核桃粕醬油的研制及品質分析

譚春雷 盛軍 趙存朝

摘要：以螺旋壓榨核桃粕、超臨界萃取核桃粕和重力壓榨核桃粕為原料，考察發酵時間、發酵溫度、料液比和鹽水濃度對醬油發酵過程中氨基酸態氮含量的影響，并對醬油的理化指標進行分析。研究發現，當發酵時間為32 d、發酵溫度為42 ℃、料液比為1∶1.2、鹽水濃度為13%時，3種核桃粕所得醬油中氨基酸態氮含量達到最高，分別為0.75，0.56，0.65 g/100 g。對3種成品醬油進行理化指標檢測，3種醬油總氮含量分別為1.05，0.93，0.95 g/dL，無鹽固形物含量分別為11.15，11.27，11.67 g/dL，均符合相應國家標準。在3種醬油中共檢測出16種游離氨基酸，其中螺旋壓榨核桃粕所制醬油中游離氨基酸總量最高，達6.16 g/dL，超臨界萃取核桃粕和重力壓榨核桃粕所制醬油中氨基酸總量分別為5.02，5.20 g/mL。研究表明3種核桃粕用來制作醬油的適合程度為螺旋壓榨核桃粕＞重力壓榨核桃粕＞超臨界萃取核桃粕。核桃粕醬油的研制可為云南核桃產業的發展提供理論基礎，同時可促進云南醬油產業的發展。

關鍵詞：核桃粕醬油；發酵工藝；響應面法；游離氨基酸

中圖分類號：TS264.21 ?????文獻標志碼：A ????文章編號：1000-9973（2024）04-0154-07

Development and Quality Analysis of Walnut Meal Soy Sauce

TAN Chun-lei1， SHENG Jun1， ZHAO Cun-chao1，2，3*

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China;

2.Yunnan Plateau Characteristic Agricultural Industry Research Institute， Kunming 650201，

China; 3.Characteristic Resource Food Biological Manufacturing Engineering

Research Center in Yunnan Province， Kunming 650201， China）

Abstract： With spiral squeezed walnut meal， supercritical extracted walnut meal and gravity squeezed walnut meal as the raw materials， the effects of fermentation time， fermentation temperature， solid-liquid ratio and brine concentration on the amino acid nitrogen content during soy sauce fermentation are investigated， and the physicochemical indexes of soy sauce are analyzed. The results show that when the fermentation time is 32 d， the fermentation temperature is 42 ℃， the ratio of solid to liquid is 1∶1.2， and the brine concentration is 13%， the amino acid nitrogen content of the three kinds of walnut meal soy sauce reaches the highest， which is 0.75， 0.56， 0.65 g/100 g respectively. The detection of physicochemical indexes of the three finished soy sauce products shows that the total nitrogen content of the three kinds of soy sauce is 1.05， 0.93， 0.95 g/dL respectively， and the salt-free solid content is 11.15， 11.27， 11.67 g/dL respectively， which all meet the corresponding national standards. A total of 16 kinds of free amino acids are detected in the three kinds of soy sauce， among which， the total amount of free amino acids in soy sauce prepared by spiral squeezed walnut meal is the highest of 6.16 g/dL， and the total amount of amino acids in soy sauce prepared by supercritical extracted walnut meal and gravity squeezed walnut meal is 5.02， 5.20 g/mL respectively. The results show that the appropriate degree of the three kinds of walnut meals for making?soy sauce is spiral squeezed walnut meal>gravity squeezed walnut

收稿日期：2023-09-11

作者簡介：譚春雷（1998—），男，碩士，研究方向：功能食品。

*通信作者：趙存朝（1990—），男，研究實習員，碩士，研究方向：食品科學。

meal>supercritical extracted walnut meal. The preparation of walnut meal soy sauce can provide a theoretical basis for the development of Yunnan walnut industry and promote the development of Yunnan soy sauce industry.

Key words： walnut meal soy sauce; fermentation process; response surface method; free amino acid

核桃因富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素等營養成分而廣受人們的喜愛[1]。目前核桃除直接食用外，深加工產品主要為核桃蛋白粉、核桃油、核桃乳飲料等[2]。其中核桃油作為最主要的加工產品，也因含有大量的亞油酸、亞麻酸等可以改善記憶力的不飽和脂肪酸而深受消費者的青睞[3]。生產核桃油的同時會產生大量的副產物核桃粕，目前僅有少量核桃粕被用于加工制作蛋白粉，大部分被用于動物飼料或者直接丟掉[4]，造成了極大的資源浪費。

不同方法制作核桃油所產生的核桃粕種類與營養成分具有一定的差異，目前核桃油的生產方法主要為壓榨法、浸提法和超臨界萃取法，隨之產生的核桃粕中含有豐富的蛋白質、維生素和多糖等營養物質。有關研究報道，不同種類的核桃粕中蛋白質含量在19%～56%之間[5]，因此許多企業以核桃粕為原料提取核桃蛋白，或者進一步加工制作成營養蛋白粉，來解決核桃粕的加工利用問題，但對于核桃粕的利用卻遠遠不夠。醬油是一種營養豐富、口感獨特的釀造產品，主要以大豆或豆粕為主要原料，經米曲霉制曲、發酵釀制而成[6]。此外，利用牡丹籽粕、花生粕等原料生產醬油也有報道，以核桃粕為原料釀造醬油可以解決目前醬油原料單一、功能不足等問題[7]。

針對核桃粕利用不足和醬油原料單一的問題，本研究以3種不同的核桃粕（螺旋壓榨核桃粕、重力壓榨核桃粕和超臨界萃取核桃粕）為原料，采用低鹽固態法釀造核桃粕醬油，對發酵過程進行系統研究，考察發酵溫度、發酵時間、料液比和鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響，在單因素試驗的基礎上采用響應面法優化最佳發酵工藝，并對所得3種醬油中的總氮含量、氨基酸態氮含量和游離氨基酸含量等理化指標進行測定，探究不同種類核桃粕用于醬油生產的可行性。本研究既有利于拓寬核桃粕的加工利用途徑，又可以拓寬醬油的原料來源。

1 材料和方法

1.1 材料

螺旋壓榨核桃粕和重力壓榨核桃粕：云南昆明老三監醬油廠；超臨界CO2萃取核桃粕：云南一葉生物科技股份有限公司；米曲霉3.042：濟寧祥園生物科技有限公司；食鹽：云南省鹽業有限公司；小麥粉：鄭州天地人面粉實業有限公司。

1.2 試劑

鹽酸、乙醇、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠（均為分析純）：由云南農業大學提供；硼酸、甲醛、冰乙酸、無水硫酸鈉、石油醚、丙酮（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 主要儀器與設備

HPX-9272ME 恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司；pH計量儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；YP20002電子天平 上海光正醫療儀器有限公司；KN520凱氏定氮儀 上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV2355紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；氨基酸自動分析儀 德國Sykam（賽卡姆）公司。

1.4 方法

1.4.1 原料成分的測定

蛋白質含量按照GB 5009.5—2016進行測定；粗脂肪含量按照GB/T 6433—2006進行測定；水分含量按照GB/T 10358—2008進行測定；灰分含量按照GB 5009.4—2016進行測定。

1.4.2 工藝流程和操作要點

參考藺立杰[8]的研究方法制定工藝流程：核桃粕、小麥粉混合→潤水（30 min）→蒸煮滅菌（120 ℃、30 min）→冷卻至40 ℃→接種（接入原料重量0.7%的米曲霉）→制曲（32 ℃、42 h）→鹽水發酵→淋油（90 ℃沸水浸泡12 h）→成品。

原料潤水：將核桃粕粉碎，與小麥粉按4∶1的比例混合，加入原料總重量120%的水潤水30 min。

蒸煮滅菌：將潤水后的原料置于120 ℃的環境下蒸煮30 min。

接種：蒸煮后的原料冷卻至40 ℃時接種原料重量0.7%的米曲霉。

制曲：將接種后的原料轉入恒溫培養箱中進行制曲，控制制曲溫度為32 ℃，制曲時間為42 h，每隔6 h翻曲一次防止燒曲，當曲料疏松、存在大量孢子時即制曲成功。

發酵：將適量鹽水與粉碎成曲混勻裝入發酵器皿中，置于恒溫培養箱中保溫發酵40 d左右，得到成熟醬醅。

淋油：在成熟醬醅中加入90 ℃的蒸餾水將醬醅浸泡12 h進行沉淀，之后離心取上清液得到生醬油，將螺旋壓榨核桃粕醬油記為Y1、超臨界萃取核桃粕醬油記為Y2、重力壓榨核桃粕醬油記為Y3進行理化指標檢測。

1.4.3 單因素試驗

以氨基酸態氮含量為指標，選取不同鹽水濃度（10%、11%、12%、13%、14%）、不同料液比（1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6）、不同發酵溫度（36，38，40，42，44 ℃）、不同發酵時間（8，16，24，32，40 d）對發酵條件進行初步優化，確定較佳因素試驗參數范圍，每個處理重復3次，結果取平均值。

1.4.4 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken法進行發酵工藝的優化，因素水平見表1。

1.4.5 成品醬油理化指標的測定

可溶性固形物、全氮和氨基酸態氮含量按照GB 18186—2000進行測定；游離氨基酸含量按照GB 5009.124—2016進行測定；總酸含量按照GB 12456—2021進行測定；色澤采用紫外可見分光光度計進行測定；pH直接使用pH計進行測定。

1.5 數據處理

采用Excel進行數據統計，Origin 2021進行繪圖處理，SPSS 27.0進行單因素方差分析，Design-Expert 13進行響應面設計。

2 結果與分析

2.1 3種核桃粕基本成分比較

由表2可知，3種不同類型的核桃粕的基本理化指標存在一定差異，螺旋壓榨核桃粕的蛋白質含量最高，達到43.54 g/100 g，而重力壓榨核桃粕和超臨界萃取核桃粕的蛋白質含量分別為33.01 g/100 g和31.40 g/100 g。與此相對的是超臨界萃取核桃粕的粗脂肪含量達到19.37 g/100 g，遠高于螺旋壓榨核桃粕和重力壓榨核桃粕的粗脂肪含量，造成這種差異的原因是壓榨法較超臨界萃取法發展時間長、工藝更成熟、出油率更高，從而所得核桃粕中的粗脂肪含量較少[9]。此外，螺旋壓榨核桃粕和重力壓榨核桃粕中的灰分含量高于超臨界萃取核桃粕，這是因為壓榨過程中會帶入一些核桃殼，從而引起核桃粕的灰分含量過高[10]。研究表明大豆含18%～22%的油脂和40%左右的蛋白質，核桃粕成分組成與其接近，開發前景與大豆相似，初步說明核桃粕可以用作醬油發酵的原料。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響

發酵溫度會影響米曲霉的酶活性，進而影響氨基酸態氮含量。選定發酵時間為32 d、料液比為1∶1.2、鹽水濃度為12%，以不同的溫度進行發酵，考察發酵溫度對氨基酸態氮含量的影響，見圖1。

由圖1可知，當發酵溫度從36 ℃上升到42 ℃期間，3種醬油的氨基酸態氮含量隨著溫度的升高而增多，螺旋壓榨核桃粕醬油中氨基酸態氮含量最高，而超臨界萃取核桃粕醬油中氨基酸態氮含量最低。當溫度高于42 ℃時氨基酸態氮含量減少，這是因為溫度過高會抑制酶的活性，同時可能會加快美拉德反應的進行，消耗氨基酸[11]。胡伊等[12]使用牡丹籽粕發酵醬油時同樣得到相似的結論。在此基礎上，選擇發酵溫度為40～44 ℃進行后續試驗。

2.2.2 發酵時間對氨基酸態氮含量的影響

選定發酵溫度為40 ℃、料液比為1∶1.2、鹽水濃度為12%，以不同的時間進行發酵，考察發酵時間對氨基酸態氮含量的影響，見圖2。

由圖2 可知，隨著發酵時間的延長，氨基酸態氮含量不斷增加，當發酵時間為32 d時，氨基酸態氮含量達到最大，3種醬油中氨基酸態氮含量為Y1＞Y3＞Y2。這是因為若發酵時間不足，蛋白質未被完全分解[13]。當發酵時間超過32 d時，醬油中氨基酸態氮含量基本未發生變化，這是因為發酵后期酶活力下降，同時酵母菌與耐鹽乳酸菌繁殖，從而使米曲霉的生長繁殖受到影響[14]。結合試驗結果與試驗成本，選擇發酵時間為32 d進行后續試驗。

2.2.3 料液比對氨基酸態氮含量的影響

選定發酵時間為32 d、發酵溫度為40 ℃、鹽水濃度為12%，以不同的料液比進行發酵，考察料液比對氨基酸態氮含量的影響，見圖3。

由圖3可知，當料液比為1∶1.2時，氨基酸態氮含量達到最大；當料液比大于1∶1.2時，氨基酸態氮含量逐漸降低，這是因為適當的水分有助于米曲霉的生長，使蛋白質得到更好的利用，但隨著水分含量的增加，鹽分也隨之增加，從而抑制了米曲霉的生長，導致氨基酸態氮含量下降[15]。在此基礎上，選擇料液比為1∶1～1∶1.4進行后續試驗。

2.2.4 鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響

鹽對維系食品發酵體系中的微生物群落具有重要作用[16]。選定發酵時間為32 d、發酵溫度為40 ℃、料液比為1∶1.2，以不同的鹽水濃度進行發酵，考察鹽水濃度對氨基酸態氮含量的影響，見圖4。

由圖4可知，當鹽水濃度為10%～13%時，隨著鹽水濃度的增加，醬油中氨基酸態氮含量逐漸增加，且3種醬油中氨基酸態氮含量為Y1＞Y3＞Y2，這是3種核桃粕中蛋白質含量不同導致的。當鹽水濃度超過13%時，醬油中氨基酸態氮含量呈下降趨勢，這是因為鹽水濃度過低時，雜菌大量繁殖，從而使米曲霉的生長受到影響，而鹽水濃度過高時，蛋白酶活力受到抑制，從而使蛋白質的分解降低[17]。因此，選擇鹽水濃度為12%～14%進行后續試驗。

2.3 響應面法優化試驗設計及結果分析

在單因素試驗的基礎上，以氨基酸態氮含量為指標，采用Box-Behnken法進行試驗設計，確定3種核桃粕醬油最佳發酵工藝參數，試驗設計及結果見表3。

對表3中試驗數據進行二次多項回歸擬合，得到的3組多元回歸方程相關系數分別為R12=0.959 8，R1Adj2=0.908 2；R22=0.987 1，R2Adj2=0.970 5；R32=0.961 6，R3Adj2=0.912 2，表明該模型的擬合程度良好，可用來反映響應值的變化。3種核桃粕醬油中氨基酸態氮含量對發酵溫度（A）、料液比（B）、鹽水濃度（C）的多元回歸方程分別為Y1=0.742 0+0.053 8A+0.05B+0.028 8C+0.012 5AB＋0.005AC+0.052 5BC－0.093 5A2－0.071B2－0.033 5C2；Y2=0.538+0.017 5A+0.017 5B－0.002 5C+0.03AB－0.035AC+0.03BC－0.074A2－0.044B2－0.009C2；Y3=0.632+0.017 5A+0.016 3B－0.006 3C+0.007 5AB＋0.012 5AC－0.01BC－0.038 5A2－0.046B2－0.041C2。方差分析見表4～表6。

由表4～表6可知，3組響應面模型的F值分別為18.58，19.47，59.43，P值均＜0.01，極具顯著性，失擬項不顯著，說明試驗隨機誤差較小。由表4和表6可知，發酵溫度（A）和料液比（B）對模型的影響極顯著，3個因素對氨基酸態氮含量的影響次序為發酵溫度>料液比>鹽水濃度。由表5和表6可知，鹽水濃度（C）對模型的影響不顯著。

由圖5可知，發酵溫度、料液比和鹽水濃度的改變均會影響3種核桃粕醬油氨基酸態氮的含量，發酵溫度、料液比和鹽水濃度三者之間均存在交互作用，通過響應面的陡峭程度可以看出，發酵溫度的影響大于料液比和鹽水濃度的影響，與方差分析結果一致。最終通過試驗預測得出理論最優條件為發酵溫度（A）42.4 ℃、料液比（B）1∶1.24、鹽水濃度（C）12.8%時，3種醬油中氨基酸態氮含量分別可達0.76，0.54，0.64 g/100 g。

2.4 最佳工藝條件試驗驗證

為驗證回歸模型的可靠性，對最優條件進行驗證?？紤]實際情況，將響應因素選定為發酵溫度42 ℃、料液比1∶1.2、鹽水濃度13%、發酵時間32 d，此時氨基酸態氮含量平均值分別為0.75，0.56，0.65 g/100 g，相對誤差分別為1.33%、3.57%、1.54%，說明3組模型均可較好地預測3種核桃粕醬油中氨基酸態氮的含量。

2.5 基本理化成分分析

3種醬油的基本理化成分見表7。

由表7可知，3種醬油的總氮含量分別為1.05，0.93，0.95 g/dL，無鹽固形物含量分別為11.15，11.27，11.67 g/dL，符合相應的國家標準，說明核桃粕可以代替大豆成為醬油的蛋白原料，這與藺立杰[8]的結論一致。氨基酸態氮為醬油提供鮮味，是米曲霉分解蛋白質的產物，它的含量越高，說明蛋白質利用越充分，醬油品質越好[18]。發酵結束后，Y1的氨基酸態氮含量達到0.75 g/100 g，高于Y2與Y3的氨基酸態氮含量，這可能是因為螺旋壓榨核桃粕更易被米曲霉利用。酸度會影響醬油的口感，主要是由發酵過程中的乳酸菌產生的。醬油除了調味外，調色也是它的重要作用[19]，醬油的色澤主要由L* （亮度）、a* （紅綠值）、b* （黃藍值）決定，Y1的L*值要遠高于其他兩種醬油，這說明Y1的光澤度優于Y2、Y3，并且Y1的a*值和b*值也最高，這進一步證明了Y1的色澤在3種醬油中最佳。由醬油的理化指標可以初步判斷出用于釀造醬油的3種核桃粕的適宜程度為螺旋壓榨核桃粕＞重力壓榨核桃粕＞超臨界萃取核桃粕。

2.6 游離氨基酸分析

氨基酸在醬油中起重要的呈味作用，氨基酸含量越高，醬油的滋味越好，鮮味越濃[14]。同時氨基酸在人體調節代謝過程中起重要作用，如纈氨酸是合成各類抗體、激素和酶等的前體物質[20]，精氨酸會參與尿素、肌酸、NO、谷氨酰胺等的合成[21]。

由表8可知，16種游離氨基酸被檢測到，3種醬油中游離氨基酸總量最高的是Y1，最低的是Y2，與氨基酸態氮含量的順序一致。由圖6可知，Y2和Y3聚為一類，Y1單獨聚為一類，這是由于核桃粕的處理方式不同，蛋白質的含量與種類不同，從而造成氨基酸含量的差異。不同的氨基酸會呈現不同的滋味特征[22]。谷氨酸和天冬氨酸呈鮮味，3種醬油中鮮味氨基酸含量最高的是Y1，同時Y1中甜味和苦味氨基酸的含量也最高，與之相對應的是Y2中鮮味氨基酸含量最低，這進一步說明螺旋壓榨核桃粕更適合用來制作醬油。

3 結論

本試驗對3種核桃粕的成分進行研究，發現螺旋壓榨核桃粕中蛋白質含量最高，油脂含量低，可以作為醬油釀造的蛋白原料。在發酵條件優化過程中發現，當發酵時間32 d、料液比1∶1.2、發酵溫度42 ℃、鹽水濃度13%時，3種醬油中氨基酸態氮含量最高。對3種醬油的理化指標進行檢測，發現3種醬油均達到國家標準的基本要求，表明核桃粕可以作為醬油發酵的蛋白原料。通過對氨基酸進行檢測發現，螺旋壓榨核桃粕醬油中氨基酸總量和鮮味氨基酸含量遠高于其他兩種醬油，表明不同方法制得的核桃粕會對醬油品質產生重要影響。本研究對核桃粕的開發利用以及醬油原料的拓展起到一定的指導作用。

參考文獻：

[1]閆圣坤，楊嘉鵬，萬文瑜.脫脂核桃粕擠壓膨化制備膳食營養粉加工工藝的研究[J].中國糧油學報，2023，38（11）：188-195.

[2]王瑞珍.核桃粕固態發酵品質特性及其納豆激酶活性研究[D].咸陽：西北農林科技大學，2017.

[3]劉猛，樊鳳嬌，曲譜，等.酶解法提取核桃粕中蛋白質的工藝優化[J].食品工業，2021，42（4）：58-62.

[4]李明娟，張雅媛，游向榮，等.低溫噴霧干燥技術制備核桃粕蛋白粉的工藝條件優化[J].食品工業，2021，42（1）：156-161.

[5]楊美娟，馬宏.核桃餅粕質量指標的檢測與分析[J].農產品加工，2019（18）：46-48.

[6]王曉楠，藺立杰，王豐俊.響應面分析法優化核桃醬油的發酵條件[J].食品工業科技，2014，35（5）：209-212.

[7]趙貴紅，王波，李敏，等.牡丹籽粕釀造醬油發酵工藝研究[J].中國果菜，2022，42（1）：38-41，47.

[8]藺立杰.核桃醬油制取工藝及其活性成分研究[D].北京：北京林業大學，2013.

[9]藺立杰，趙媛，王建中，等.核桃醬油制曲條件的優化[J].食品與發酵工業，2012，38（5）：96-100.

[10]邸紅艷，馬海樂，王洋，等.超聲輔助提取核桃粕蛋白的工藝研究[J].現代食品科技，2019，35（7）：164-172.

[11]魏鵬飛.醬油發酵關鍵工藝優化及其對醬油品質的影響[D].無錫：江南大學，2011.

[12]胡伊，于泓鵬，吳克剛，等.牡丹籽粕醬油發酵工藝優化及抗氧化活性研究[J].食品與機械，2020，36（6）：157-161.

[13]張超，李玟君，汪海燕，等.花生粕醬油制曲工藝條件優化[J].中國釀造，2021，40（9）：52-57.

[14]趙楊楊，于貞.香菇醬油制曲工藝的優化[J].中國調味品，2023，48（2）：115-119.

[15]HU G Y， CHEN J， DU G C， et al. Moromi mash dysbiosis trigged by salt reduction is relevant to quality and aroma changes of soy sauce[J].Food Chemistry，2023，406：135064.

[16]XU J， JIN F， HAO J， et al. Preparation of soy sauce by walnut meal fermentation： composition， antioxidant properties， and angiotensin-converting enzyme inhibitory activities[J].Food Science & Nutrition，2020，8（3）：1665-1676.

[17]ZHANG Y J， FENG Y X， SHI H Q， et al. Impact of steam explosion pretreatment of defatted soybean meal on the flavor of soy sauce[J].LWT-Food Science and Technology，2022，156：113034.

[18]張麗.高鹽稀態醬油發酵過程中添加酵母的研究[D].貴陽：貴州大學，2019.

[19]王春玲，張博華，崔琪，等.影響醬油色澤和色調因素的分析[J].中國釀造，2010（7）：80-82.

[20]郭文瑞，韓云飛，楊揚，等.植物乳桿菌對發酵香腸蛋白質分解及游離氨基酸的影響[J].中國食品學報，2021，21（4）：209-215.

[21]顧凡，徐志濤，趙存朝，等.核桃凍干酸奶的研制[J].中國乳品工業，2023，51（1）：57-64.

[22]程曉，袁江蘭，陳怡均，等.米渣生醬油和大豆生醬油的風味表征及比較[J].食品科學，2017，38（8）：153-158.