高血壓與高血壓合并干燥綜合征患者血清蛋白質差異表達研究

馬慧敏，蔡昕添，阿依古再麗·艾合買提，朱 晴，吳 婷，夏衣熱·艾爾肯，王夢卉，李南方，張德蓮

（1.新疆維吾爾自治區人民醫院高血壓中心，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆高血壓研究所，新疆 烏魯木齊 830001；3.國家衛生健康委高血壓診療研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830001；4.新疆維吾爾自治區重點實驗室“新疆高血壓病研究實驗室，新疆 烏魯木齊 830001；5.新疆高血壓（心腦血管）疾病臨床醫學研究中心，新疆 烏魯木齊 830001）

高血壓是一種心血管綜合征，其特征是全身循環動脈壓（收縮壓和/或舒張壓）升高。它常與其他心血管危險因素并存，可損害心臟、大腦、腎臟等重要器官的結構和功能。目前，高血壓仍然是心腦血管疾病最重要的危險因素［1］。

研究表明高血壓與自身免疫性疾病密切相關，兩者之間可能存在相互影響［2］。自身免疫性疾病是指人體對自身抗原發生免疫反應后導致自身組織自我損害引起的疾病［3］。一些研究表明，自身免疫性疾病與血管炎癥和內皮功能障礙相關［4］，可能對高血壓的發展產生影響。高血壓本身也涉及到血管功能和炎癥反應的異常，因此，自身免疫性疾病可能進一步加劇了血管的炎癥狀態，導致血壓升高［5，6］。干燥綜合征（Sjogren's syndrome，SS）是常見的自身免疫性疾病，其主要表現為外分泌腺（主要是唾液腺和淚腺）的癥狀和體征功能障礙。SS 患者體內液體分泌減少，這可能導致血管內皮功能障礙，從而加重了高血壓的發生風險［7］。研究表明高血壓合并SS 時發生心腦血管事件的風險顯著增加［8］。研究發現在SS 人群中高血壓的患病最高可達37.3%［9］。有研究發現SS 患者的高血壓患病率高于年齡和性別匹配的健康對照組［10］。目前大量證 據 表 明 高 血 壓 與SS 密 切 相 關［11］，但 具 體 發 病 機制尚不明確。

本研究利用基于DIA-MS 蛋白質組學方法，對高 血 壓 伴 干 燥 綜 合 征（hypertensive with Sjogren's syndrome，SH）患者和不伴干燥綜合征的原發性高血壓（essential hypertensive，EH）患者的差異蛋白質進行鑒定，以期為SH 的發病機制提供新的認識。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選 擇2017 年1 月～2018 年12 月 期 間 就 診 于 新疆維吾爾自治區高血壓診療中心的患者。

1.2 診斷標準

1.2.1 高血壓診斷標準 根據美國心臟學會指南：（1）收縮壓≥140 mmHg 和或舒張壓≥90 mmHg，三次均未服用降壓藥物；（2）有抗高血壓病史的高血壓患者。（3）利用生化指標排除其他繼發性高血壓，包括原發性醛固酮增多癥、庫欣綜合征、嗜鉻細胞瘤、腎實質高血壓、腎血管性高血壓、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征。診斷為EH［12］，同時排除罹患自身免疫性疾病如血管炎、狼瘡、類風濕關節炎、系統性硬化、自身免疫性肝炎、橋本甲狀腺炎、惡性腫瘤、急慢性感染和感染性疾病的患者。對于符合以上標準且臨床資料完整的患者均納入EH 患者組。

1.2.2 原發性SS 診斷標準 根據中華醫學會風濕病學分會2023 年發布的原發性SS 的分類標準［13］：入選標準：至少有眼干或口干癥狀之一的患者，即下列至少一項為陽性：（1）每日感到不能忍受的眼干，持續3 個月以上；（2）眼中反復沙礫感；（3）每日需用人工淚液3 次或3 次以上；（4）每日感到口干，持續3 個月以上；（5）吞咽干性食物需要頻繁飲水幫助。排除標準：可能有重疊的臨床表現或干擾診斷的試驗結果，出現下述疾病，應予排除：（1）頭頸部放療史；（2）活動性丙型肝炎病毒感染；（3）獲得性免疫缺陷綜合征；（4）結節病；（5）淀粉樣變性；（6）移植物抗宿主病；（7）IgG4 相關疾病。滿足上述入選標準和排除標準者，且下述五項評分總和≥4 分者診斷為pSS：（1）唇腺灶性淋巴細胞浸潤，且灶性指數≥1 個灶/4 mm2，計3 分；（2）血清抗SSA 抗體陽 性，計1 分；（3）至 少 單 眼OSS≥5 分 或Van Bijsterveld 評分≥4 分，計1 分；（4）至少單眼Schirmer試驗≤5 mm/5 min，計1 分；（5）未刺激的全唾液流率≤0.1 mL/min，計1 分。當診斷為患者同時診斷為SH 且臨床資料完整，排除繼發性高血壓、感染、腫瘤；排除其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、系統性硬化癥、自身免疫性肝炎、橋本甲狀腺炎等。排除惡性腫瘤、急慢性感染和感染性疾病后納入SH 組，SH 患者均進行檢測了C 反應蛋白、補體C3、C4 以及相關自身免疫性抗體（包括ANA、抗-SSA、抗-SSB、 RO-52）。

根據上述標準，選擇8 例原發性高血壓無SS 的患者為EH 組和8 例高血壓伴SS 患者為SH 組，收集納入患者生化指標。

1.3 血液樣本采集

收集患者的血清樣本，在室溫放置凝結，在4 ℃下以3 000 r/min 離心15 min。離心后取出血清，在-80 ℃環境保中存備用，

1.4 DIA 蛋白定量

1.4.1 主要試劑 試劑（盒）：SDT 緩沖液：4%十二烷基硫酸鈉，100 mmol/L 二硫蘇糖醇，150 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl） pH 8.0；尿酸緩 沖 液：8 mol/L 尿 素，150 mmol/L Tris-HCl pH 8.5；BCA 蛋白質測定試劑盒；碘乙酰胺（100 mmol/L 吲哚-3-乙酸在尿酸緩沖液中）；緩沖液A （10 mmol/L HCOONH4， 5% ACN， pH 10.0）；緩 沖 液B（10 mmol/L HCOONH4，85% ACN，pH 10.0）。

1.4.2 樣品制備及蛋白質酶解 取血清樣本，加入SDT 緩沖液，14 000g離心20 min，獲得上清液，使用BCA 蛋白質分析試劑盒進行蛋白定量。每個樣本 取200 μg 逐 步 加 入30 μL SDT 緩 沖 液，100 mmol/L 的碘乙酰胺，UA 緩沖液及TEAB 緩沖液獲得蛋白懸液。后加入蛋白酶酶解獲得多肽。

1.4.3 反相（RP）色譜法分離多肽 采用Agilent 1260 infinity IIHPLC 進 行RP 色 譜 分 離。用 緩 沖 液A 稀釋肽混合物，并上樣于液相色譜柱（XBridge peptide BEH C18 Column， 130?，5 μm， 4.6 mm×100 mm）。多肽以1 mL/min 的流速洗脫，液相梯度：0%～7% B，5 min，7%～40% B，5～40 min，40%～100%B，45～50 min， 100% B，50～65 min。通過測量214 nm 吸光度監測洗脫過程，每1 分鐘收集一次，收集的多肽在45 ℃的高速真空中干燥，干燥后的樣本在0.1%的甲酸中重新溶解，并合并成12 個組分。

1.4.4 DDA 及DIA 分析 將2 μL 10×iRT 多肽加入6 μL 多肽溶液中。然后將混合物注入Q-Exactive HF-X（Thermo Fisher Scientific）中，并用梯度緩沖液B（80%乙腈和0.1%甲酸）以300 nL/min 的流速分離。

DDA 分析質譜儀參數設置如下：（1）MS：掃描范圍（m/z）=350～1 500；分辨率=60 000；AGC 目標=3E6；最大離子注入時間=50 ms；包括電荷狀態＝2～7；過濾動態排除：排除持續時間=30 s；（2）dd-MS2：隔 離 窗 口=1.6m/z，分 辨 率=15 000；AGC 目標=1E5；最大離子注入時間=45 ms；NCE=28%。

DIA 分析質譜儀參數設置如下：（1）MS：掃描范圍（m/z）=350～1 500；分辨率=60 000；AGC 目標=3E6；最大離子注入時間=50 ms；（2）DIA：分辨率=30 000；AGC 目標=1E6；最大離子注入時間=AUTO；NCE=28%。 原 始 數 據 由SpectrAert Pulsar X（版本12，Biognosys AG）處理和分析，參數為BGS 出廠設置，Q-value（FDR）閾值為1%。

1.5 生物信息學分析

采用DIA 蛋白質組學方法對差異表達蛋白質進行鑒定。在SH、EH 組中選擇倍數變化（FC）＞1.20 或＜0.83 且P＜0.05 的蛋白質作為差異表達蛋白質（FC＞1.2 為上調蛋白）。利用GO 和KEGG 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）對差異表達蛋白質進行生信學分析。

FDR 用于評估GO 項或KEGG 途徑的差異蛋白富集度的顯著水平。使用String 據庫構建蛋白質相互作用網絡（PPI）。使用Cytoscape 進行模塊化分析，得到得分最高的核心模塊。最后結合DIA 定量結果和KEGG 通路分析結果，從核心模塊包含的蛋白質中篩選出關鍵蛋白質。

1.6 統計學處理

采用SPSS 軟件23.0 進行統計分析，用Origin和Excel 軟件建立曲線圖。正態分布的數據使用t檢驗，用（±s）表示。非正態分布的數據使用非參數檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 基線特征

EH 患者平均年齡（45.9±7.1）歲，SH 患者平均年 齡（53.8±11.7）歲，差 異 無 統 計 學 意 義（P＞0.05），兩組的基線數據如表1 所示。

表1 研究對象的基線特征Tab 1 Baseline characteristics of the subjects

2.2 血清中差異表達蛋白質

EH 組與SH 組差異表達的蛋白有35 個，其中32 個蛋白表達上調，3 個蛋白表達下調（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 差異表達蛋白的火山圖Fig 1 Volcano map of differentially expressed proteins

圖2 差異表達蛋白熱圖Fig 2 Heat map of differentially expressed protein

2.3 GO 富集度分析

分析結果提示SH 組與EH 組相比，差異表達蛋白在細胞組分中主要位于細胞外區域，在生物過程集中在血小板減少、免疫應答、信號通路、補體激活（經典途徑）、蛋白水解、受體介導的內吞作用、絲氨酸型內肽酶活性和抗原結合等過程中。分子功能中主要集中在抗原結合和絲氨酸型內肽酶活性過程。GO 分析結果如圖3 所示。

圖3 差異蛋白的GO 富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of differential proteins

2.4 差異表達蛋白KEGG 途徑的富集分析

對上述差異蛋白進行KEGG 信號通路富集分析，相關差異蛋白在以下幾個方面顯著富集：補體和凝血級聯、系統性紅斑狼瘡和朊病毒病。KEGG分析的結果如圖4 所示。

圖4 差異表達蛋白KEGG 通路的富集分析Fig 4 Enrichment analysis of differentially expressed protein KEGG pathway

2.5 蛋白質相互作用網絡和模塊化分析

為了更好地預測蛋白質之間的相互作用，本課題組構建了PPI 網絡來識別最重要的蛋白質。使用STRING 數據庫，選擇蛋白質相互作用得分為≥0.4的蛋白質節點，并刪除未連接的節點。PPI 圖是用Cytosscape 繪制的。使用MCODE 插件對蛋白質相互作用網絡進行分析，并根據MCODE 聚類條件（Score=6.667）選擇得分最高的核心模塊。如圖5所示，紅色圓圈代表核心模塊中的蛋白質。與其他蛋白質相比，這7 種蛋白質在整個蛋白質相互作用網絡中具有更強的相互作用。表2 總結了這七種蛋白質在兩組之間的差異倍數。VWF、A2M 和F9 在補體和凝血級聯途徑中均顯著富集，且兩組間表達差異顯著。結合DIA 定量結果和KEGG 通路分析結果，我們篩選出與高血壓合并SS 相關的3 個關鍵蛋白：血管性血友病因子（Von Willebrand factor，VWF）， α-2-巨 球 蛋 白（Alpha-2-Macroglobulin，A2M）， 凝血因子Ⅸ（FⅨ，F9）。

圖5 蛋白質相互作用網絡和模塊化分析Fig 5 Protein interaction networks and modular analysis

表2 兩組中7 種蛋白質差異表達總結Tab 2 Summary of differential expression of 7 fold protein between the two groups

3 討 論

本研究采用蛋白質組學技術鑒定了SH 患者與EH 患者血清差異表達蛋白。結果發現兩組間共檢測出35 個差異表達蛋白。其中32 個蛋白上調，3 個蛋白表達下調。 Li 等［14］發現SS 患者淚液中防御素α1、簇蛋白上調、乳轉鐵蛋白表達下調的表達。Liao等［15］使用蛋白組學分析發現與健康人群相比，SS 患者的差異表達蛋白存在331 個下調蛋白和289 個上調蛋白。發現轉化生長因子β-1 和CD40 配體的表達下調，從而豐富了炎癥相關途徑。信號轉導子和轉錄激活子1-α/β（STAT1）的表達上調并富集Ⅰ型干擾素信號通路和IL-27 介導的信號通路。KEGG富集分析顯示，相關差異蛋白在補體和凝血級聯、SLE 和朊病毒疾病中顯著富集。其中VWF、A2M和F9 的差異表達更為顯著。蛋白質（VWF、A2M和F9）和KEGG 途徑（補體和凝血級聯）在以往的SS 蛋白質組學研究中沒有發現，它們可能是高血壓人群發生SS 的重要蛋白質和生物通路。

VWF 是一種由內皮細胞和巨核細胞合成和釋放的大分子糖蛋白，是一種重要的血漿成分，在血小板聚集和血栓形成中發揮重要作用［16］。此外VWF 是內皮細胞識別的標志物，其在循環中的釋放和水平被認為是內皮細胞功能障礙的主要指標［17］。有研究發現老年高血壓合并動脈粥樣硬化患者血清VWF 水平升高［18］。本研究發現SH 患者的血清VWF 水平顯著高于EH 患者，提示SH 患者血管內皮細胞損傷程度更嚴重。雖然本研究沒有證實SH 患者的內皮功能障礙發生在血壓升高之前，但筆者認為VWF 相關的內皮功能障礙在SH 患者的發病機制中起著重要作用。如果在降壓治療的基礎上檢測SH 患者的VWF，并進一步調節血管內皮功能，SH 患者的預后將得到改善。

A2M 是一種細胞外大分子，主要以其作為廣譜蛋白酶抑制劑的作用而聞名。同時A2M 可結合多種細胞因子，如白細胞介素-6，血小板衍生生長因子，轉化生長因子、神經生長因子，腫瘤壞死因子-α等，并在多種細胞因子相互作用和炎癥反應中發揮重要作用［19］。A2M 可以通過中和纖溶酶、纖溶酶原激活劑和活化的蛋白C 來增強促凝血特性［20］。促凝血劑特性和慢性炎癥與血管危險因素、動脈粥樣硬化和血栓栓塞癥有關。

Shimomura 等［21］對102 名有中風病史或任何心血管危險因素的患者進行了橫斷面分析，發現在有心血管危險因素的患者中，血清A2M 水平與血管內皮功能獨立相關，其血清水平可反映慢性卒中患者或有心血管危險因素患者的血流介導擴張對血管內皮功能的影響。本研究數據表明高血壓合并SS患者的A2M 水平顯著高于EH 患者。A2M 與炎癥反應和內皮功能有關，在高血壓合并自身免疫性疾病中的作用值得進一步探討。此外，A2M 的促凝血特性提示應更密切地監測SH 患者的凝血功能，以預防血栓栓塞癥的發生，這應有助于改善患者的預后。

凝血因子Ⅸ（FⅨ，F9）是一種依賴維生素K 的凝血蛋白，在內源性凝血途徑中起關鍵作用［22］。FⅨ是蛋白酶FⅨA 的前體，激活的FⅦ（FⅦIa）是其輔因子。與缺乏FⅨ或FⅦ相關的嚴重出血性疾病（血友病）表明它們在止血中的重要。研究表明，凝血可以被認為是一種內部炎癥。高凝狀態伴隨著凝血因子的增加，纖維蛋白凝塊的過量產生是細胞活化的原因，從而導致細胞因子、黏附分子等多種炎癥介質的增加［23］。此外，高凝狀態引起的血栓形成、補體活化、血小板活化等直接高凝結果也容易導致炎癥［24］。已有研究報道，高血漿FⅦ水平與靜脈血栓栓塞癥、心肌梗死和中風的風險略有增加有關［25，26］。本研究數據表明，FⅦ可能通過凝血途徑參與SS 高血壓的炎癥過程。另一方面，SH 患者發生血栓的風險高于EH 患者，預后較差。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究患者數量有限。其次，本研究只是相對定量的初步蛋白質篩選研究，樣本量相對較小，還需要進一步擴大樣本量進行蛋白質印跡來驗證差異蛋白。

綜上所述，本課題組通過DIA 對SH 和EH 患者的外周血樣本進行了蛋白質表達差異檢測。共篩選出35 個差異蛋白。結合生物信息學分析結果，筆者認為VWF、A2M 和F9 蛋白可能在高血壓患者發生SS 中發揮作用。然而，仍需要進一步進行蛋白質印跡驗證性研究來驗證這一結果。

作者貢獻度說明：

馬慧敏：負責文稿的設計和撰寫；阿依古再麗·艾合買提，朱晴，蔡昕添，夏衣熱·艾爾肯，吳婷，王夢卉：負責文章相關數據庫分析；李南方，張德蓮：負責文稿的修改和審校。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。