不同來源纖維素降解菌的篩選、鑒定及產酶能力的比較

摘要：為了選育纖維素高效降解菌，提高纖維素降解效率。本研究從肉牛瘤胃液、肉牛糞便，蝗蟲腸道末篩選纖維素降解能力較強的株系，對其進行生物學鑒定和酶活性比較。結果表明，從肉牛瘤胃液中篩選出纖維素降解株系L7，L8-1和L9，分別鑒定為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）和枯草芽孢桿菌（B. subtillus）；從蝗蟲腸道末中篩選得到株系H2-1和H3-1，分別鑒定為枯草芽孢桿菌（B. subtillus）和解蛋白芽孢桿菌（B. proteolyticus）；從肉牛糞便中篩選得到株系F8-2被鑒定為高地芽孢桿菌（B. altitudinis）。其中降解能力最強的株系為L7，其全酶（FPA）、外切葡聚糖酶（C1），內切葡聚糖酶（CMC）和β-葡萄糖苷酶（β-Gase）活性分別為4.28，1.89，5.57，2.30 U·mL-1。菌落D/d平均值與FPA，CMC，C1，β-Gase的酶活性呈顯著正相關（P＜0.05）。本研究篩選得到株系L7具有較強的纖維素降解能力，為提高飼料轉化率提供了更多可能。

關鍵詞：纖維素降解菌；酶活性；芽孢桿菌

中圖分類號：S816.3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1252-09

Screening，Identification and Comparison of Enzyme Production Capacity of Cellulose-Degrading Bacteria from Different Sources

CHEN Huan1， SHI Zi-hao1， WU Chun-hui1， LI Qiu-feng1， YU Xiao-meng1，XU Ling1， JIA Hai-kuo1， LIU Zhen-ling1， WANG Ming-ya

Abstract：In order to screen and cultivate efficient cellulose degrading strains and improve the efficiency of cellulose degradation，in this study，we screened the strains with strong cellulose degradation ability from rumen fluid，fresh excreta of beef cattle，and locust hindgut，performed biological identification，and compared their enzyme-producing activity. The results showed that the cellulose-degrading bacteria strains L7，L8-1，and L9 were screened from the rumen fluid of Simmental cattle and identified as Bacillus altitudinis，B. siamensis and B. subtillus，respectively. The strains H2-1 and H3-1 were screened from locust hindgut and identified as B. subtillus and B. proteolyticus，respectively，and the strain F8-2 from cattle excreta was identified as B. altitudinis. The strain L7 showed the strongest degradation ability，enzyme activity of which in FPA，CMC，C1，and β-Gase was 4.28，1.89，5.57，and 2.30 U·mL-1，respectively. Correlation analysis showed that the D/d values of colony were significantly positively correlated with enzyme activity of FPA，CMC，C1，and β-Gase （Plt;0.05）. In this study，the strain L7 showed stronger cellulose degradation ability than other strains，and provided more possibilities to improve the feed conversion rate of crude fiber utilization.

Key words：Cellulose-degrading bacteria;Enzymatic activity;Bacillus

纖維素是牧草和農作物秸稈的主要成分，約占總干重的30%～50%［1］，是自然界中最豐富的反芻動物飼料資源，將牧草和農作物秸稈調制成青貯飼料過程中，充分降解和利用其中的粗纖維素是畜牧業降本增效的有效措施。目前許多研究通過添加外源纖維素酶，來降解和充分利用纖維素，達到改善青貯飼料發酵品質的目的［2］。然而由于酶制劑成本高、性能不穩定及pH值適應范圍較窄等因素，限制了其在青貯飼料中的廣泛應用［3-4］。纖維素降解菌具有成本低，適應性廣等優點，可降解植物中的結構性纖維素，并將其轉化為單糖進而被乳酸菌和家畜利用，因此，篩選并獲得能高效降解牧草和農作物秸稈中的粗纖維的纖維素降解菌是畜牧業降本增效的重要因素。

纖維素降解細菌相比于真菌具有結構簡單、繁殖周期短、抗逆性強、耐酸、產酶活性高等特點而成為研究熱點［5］。雖然，近年來對纖維素降解菌的研究比較多，但大部分纖維素降解菌都不同程度地存在酶系不完全、活性不高、酶作用條件苛刻等問題，需要進一步去挖掘纖維素降解菌資源。且來源為土壤、廢紙漿、溫泉等的纖維素降解菌安全性存在問題［6-8］，不便直接運用于畜牧業中的飼料加工及飼喂。有研究人員從腐質土、朽木和土樣中篩選出了纖維素降解細菌，有的對秸稈有顯著降解作用［9］。動物類來源纖維素降解菌如瘤胃微生物和蝗蟲腸道末微生物等具有更安全的特性，且種類繁多、數量巨大，仍存在大量的纖維素降解菌資源未被開發。雖然對動物類來源纖維素降解菌也有一定的研究，但是，對不同來源的纖維素降解菌酶活性進行比較的研究很少［10］。因此，本研究從肉牛瘤胃液，肉牛糞便，蝗蟲腸道末，篩選纖維素降解能力較強的株系，對其進行生物學鑒定和產酶活性進行比較，篩選產酶能力佳的株系，為高效纖維素降解株系篩選提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西門塔爾牛瘤胃液、糞便樣品采集于保定市定興縣燕園肉牛有限公司，東亞飛蝗購買于山東省臨沂市費縣富裕螞蚱養殖基地。稱取肉牛瘤胃液1 mL、糞便10 g，蝗蟲腸道末內容物分別放入裝有100 mL無菌水的錐形瓶中，37℃振動20 min，制得懸浮液。

本研究所用培養基配制如下：

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1，pH值7.0。

羧甲基纖維素鈉液體培養基：CMC-Na 10 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，NH4NO31.0 g·L-1，CaCl20.02 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，FeCl3·6H2O 0.05 g·L-1，pH7.0，固體培養基加瓊脂15 g·L-1。

赫奇遜液體培養基：磷酸二氫鉀1.0 g·L-1、七水硫酸鎂0.3 g·L-1、氯化鈉0.1 g·L-1、硝酸鈉2.5 g·L-1、氯化鐵0.01 g·L-1，氯化鈣0.1 g·L-1。

剛果紅染色液：稱取0.1 g剛果紅溶于100 mL蒸餾水中。

氯化鈉溶液：稱取5.85 g氯化鈉溶于100 mL蒸餾水中。

產酶培養基：（NH4）2SO42.0 g·L-1，KH2PO43.0 g·L-1，CoCl23.0 g·L-1，FeSO47.5 g·L-1，MnSO4·H2O 2.5 g·L-1，ZnSO4·7H2O 2.0 g·L-1，MnSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCl20.5 g·L-1。

葡萄糖標準溶液：將10 g葡萄糖烘干至恒重，用1%CMC-Na的0.05 mL鹽緩沖液溶解并定容至100 mL，4℃保存。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、無淀粉濾紙、脫脂棉、水楊苷等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 富集培養 在超凈工作臺中，吸取1 mL菌懸液，將其添加至500 mL的牛肉膏蛋白胨的液體培養基中，于37℃，150 r·min-1的搖床（HZQ-X100，常州金壇精達儀器制造有限公司）上進行24 h的培養。

1.2.2 纖維素降解菌的分離與純化 將培養的菌液做標準液按十倍級數稀釋，各吸取稀釋倍數為10-5，10-6，10-7倍的菌液50 μL涂于羧甲基纖維素鈉固體培養基上，按各稀釋倍數進行3次重復。于37℃條件下進行24 h的細菌培養。

1.2.3 纖維素降解菌的篩選 將純化的株系通過接種環分離出單個菌落，放置在羧甲基纖維素固體平板上，置于37℃的恒溫培養箱（LC-GZX-150T，上海力辰邦西儀器科技有限公司）中，進行2 d的倒置培養。在細菌生長2 d后，用1 g·L-1剛果紅染色30 min，然后用1 mol·L-1NaCl溶液對其進行脫色30 min［11］。當出現一個清晰的透明圈，測量透明圈直徑（D）與菌落直徑（d），計算D/d值并選擇平均值比較大的株系。

1.2.4 濾紙降解試驗 將所獲得株系置于赫齊遜液體培養基中，在37℃，150 r·min-1下培養10 d；每組3個平行，根據濾紙的崩解情況判斷株系降解纖維素的能力。

1.2.5 標準曲線的繪制 取8支20 mL刻度的試管，分別加入1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，補加蒸餾水至總體積為2 mL，配制成濃度梯度的葡萄糖溶液。向各試管中加入2 mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，立即取出冷卻，用蒸餾水定容至20 mL。在波長540 nm下，以未加入葡萄糖標準溶液的試管作為對照調零點，測定其它各管溶液的光密度（Optical density，OD）值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，以對應的OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.2.6 酶活性測定 取篩選出的菌懸液以1%接種量接種于產酶培養基中，37℃，150 r·min-1培養4 d，發酵液6 000 r·min-1離心10 min后取上清液作為粗酶液。粗酶液與無淀粉濾紙（Whatman）、脫脂棉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和水楊苷四種底物反應的產物與3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液發生氧化還原反應，在波長540 nm下比色測定還原糖量，根據線性關系測定FPA，CMC，C1和β-Gase的酶活性［12］，酶活性單位為U·mL-1，定義1 mL酶液每分鐘催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需要的酶量為1個纖維素酶活性單位（U）。

1.2.7 分子生物學鑒定 提取菌液DNA，以通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，擴增體系為25 μL，包括：上游引物（10 μmol·L-1）1 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1 μL，DNA模板（稀釋20倍）1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應程序為：95℃預變性1 min；95℃30 s；53℃30 s；72℃30 s；35次循環，最后72℃延伸7 min。將PCR擴增產物進行電泳檢測，回收的PCR產物送至北京志超偉業生物技術有限公司進行16 s rRNA測序，序列通過NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中的BLAST進行同源性分析。

1.2.8 數據統計與分析 利用Excel 2019進行數據錄入整理，用SPSS Statistics 23.0（IBM，NY，USA）進行單因素方差分析，用Duncan多重比較檢驗法對數據進行多重比較（Plt;0.05），用GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software，CA，USA）對試驗數據進行圖表繪制，結果用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選

通過對肉牛瘤胃液、糞便、蝗蟲腸道末內容物的富集培養、稀釋涂布，劃線分離一共得到15個株系，經剛果紅培養基鑒定后，有6個株系產纖維素酶，部分株系的剛果紅染色結果（圖1）、透明圈與株系直徑大小表明（表1），15個株系的D/d平均值為1.42～6.14，其中L7，L8-1，L9，H3-1，H2-1，F8-2的D/d平均值分別為6.14，5.29，4.54，2.17，2.14和4.49，對這6個D/d值較大的株系進行酶活性測定。

2.2 酶活性測定

上述D/d平均值較大及濾紙崩解效果較好的6個株系，通過4種纖維素酶活性測定的結果（圖2）表明，株系L7的FPA酶活性顯著高于株系L9，H3-1，F8-2，H2-1（P＜0.05），株系L9，L8-1顯著高于H3-1，F8-2，H2-1（P＜0.05）。株系L7和L8-1的CMC酶活性顯著（P＜0.05）高于株系L9，H3-1，F8-2，H2-1。株系L7的C1酶活性顯著高于株系L9，L8-1，H3-1，F8-2，H2-1（P＜0.05）。株系L7和L9的β-Gase酶活性顯著高于L9，H3-1，F8-2，H2-1（P＜0.05）。綜上所述，株系L7的四種酶活性高于其它株系的分別為4.28，1.89，5.57，2.30 U·mL-1為最優株系，其次為株系L8-1。

2.3 D/d平均值與纖維素降解菌酶活性相關性分析

相關性分析表明（圖3），纖維素降解菌D/d平均值的大小與FPA酶活性、CMC酶活性、C1酶活性、β-Gase酶活性活力呈顯著正相關（P＜0.05），隨著FPA酶活性的增加，株系的D/d值隨之變大。

2.4 株系分子生物學鑒定

由表2和圖4所示，對篩選得到的6個優良纖維素降解株系進行16 s rRNA鑒定，將PCR產物測序序列進行BLAST序列比對（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。基于16 s rDNA基因系列的系統發育分析表明，L8-1株系被鑒定為暹羅芽孢桿菌（B. siamensis），H2-1株系和L9株系為枯草芽孢桿菌（B. subtillus），H3-1株系為解蛋白芽孢桿菌（B. proteolyticus），株系L7和F8-2經鑒定屬于同一個種高地芽孢桿菌（B. altitudinis）。

3 討論

自然界中產纖維素酶微生物種類很廣，包括真菌、細菌和放線菌。一般真菌產生的纖維素酶活性比細菌高，但細菌具有發酵產酶時間短、產纖維素酶使用范圍廣等優點。研究報道，在瘤胃中發現蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）均可產纖維素酶，但是酶活不一［12-13］。高雙喜等［14］從瘤胃中分離的暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）株系H-7，CMC酶活性最高為0.18 U·mL-1，FPA酶活性最高為0.44 U·mL-1，降解的濾紙條在第3 d接近糊狀。對于暹羅芽孢桿菌的研究報道較多，主要在抗菌活性［15］、產纖溶酶［16］等起作用。本研究篩選得到暹羅芽孢桿菌株系L8-1的酶活性均較高于株系H-7，這表明株系L8-1降解纖維效果比H-7好。同時，也證實暹羅芽孢桿菌具有產纖維素酶的活性，為該菌的進一步應用提供了廣泛的空間。孫尹雙等［17］以奶牛瘤胃液為篩選源得到枯草芽孢桿菌株系BX1-12，其產纖維素酶活高達27.33 U·mL-1。Daniel［18］研究發現，在豬飼料中施用枯草芽孢桿菌可以為豬提供酶的來源，有助于營養消化和飼料的利用，從而提高生長效率。本研究在瘤胃液中和牛糞便中篩選得到的高地芽孢桿株系L7和F8-2也具有一定的產纖維素酶的能力。國內外關于解蛋白芽孢桿菌應用研究的報道甚少，解蛋白芽孢桿株系系CFR3001是從魚類加工廢料中分離的產堿性蛋白酶的細菌，可抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesbacteria Lister）和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）等多種病原體的生長［19］。本研究在蝗蟲的腸道末中篩選得到解蛋白芽孢桿菌株系H3-1具有一定的產纖維素酶能力，為解蛋白芽孢桿菌功能的進一步研究提供了依據。酶活性的不同與株系的種屬及纖維素酶的組成有關。通過對D/d值與纖維素降解菌酶活性相關性分析，發現纖維素的酶活性是影響水解圈大小的關鍵因素。纖維素酶是多組分酶，包括葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶等。FPA酶活性則代表纖維素酶組分的總活力，反映了3類酶組分的協同作用［20］。

通過對篩選不同來源株系的酶活性比較，來源于瘤胃液中纖維素降解菌酶活性優于肉牛糞便中降解菌的酶活，來源于蝗蟲腸道末的株系酶活性較差，不同降解纖維素的株系酶活不同，這可能與不同株系在不同宿主動物的存活環境有關。瘤胃微生物由細菌，真菌及原蟲等組成。其中，細菌（包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌）在瘤胃中數量最多，每毫升瘤胃液中細菌數量超過1011個［21］。在草料或飼料進入瘤胃時，瘤胃的規律性蠕動使得瘤胃纖維降解細菌快速與新攝入的草料或飼料發生最初的物理性接觸［22］。截至目前，已從多種反芻動物的瘤胃中篩選出纖維素降解菌［23-25］。而昆蟲并沒有發達的瘤胃，導致相同菌種的生存環境不同進而導致酶活不同。這三種來源的纖維素降解菌各有不同，其他來源（土壤、廢紙漿、溫泉等）的纖維素降解菌安全性存在問題，不便直接運用于畜牧業中的飼料加工及飼喂。昆蟲腸道來源的纖維素降解菌相比于其他來源纖維素降解菌具有更安全的特性，但相比于瘤胃來源的纖維素降解菌，其對木質纖維素的降解能力較弱，所以瘤胃源纖維素降解菌是最好的資源庫。

4 結論

本研究共篩選出6個降解纖維素能力較強的株系，其中來源于瘤胃液的最強，肉牛糞便次之，蝗蟲最弱，為高效纖維素降解株系篩選提供借鑒。其中降解能力最強的株系為L7其FPA，CMC，C1和β-Gase的酶活性分別為4.28，1.89，5.57，2.30 U·mL-1。篩選得到高效降解纖維素株系為纖維素的處理與加工及飼料生產等提供了微生物資源。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-12-18；修回日期：2024-01-28

基金項目：河北農業大學引進人才科研專項（YJ201826）；河北省現代農業產業技術體系建設專項資金（HBCT2023160205）資助

作者簡介：陳歡（1999-），男，滿族，河北承德人，碩士研究生，主要從事動物營養與飼料科學研究，E-mail：17772517152@163.com；*Author for correspondence，E-mail：hebeigrass@163.com