薊馬取食誘導的紫花苜蓿類黃酮生物合成基因表達分析

摘要：紫花苜蓿（Medicago sativa）是國內外廣泛栽培的重要豆科牧草。本研究利用PacBio技術對抗薊馬苜蓿品種‘草原4號’進行全長轉錄組測序，共獲得 35.10 Gb的clean data，355 992條環形一致性序列（CCS Reads），其中全長非嵌合序列（FLNC Reads）238 454個，占40.46%，共鑒定出11 271個可變剪切事件（AS），32 102個SSR位點，11 514個lncRNA和76 293個完整的CDS序列。在NR、COG、GO、KEGG、Swiss-Prot和Pfam數據庫中注釋了83 008個轉錄本。基于轉錄組數據，對參與類黃酮生物合成基因進行qRT-PCR檢測，分析發現除了ANS外，類黃酮生物合成基因DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHI，CYP75B1，HCT，ANR的表達量在薊馬取食7天后均顯著上調，之后急劇下降（P≤0.05）；ANS基因則隨著薊馬取食時間的延長表達量逐漸上升。研究結果表明類黃酮生物合成基因參與苜蓿響應薊馬取食過程，且大部分基因參與早期防御反應，ANS可能參與晚期防御反應。

關鍵詞：紫花苜蓿；全長轉錄組；類黃酮；薊馬

中圖分類號：S541 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1034-10

Genes Expression Analysis of Flavonoid Biosynthesis Induced by Thrips Feeding in Alfalfa

CHEN Qi， DAI Rui， ZHANG Yan， SHUANG Shuang， HUO Xiao-wei， BIAN Lin， GUO Na， ZHANG Zhi-qiang*， ZHANG Yu-tong

Abstract：Alfalfa （Medicago sativa） is an important leguminous forage that is widely cultivated all over the world. In this study，full-length transcriptome sequencing of a thrip-resistant alfalfa variety ‘Caoyuan No.4’ was performed using the PacBio technology. A total of 35.10 Gb of clean data were generated，and 355 992 CCS Reads were obtained，including 238 454 full-length non-chimeric Reads （FLNC reads），which accounts for 40.46 %. A total of 11 271 alternative splicing （AS），32 102 SSR sites，11 514 lncRNA and 76 293 complete CDS sequences were identified. 83 008 transcripts were annotated in NR，COG，GO，KEGG，Swiss-Prot，and Pfam databases. Based on the transcriptome data，the expression of genes involved in flavonoid biosynthesis were analyzed by qRT-PCR，and it was found that the expression of flavonoid biosynthesis genes including DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHI，CYP75B1，HCT and ANR were all significantly increased after thrips feeding for 7 d，and then decreased sharply. However，the expression level of ANS gene was increased gradually with the prolongation of thrips feeding. These results showed that the genes involved in flavonoid biosynthesis were related to the response of alfalfa to thrips feeding，and most of the genes were involved in the early defense response，but ANS may be involved in the late defense response.

Key words：Alfalfa;Full-length transcriptome;Flavonoids;Thrips

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，具有產量高、品質好和營養價值豐富等優點，已成為我國畜牧業和乳業發展的重要物質基礎［1］。隨著苜蓿種植面積不斷擴大，苜蓿面臨的病蟲害風險也逐漸增加［2］。薊馬是苜蓿的主要害蟲之一［3］。薊馬通過挫破植物表皮，造成組織褪色、葉片皺縮，甚至整株枯萎，使苜蓿生長受阻、產量下降，進而嚴重影響苜蓿的產量和品質［4-6］。據報道，薊馬每年能造成苜蓿減產10%～30% ［7］。然而，由于薊馬的高度雜食性和復雜的生活方式，其防治成為我國農牧業發展的難題［8］。

轉錄組學是功能基因組的重要組成部分。二代轉錄組（RNA-seq）技術廣泛用于差異表達基因的鑒定及定量，但由于其轉錄本序列拼接不完整，無法獲得準確的轉錄本［9］。隨著高通量測序技術的發展，第三代測序平臺（PacBio）可用于全長轉錄本的測序。與RNA-seq相比，三代測序無需將序列打斷，可直接讀取由材料反轉錄得到的全長cDNA，獲得有效的相應的全長轉錄組，可以極大地提高基因注釋的準確性［10］。包括苜蓿［11-13］在內，地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）［14］、黃精（Polygonatum sibiricum）［15］、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）［16］、核桃（Juglans regia L.）［17］、水稻（Oryza sativa L.）［18］和老麥芒（Elymus Sibiricus）［19］等多種植物都進行了全長轉錄本的測序，并在此基礎上開展相關性狀生物學機制的探索。然而，紫花苜蓿為異花授粉、同源四倍體植物，不同品種間遺傳背景差異很大。因此，對具有優良性狀的苜蓿進行全長轉錄組測序，對于功能基因挖掘及相關機制解析具有重要參考價值。

類黃酮是植物重要的次生代謝產物，其在植物色素合成、生長發育和應對植食性昆蟲防御反應中具有重要作用［20-21］。Morimoto等［22］研究發現地老虎對含有類黃酮物質的植物具有明顯的拒食性。吳芳等［23］研究發現薊馬取食后苜蓿中黃酮、單寧和木質素均顯著提高。課題組利用比較轉錄組研究發現黃酮生物合成途徑和異黃酮生物合成途徑是薊馬取食誘導最顯著富集的途徑［24］。此外，廣泛靶向代謝組學分析發現薊馬取食會誘導‘草原2號’（感薊馬品種）和‘草原4號’（抗薊馬品種）兩個苜蓿品黃酮類化合物的積累［25］。但是，有關苜蓿類黃酮生物合成途徑中相關基因響應薊馬取食的表現尚不明晰，也無相關文獻報道。本研究以抗薊馬苜蓿品種‘草原4號’為材料，利用PacBio技術對其及進行全長轉錄組測序及生物信息學分析，獲得類黃酮生物合成相關基因全長，并利用qRT-PCR技術分析相關基因在薊馬取食后的表達量變化，為相關基因的挖掘及功能分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以抗薊馬品種‘草原4號’紫花苜蓿為材料，將種子用10%次氯酸鈉消毒后播種于10 cm×12 cm花盆中，每盆3株，于人工氣候室進行培養。晝夜平均氣溫分別控制在（30±5）℃、（20±5）℃；晝夜相對濕度控制在（55±5）%、（70±5）%，保證所有材料生長環境一致。在植株生長到60 d時對不同組織（根、莖和葉）進行混合取樣，液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取與文庫構建

從‘草原4號’紫花苜蓿不同組織（根、莖和葉）混合樣品中提取Total RNA，利用Nanodrop2000對濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent2100測定RIN值。樣品檢測合格后，進行文庫構建。文庫構建及測序由美吉生物科技有限公司進行，其中公司基于單分子實時測序（Single molecule real time sequencing，SMRT）技術，Sequel II（PacBio） 高通量測序平臺上進行全長轉錄組測序。

1.3 序列生物信息學分析

將下機數據進行質量控制，過濾Polymerase Read片段長度小于50 bp、序列準確性小于0.90的序列，將剩余序列從接頭處打斷并過濾掉接頭序列后得到subreads，過濾長度小于50 bp的subread，剩余subread即為clean data。根據條件fullpasses≥3且序列準確性大于0.90從原始序列提取CCS序列，進一步篩選得到全長非嵌合序列（FLNC）。通過isoseq3流程中的pbmm2軟件，將序列比對到參考基因組上，并統計比對上的序列數和序列質量。利用BUSCO對去冗余后的轉錄組進行完整性評估；使用gmap進行新轉錄本預測；使用Alternative進行可變剪切分析；使用CPC2進行LncRNA預測；采用MISA（默認參數）進行SSR檢測；通過PlantTFDB預測紫花苜蓿轉錄本中的轉錄因子；將該次全長轉錄組測序獲得的全長轉錄本與六大數據庫（NR，Swiss-Prot，COG，GO和KEGG數據庫）進行比對，獲得在各數據庫的注釋信息。

1.4 類黃酮生物合成途徑構建及基因挖掘

根據之前文獻報道的類黃酮生物合成途徑為參考，從基因功能注釋KEGG途徑中篩選出候選類黃酮生物合成途徑，從候選途徑中查找相關酶，再根據酶在CDS表中查找關鍵基因。

1.5 薊馬取食誘導類黃酮生物合成途徑關鍵基因的表達分析

1.5.1 薊馬接蟲處理 待苜蓿生長45 d后，進行薊馬接種。選擇實驗室飼養的長勢一致的牛角花齒薊馬成蟲，每盆分別接種100頭薊馬，接完后用300目的防蟲網罩住，避免薊馬逃逸。為了避免生長狀況對試驗結果產生干擾，本試驗取樣時間相同（生長59天時同時取樣），分別在取樣前14天、10天、7天、3天和1天進行薊馬接種，取樣當天未接種薊馬的苜蓿作為對照。每個處理三個生物學重復。液氮速凍后保存于-80℃

1.5.2 類黃酮生物合成途徑關鍵基因qRT-PCR分析 將篩選的11個類黃酮生物合成途徑關鍵基因進行qRT-PCR分析。使用OminiPlant RNA Kit （Cwbio，Beijing，China）按照說明書提取樣品的總RNA，在檢測RNA濃度和純度后，經EasyQuick RT MasterMix （Cwbio，Beijing，China）反轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR分析。利用NCBI Premier-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）設計引物（表1），以苜蓿β-actin為內參基因。每個樣品設置3個生物學重復和2個技術重復。采用2-ΔΔCT法計算基因表達量［26］。

2 結果與分析

2.1 全長轉錄組測序結果與序列分析

利用PacBio測序平臺進行轉錄組測序，共獲得 35.10 Gb的clean data，包括25 497個reads，平均長度為1 376.9 bp。通過精確篩選，得到355 992個環形一致性序列（CCS Reads），平均長度為1 621.65 bp。篩選得到全長嵌合序列（FL Reads）占34.88%，全長非嵌合序列（FLNC Reads）共有238 454個占40.46%，其中500～1 000 bp的條帶數量最多，其次是1 000～1 500 bp，平均長度為1 284.47 bp（表2）。

2.2 SSR分析與LncRNA分析

簡單重復序列標記（SSR）已成為多種物種的遺傳定位、分子育種和群體遺傳分析常用標記來源。本文利用MISA軟件進行SSR檢測，共檢測到32 102個SSR位點，分別包含19 921個Mono-nucleotide（單堿基）、4 956個Di-nucleotide（二堿基）、6 555個Tri-nucleotide（三堿基）、437個Tetra-nucleotide（四堿基）、140個Penta-nucleotide （五堿基）、93個Hexa-nucleotide（六堿基）（表3）。

LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，在整個基因組中廣泛表達。由于LncRNA不編碼蛋白質，為了確定轉錄本是否為LncRNA，采用CPC、CNCI、Pfam蛋白結構域和CPLEK對轉錄本進行編碼潛力篩選。結果顯示，CNCI注釋到19 036條LncRNA，Pfam注釋到31 238條LncRNA，PLEK注釋到40 243條LncRNA，CPC注釋到37 333條LncRNA。其中，4個軟件均注釋到的LncRNA共有11 514條（圖1）。

2.3 CDS與轉錄因子預測

利用TransDecoder對紫花苜蓿全長轉錄組的編碼區域（CDS區）進行分析。結果顯示，共有76 293個序列具有編碼區，其中超過87%的序列編碼長度低于1 500 bp（圖2a）。此外，通過分析基因轉錄產物含有的domain信息，對基因進行轉錄因子預測及家族分析。共預測到1 611個轉錄因子，分別歸屬于20個家族。各家族轉錄因子如下：MADS家族31條；C2C2家族138條；C3H家族62條；MYB超家族260條；SBP家族47條；LOB家族21條；AP2/ERF家族146條；bZIP家族92條；GRF家族18條；B3超家族72條；NAC家族99條；LBD （AS2/LOB）家族62條；bHLH家族154條；WRKY家族76條；GRAS家族107條；HSF家族30條；C2H2家族21條；TCP家族43條；ZF-HD家族21條；FAR1家族18條；其他93條。其中主要集中在MYB超家族、bHLH、AP2/ERF和C2H2家族（圖2b）。

2.4 完整性評估和可變剪接預測

利用BUSCO（http：//busco.ezlab.org）對去冗余后的轉錄組進行完整性評估，共找到298個完整的BUSCO基因，占總基因70.1%，說明組裝結果較完整。此外，應用Alternative軟件對轉錄本進行可變剪接（AS）分析，共發現12 271個可變剪切事件（表4），其主要的類型為內含子滯留（RI）。

2.5 功能注釋

將全長轉錄組測序獲得的全長轉錄本與六大數據庫（NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO和KEGG）進行比對，獲得在各數據庫的注釋信息，并對各數據庫注釋情況進行統計分析（圖3）。其中，在NR數據庫中獲得的注釋信息最多，共有71 549條，在KEGG中最少，共有35 900條注釋信息。此外，在Swiss-Prot，Pfam，COG和GO數據庫中分別注釋到56 732，51 770，64 634和63 115條注釋信息。在四個數據據中共同注釋到27 733條信息。

通過NR序列比對發現草原4號紫花苜蓿的轉錄本與蒺藜苜蓿的同源性最高，為62 711個，占總體的87.65%；其次是地三葉和紅三葉，均占1.74%（圖4）。

利用GO功能注釋，共有63 115個轉錄本注釋到生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC），得到GO的3個主類別和51個子類別。在分子功能中注釋到最多的為催化活性和轉運活性；在細胞成分中細胞豐富度最高的為細胞，其次為膜部分；在生物過程中，代謝過程的豐富度最高，其次為有機氮化合物代謝過程（圖5）。

對紫花苜蓿轉錄本進行KEGG功能注釋情況進行分類統計，結果顯示，共有25 103條轉錄本被注釋到KEGG數據庫中，涉及6條主通路20條子通路，其中注釋到新陳代謝碳代謝的條帶最多，為4 020條，占總轉錄本的16%；其次是遺傳信息處理中的翻譯，為2 836條，占總轉錄本的11%（圖6）。

2.6 類黃酮生物合成關鍵基因篩選

根據前人研究報道及比較轉錄組結果，基于全長轉錄組數據類黃酮生物合成途徑的KEGG通路分析，共篩選出11個候選基因，分別為二氫黃酮醇還原酶（DFR）、黃酮醇合成酶（FLS）、黃烷酮-3-羥化酶（F3H）、黃酮合成酶（CYP93B2_16）、5-O-（4-香豆酰基）-D-奎喹酸酯 3′-單加氧酶（C3′H）、查爾酮合酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）、類黃酮3′單氧酶（CYP75B1）、羥基肉桂酰基轉移酶（HCT）、花青素合成酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）（表5）。

2.7 類黃酮生物合成通路關鍵基因qRT-PCR分析

薊馬取食0，1，3，7，10，14天，紫花苜蓿葉片中類黃酮生物合成途徑中關鍵基因DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHS，CHI，CYP75B1，HCT，ANS和ANR共11個基因的表達情況如圖7。結果表明，除了ANS外，類黃酮生物合成基因DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHI，CYP75B1，HCT和ANR的表達量在薊馬取食7天后均顯著上調，之后急劇下降（P＜0.05），與對照（0 d）相比，提高到7.03～325.63倍，隨后顯著下降，推測其可能在薊馬取食前期發揮重要作用。ANS隨著取食時間的延長表達量逐漸增加，且在14天時表達量達到最高，推測其可能在薊馬取食后期發揮重要作用。總體來看，薊馬取食可以誘導類黃酮生物合成相關基因的表達。

3 討論

紫花苜蓿是一種多年生優質豆科牧草，在我國及世界范圍內廣泛種植。全長轉錄組測序是基于PacBio Sequel平臺的一種單分子實時測序技術，與二代測序相比，有讀取長度長、無需組裝和精度高等優點，在植物測序中得到廣泛應用。Fang等［11］通過對紫花苜蓿根的全長轉錄組測序，獲得21.53 Gb的clean data，其中包含409 291個全長非嵌合（FLNC）序列。Cui等［12］結合SMRT測序和NGS技術，對5個溫度梯度脅迫下的紫花苜蓿進行全長轉錄組測序，共得到125.48 Gb clean data，270 750個FLNC序列，預測了8 849個AS事件、73 149個SSR和4 189個lncRNA。此外，水稻（Oryza sativa L.）［27］、毛茛（Ranunculus japonicus Thunb.）［28］、馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）［29］、藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）［30］、文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）［31］和菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）［32］等多種植物都構建了全長轉錄組數據庫。本研究對抗薊馬苜蓿品種‘草原4號’進行全長轉錄組測序，共獲得 35.10 Gb的clean data，包括238 454個FLNC序列。通過分析轉錄本的結構信息，共鑒定出11 271個可變剪切事件（AS），32 102個SSR位點，11 514個lncRNA和76 293個完整的CDS序列。此外，在NR、COG、GO、KEGG、Swiss-Prot和Pfam數據庫中注釋了83 008個轉錄本。其中，共有25 103條轉錄本被注釋到KEGG數據庫中，富集到類黃酮生物合成通路共有192條。

類黃酮是一種重要的次生代謝產物，雖然其種類多種多樣，但其在植物體內的生物合成途徑已研究的比較詳盡。其中，參與類黃酮生物合成的基因如CHI，CHS，FLS，DFR和ANS等，已經在很多植物中被鑒定。Sun等［33］通過對銀杏（Ginkgo biloba L.）進行全長轉錄組測序，提出類黃酮生物合成的最終候選基因包括3個UDP-糖基轉移酶和1個MYB轉錄因子。Ye等［34］通過二代與三代測序結合，發現PAL，DFR，F3′H，ANR和ANS等均為類黃酮生物合成的關鍵結構基因。張麗玲［35］研究發現UGAT，4CL，PAL，CHS，CHI和FLS是谷子不同時期籽粒發育差異表達候選基因。吳淵［19］提出DFR，F3′H，F5′H以及ANS在成熟果實中的高表達是造成成熟果實中黃酮類種類較多的主要原因。孫詩瑤等［36］通過千針萬線草（Stellaria yunnanensis Franch.）根轉錄組測序發現類黃酮代謝所需的 10 種關鍵酶，包括CHS，CHI，F3H，CYP73A，CYP75B1，PGT1，ANR，HCT，C3′H和CCOAOMT。Xu等［28］通過對毛莨進行全長轉錄組測序，挖掘出毛莨中6個參與類黃酮生物合成的關鍵基因（PAL，4CL，CHS，CHI，F3H和FLS）。代明潔［37］研究發現下游花青素生物合成相關基因F3′H和ANS及F3H共表達，并負責花青素積累，而不同類黃酮生物合成途徑的上游基因對F3H表達水平的干擾有著不同的反應。劉瑞等［38］提出沙棘（Hippophae rhamnoides L.）HrANR基因的表達及黃酮類含量變化與其抗旱性密切相關。此外，Simmonds等［22］研究發現類黃酮可以調節昆蟲的攝食和產卵。在本課題之前通過轉錄組和廣泛靶向代謝組學方法，研究發現黃酮生物合成途徑和異黃酮生物合成途徑是薊馬取食誘導最顯著富集的途徑［24］，且感薊馬和抗薊馬品種間差異代謝物也主要富集到黃酮類化合物［25］。然而，目前與類黃酮相關的報道主要集中于次生代謝物合成及非生物脅迫基因挖掘或單個基因的克隆及鑒定，但有關其生物抗蟲性，特別是薊馬取食后的響應罕有報道。本研究利用KEGG功能注釋，從‘草原4號’全長轉錄本數據庫中篩選出類黃酮生物合成途徑，從中篩選出11個關鍵候選基因：DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHS，CHI，CYP75B1，HCT，ANS和ANR，并利用qRT-PCR技術分析其相在薊馬取食后的相對表達量。結果發現DFR，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHI，CYP75B1，HCT，ANS，ANR均在薊馬取食第7天時表達量極顯著上調，之后下降；而ANS隨薊馬取食天數增加而逐漸增加。因此，推測11個類黃酮生物合成通路候選基因可能在苜蓿抗蟲中發揮重要作用，為后續基因克隆及功能驗證奠定基礎。

4 結論

利用全長轉錄組測序技術建立‘草原4號’紫花苜蓿全長轉錄組數據庫，共獲得 35.10 Gb的clean data，包括238 454個FLNC序列；共鑒定出11 271個AS，32 102個SSR位點，11 514個lncRNA和76 293個完整的CDS序列。類黃酮生物合成基因DF，FLS，F3H，CYP93B2_16，C3′H，CHI，CYP75B1，HCT，ANR在薊馬取食第7天表達量最高，之后下降，推測其可能參與苜蓿對薊馬取食的早期應答反應；ANS基因隨著薊馬取食時間的延長表達量逐漸上升，推測其參與苜蓿對薊馬取食的晚期應答反應。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-10-07；修回日期：2023-11-22

基金項目：內蒙古自治區高等學校“青年科技英才支持項目”（NJYT23009）；內蒙古自治區自然科學基金面上基金（2021SHZR0721）；苜蓿分子育種體系構建及種質創制（BR22-11-12）；內蒙古自治區研究生科研創新項目（S20231109Z）資助

作者簡介：陳崎（1999-），女，漢族，內蒙古烏拉特前旗人，碩士研究生，主要從事草育種方面研究，E-mail：ndcq@imau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhangzq19890102@126.com