文獻標識碼：A" " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.03.001

Effect of Treatments at Different Light Time on Coumarin Metabolism in Colored Layer of Pomelo Pericarp

LEI Xu1，2，HUANG Dijie2，ZHOU Qingqing2，DENG Zhijun1，2，3，DENG Shiming1，2，3，MOU Jiaolin1，2，3

（1.Hubei Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization，Hubei Minzu University，Enshi，Hubei 445000， China；2.College of Forestry and Horticulture，Hubei Minzu University，Enshi，Hubei 445000， China；3.Research Center for Germplasm Engineering of Characteristic Plant Resources in Enshi Prefecture，Hubei Minzu University，Enshi，Hubei 445000， China）

Abstract： Pomelo， a significant fruit in southern regions， contains coumarin-rich pericarp highly influenced by the external environment. However， the impact of light on coumarin metabolism remains unclear. This study conducted four light time treatments （12 h， 24 h， 36 h， and 48 h） to investigate light's effect on coumarin metabolism in the colored layer of pomelo pericarp. Gongshui white pomelo and dwarf-late pomelo were utilized as test materials， with 21 coumarins detected through targeted metabolomics. Following this， pericarps were colored in control and treatment groups for comparative analysis of coumarin metabolic differences. The results indicated that bergamottin， aurapten and osthol were among the coumarins with high content and significant differences in the colored layer of Gongshui white pomelo and dwarf-late pomelo pericarps. Different light time significantly influenced the accumulation of bergamottin， aurapten，osthol and total coumarin in Gongshui white pericarp's colored layer. Additionally， osthenol， bergamottin， aurapten， osthol and total coumarin accumulation were notably affected in dwarf-late pomelo pericarp's colored layer. PCA analysis revealed distinct relative content of total coumarin in the colored layer of Gongshui white pomelo and dwarf-late pomelo treated with different light times. Overall， light treatment altered the coumarin accumulation characteristics in the colored layer of Gongshui white pomelo and dwarf-late pomelo， with dwarf-late pomelo showing higher osthenol and columbianetin accumulation compared to Gongshui white pomelo. These findings provide a basis for understanding the regulatory mechanism of light on citrus coumarin metabolism，it provides a new idea for improving the medicinal quality of citrus.

Key words： polemo; pericarp; coumarin; light time; targeted metabolomics

柑橘是世界上經濟價值較高的果樹之一，在我國南方地區廣泛種植[1]。柑橘育種工作發展迅速，造就了豐富多樣的柑橘市場結構。目前市場上主要的經濟柑橘類型包括：寬皮柑橘、甜橙、檸檬、柚等。其中柚歷史悠久，不論果實大小、果皮有色層厚度還是果肉顏色等較其他柑橘類型均呈現出明顯特征。除此之外，柚還富含多種營養元素和代謝產物[2]。研究表明，柚果皮中不僅富含維生素、水分、礦物質，還含有類黃酮、揮發油、檸檬苦素、香豆素等生理活性較高的成分，擁有極高的營養價值和藥用價值[3]。

香豆素是柑橘重要的次級代謝產物之一，由苯丙烷代謝途徑合成[4]。其基本母核為α-苯并吡喃酮，根據結構的不同通常被分為簡單香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素、雙香豆素，以及異香豆素等[5]。香豆素在植物生理生化過程中起到重要作用，可作為植保素和生長調節劑促進植物的生長發育[6]。同時，它還具有抗菌[7]、抗病毒[8]，以及抗癌[9]等藥理學價值。另外，其在化妝品加工[10]、香精制作[11]，以及熒光材料生產[12]等方面都得到了廣泛應用。另一方面，香豆素表現出了一定的毒性作用，食用含有呋喃香豆素的飲料或食物會產生光毒性效應[13]。在臨床醫學中發現，呋喃香豆素對細胞色素P450存在抑制作用，可能導致血液中藥物濃度增加，產生副作用，這種現象被稱為“葡萄柚效應”[14]。在很長一段時間該效應成為制約柑橘產業發展的決定性因素。香豆素功能具有“雙面性”，使其成為當前研究的熱門次級代謝產物。

香豆素并非在植物界中廣泛分布，它僅在蕓香科、傘形科、豆科，以及菊科等植物中大量積累[15]。研究表明，香豆素在柑橘中的積累呈現出明顯的組織和品種特異性。柑橘果皮相較于其他組織大量積累香豆素[16]。六大類柑橘中，柚類中香豆素積累較高且具有極高的生物活性[17]，因此研究柚類中目標香豆素的定向調控，對提升柚類經濟價值，降低消費者食用柚的擔憂具有重要意義。

次級代謝產物被認為是植物長期進化過程中對生態環境適應的結果[18]，其生物合成通常受到遺傳和環境因子（光照、水分、溫度、干旱等）的共同調控[19-21]。光照作為一種非生物非侵入性激發因子以及作為環境因子中不可缺少的組成部分，對促進植物中次級代謝產物合成起著重要作用[22]。光照強度和波長在選擇性觸發植物體內次級代謝產物生物合成途徑中起著至關重要的作用[23]。代謝組學為分析植物中多種小分子代謝物提供了有力工具，基因組學研究可以從分子層面揭示植物代謝合成和調控機理，代謝物是基因表達的最終產物，因此二者緊密聯系[24]。基因啟動子上諸多調節元件受外界環境條件的影響，其表達被誘導后可直接改變植物中代謝積累水平[25]，根據植物種類的不同，人們已經可以通過優化光質和光照時長來誘導期望的代謝重編程，從而增強靶向代謝產物的生物合成[26]。由此可見，利用不同的光照處理（如波長、光強、光照時長、光質等）能夠實現代謝產物的精準調控。Gong等[27]研究表明，藍光處理可以促進桃果實中乙烯的生成，從而加速果實的成熟。Hu等[28]利用LED光照可顯著提高甜橙果實中蔗糖含量。Xu等[29]通過藍光照射12 d，提高了貯藏期草莓果實中總花青苷含量。Evaristo等[30]研究發現，光周期顯著影響了薇甘菊葉和莖中香豆素的含量，相較于其他時長，16 h光照下，薇甘菊葉和莖中香豆素含量最高。雖然近年來光照對植物代謝產物產生影響相關的研究較為深入，但是與光照對柑橘中香豆素代謝影響相關的研究鮮有報道。

本研究選取貢水白柚和矮晚柚為研究對象。二者是柚類中極具特色的品種，貢水白柚為恩施土家族苗族自治州宣恩縣農業部門經過多年選育篩選出來的一個酸甜型中熟柚類品種，經多年實踐已成為當地優質特色品種[31]。矮晚柚為四川省遂寧市名優果樹研究所從晚白柚中選育出的芽變新品種，屬于全球唯一特晚熟柚類新品種，在恩施州大面積栽培[32]。二者皆是研究植物香豆素代謝基礎與生物活性的優質材料。

綜上所述，本研究利用靶向代謝組學，基于貢水白柚和矮晚柚建立香豆素檢測方法，探究不同光照時長處理對貢水白柚和矮晚柚果皮有色層香豆素代謝的影響，通過分析不同光照時長處理下2個柑橘品種有色層香豆素的差異，揭示光照與柑橘香豆素代謝之間的關聯。本研究將為人為調控柑橘次級代謝產物生物合成，解析柑橘香豆素代謝的遺傳機理，以及促進柑橘品質提升提供思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究選取的植物材料是湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣李家河鎮貢水白柚種植中心的貢水白柚和湖北民族大學林學園藝學院柑橘種植園的矮晚柚。貢水白柚、矮晚柚均采摘于花后240 d，各采摘15個。設置對照組和12、24、36、48 h共4個不同光照時長處理組。每組設置3個生物學重復。

1.2 儀器與試劑

LED光照培養箱（杭州匯爾儀器設備有限公司）、冷凍干燥機（GOLD—SIM）、高速冷凍離心機（上海力申科學儀器有限公司）、超純水儀（優普）、高效液相色譜串聯三重四級桿質譜 LC-TQMS（Altis，Thermo Fisher Scientific，California，USA）、色譜級甲醇（DIKMA）以及21種香豆素標準品（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 光照處理與樣品收集

貢水白柚和矮晚柚均選自多年栽培、生長狀況良好的果樹，并從不同方位進行采摘。光照培養箱（白光）設置光照強度為5 000 lx，溫度為25 ℃。使用解剖刀削取對照組和處理組柚果皮赤道面有色層，立即用液氮凍存后放入凍干機中進行真空冷凍干燥，將樣品研磨成粉末，置于-80 ℃超低溫條件下保存，等待后續樣品的提取與檢測。

1.4 樣品提取

稱取100 mg凍干粉末，裝入2 mL試管中，加入75%甲醇水溶液1 mL，上下顛倒混勻，渦旋30 s，放入4 ℃冰箱中靜置過夜；取出試管，在溫度為4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min；用1 mL無菌注射器吸取上清液，經0.22 μm孔徑有機濾膜過濾后裝入進樣瓶。

1.5 香豆素檢測方法建立和樣品檢測

分別稱取0.1 mg標準品粉末，用10 mL純色譜級甲醇溶解，通過LC-TQMS的“OPTIMIZATION”模塊，分別對每個標準品進行優化，采集最佳碰撞能、3組最優母離子/子離子對、保留時間等信息。隨后將標準品按照等濃度等體積混合后，與提取好的樣品一起進行檢測。高效液相色譜的流動相體系：0.1%甲酸水（A相）和甲醇（B相）；洗脫梯度：0～0.5 min，98%A；0.5～15 min，70% A；15～28 min，2% A；28.1～30 min，98%A；流速：0.4 mL·min-1。

1.6 數據處理與分析

貢水白柚和矮晚柚所有樣品的提取液混合物進行平均后的樣品即為質量控制（QC）。按照每5個待測樣品間隔插入1個QC樣品進行序列編排。借助軟件Xcalibur自動積分和手動調整積分相結合的方法獲得準確的峰面積值，即為原始峰面積。每個特征峰的峰面積值除以2個相鄰間隔QC對應特征峰的平均峰面積值，得到的數據即為可用于后續分析的代謝物校正后的相對含量。本研究利用軟件GraphPad Prism繪制柱形圖，采用軟件IBM SPSS Statistics 27.0進行單因素方差分析及多重比較和t檢驗（Plt;0.05），利用軟件TBtools繪制聚類熱圖，主成分分析（Principal ComponentsAnalysis，PCA）利用在線軟件ChiPlot完成（https：//www.chiplot.online/）。

2 結果與分析

2.1 香豆素檢測方法建立

為了全面解析柑橘香豆素代謝規律，筆者通過靶向代謝組學，優化檢測條件后，建立了能夠同時檢測21種香豆素的方法，詳細信息見表1。

2.2 貢水白柚與矮晚柚有色層香豆素積累特征比較分析

為了探究貢水白柚和矮晚柚有色層中香豆素的代謝積累特征和變異規律，本研究分別對未進行光照處理的2個品種的有色層進行了21種香豆素的檢測。結果表明，2種柚子有色層中以共同積累佛手柑素（bergamottin）、佛手柑內酯（bergapten）、橙皮油內酯（aurapten）、蛇床子素（osthol）為主，其中佛手柑素、橙皮油內酯和蛇床子素在二者間存在顯著差異，貢水白柚有色層中佛手柑素、橙皮油內酯相對含量均顯著高于矮晚柚，蛇床子素相對含量顯著低于矮晚柚，佛手柑內酯不存在顯著差異（圖1-A至圖1-D）。除此之外，矮晚柚還積累較高的王草酚（osthenol）和二氫歐山芹素（columbianetin）。21種香豆素相對含量的熱圖和聚類分析能將貢水白柚和矮晚柚的不同重復區分開，表明二者有色層香豆素積累模式是存在差異的（圖1-E）。

2.3 不同光照時長對貢水白柚有色層中香豆素代謝的影響

為探究不同光照時長處理對柚果皮有色層中香豆素代謝的影響以及不同柚子品種受到的影響是否一致，本研究設置了1個對照組和4個不同光照時長梯度處理組對貢水白柚和矮晚柚進行處理。通過對處理后的貢水白柚有色層進行香豆素的提取和檢測，結果發現光照處理對貢水白柚有色層中佛手柑素、橙皮油內酯和蛇床子素3種主要香豆素的相對含量均有顯著的促進作用（（圖2-A至圖2-C）。但3種香豆素的最強響應光照時長并不一致，佛手柑素和橙皮油內酯響應最強的光照時長為48 h，而蛇床子素響應最強的光照時長為24 h。佛手柑內酯在接受光照處理后，其相對含量呈現下降的趨勢，但無顯著差異，其響應最強的光照時長為24 h（圖2-D）。

貢水白柚4種主要香豆素的總相對含量在光照處理組中均顯著高于對照組（圖2-E）。總香豆素響應最強的光照時長為48 h。進一步對不同處理中香豆素總相對含量進行PCA分析，結果發現對照組跟4個光照處理組明顯區分開，說明光照處理會改變貢水白柚有色層的香豆素代謝積累特征（圖2-F）。

2.4 不同光照時長對矮晚柚有色層中香豆素代謝的影響

筆者進一步對光照處理后的矮晚柚有色層進行了香豆素的提取和檢測。結果發現，不同光照時長對矮晚柚有色層中6種主要香豆素的相對含量均有促進作用，接受了光照處理的矮晚柚有色層中香豆素相對含量均高于對照組（除36 h處理后的佛手柑內酯）（圖3-A至圖3-F），且6種香豆素總相對含量在光照處理組中的含量均顯著高于對照組（圖3-G）。但不同香豆素對光照時長的響應呈現出不同的特征。佛手柑素、蛇床子素和二氫歐山芹素表現出極為相似的響應特征，36 h為響應最強的光照時長。而王草酚和佛手柑內酯的變化模式也十分相似，12 h為響應最強的光照時長。橙皮油內酯則隨著光照時長的延長，相對含量持續增加，即48 h為響應最強的光照時長。進一步對不同組中6種香豆素的總相對含量進行PCA分析，結果發現對照組與4個光照處理組明顯區分開，進一步說明光照處理同樣會改變矮晚柚有色層的香豆素代謝積累特征（圖3-H）。

綜上所述，在貢水白柚和矮晚柚中，光照處理均能促進總香豆素相對含量的顯著增加。同時，對絕大多數香豆素的積累會產生促進作用，僅貢水白柚中的佛手柑內酯相對含量出現下降，但是并不顯著。同一種香豆素在貢水白柚和矮晚柚中響應最強光照的時長并不完全一致，僅有橙皮油內酯表現出了相同的響應特征，均在48 h時響應最強。

3 討論與結論

3.1 苯丙烷代謝

苯丙烷代謝是植物重要的代謝途徑之一。莽草酸途徑中的骨架結構經過有效修飾形成了苯丙烷代謝產物的多樣性[33]。苯丙烷代謝途徑主要包括類黃酮代謝途徑、木質素代謝途徑和香豆素代謝途徑，由于上述3類代謝物共用苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和4-香豆酸-CoA連接酶（4CL）3種酶，因此香豆素的代謝積累水平在一定程度上與類黃酮和木質素代謝密切關聯[34]。

3.2 苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是廣泛存在于植物苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶，也是苯丙烷代謝途徑中研究最多的酶[35]。研究表明，Endo等[36]通過連續藍光照射煙草，誘導了煙草PAL的高表達；Wang等[37]發現黃瓜在紫光和藍光照射下，PAL表達水平更高；Ye等[38]發現，遮蔭處理顯著下調了茶葉中PAL的表達水平；Ballester等[39]和Lafuente等[40]研究表明LED藍光不僅可以激活柑橘類水果中的PAL活性和苯丙烷代謝，同時還可抑制檸檬烯的分解代謝，并引發苯丙氨酸衍生物的變化，增加類黃酮含量[40]。以上研究均表明，光照處理對苯丙烷代謝水平和相關基因的表達水平均有促進作用，這與本研究中光照處理可促進香豆素代謝的結果一致。不同香豆素對光照時長呈現出的差異響應特征很可能是基因受環境因子影響后特異性表達的綜合結果。

3.3 香豆素的檢測

代謝物檢測隨著代謝組學的發展和代謝檢測平臺的更新逐漸兼具高效化、精準化和系統化特征[41]。前期研究報道，針對柑橘香豆素類化合物的檢測手段主要有高效液相色譜（HPLC）法、超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）法、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法、氣相色譜（GC）法、氣相色譜-質譜（GC-MS）法、氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）法等[42]。Dugrand等[14]通過UPLC-MS法在6個品種的柑橘果皮有色層提取物中成功檢測并定量出6種香豆素和21種呋喃香豆素；Li等[40]通過HPLC法測定了4類柑橘汁中的6種香豆素和6種呋喃香豆素；Arigò等[44]通過HPLC-MS/MS法與線性保留指數系統相結合，共在8個品牌的柑橘類飲料中檢測出19種呋喃香豆素和9種香豆素。前期本課題組利用廣泛靶向代謝組學的方法也成功檢測到8種香豆素代謝物。上述方法鑒定到的香豆素物質結構大多是依據數據庫比對得到的，結構準確性不高。根據香豆素來源的廣泛性，本研究直接選取21種香豆素物質進行標準品優化和數據庫構建，對柑橘樣品進行靶向檢測的方法保證了數量和定性的準確性。

本研究基于靶向代謝組學，探究不同光照時長處理對貢水白柚和矮晚柚有色層中香豆素代謝的影響，結果發現光照能顯著增加柚有色層中香豆素的積累，下一步將對不同柑橘類別進行系統探究才能更加全面揭示光照對柑橘香豆素代謝的影響。本研究對不同光照時長處理柚有色層中香豆素代謝的影響進行了初步探究，為光照對柑橘次級代謝產物的調節機制研究及柑橘藥用品質和經濟價值的提升提供了重要依據和指導。

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