紫花苜蓿耐鹽性相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及表達(dá)分析

摘要：NAC（NAM，ATAF1/2，CUC2）是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，可調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫。本研究基于鹽脅迫下紫花苜蓿（Medicago sativa L.）耐鹽品種GIB和鹽敏感品種LS根和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選出17個(gè)差異表達(dá)的MsNAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并對(duì)其序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化、順式作用元件及鹽脅迫下的表達(dá)模式等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，17個(gè)MsNACs均具有NAC典型的NAM結(jié)構(gòu)域，且蛋白結(jié)構(gòu)相似。系統(tǒng)進(jìn)化分析將17個(gè)MsNACs分成8個(gè)亞族，各亞組成員具有高度相似的保守基序。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，有15個(gè)MsNACs具有ABA響應(yīng)順式元件ABRE。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)模式分析與RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示MsNAC1，MsNAC2，MsNAC35，MsJUB1和MsNAC40基因在鹽處理下GIB葉中上調(diào)表達(dá)，在LS葉中下調(diào)或者未發(fā)生變化，推測(cè)這些基因參與調(diào)控紫花苜蓿的耐鹽反應(yīng)。本研究為進(jìn)一步研究紫花苜蓿NAC轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽脅迫功能提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；NAC；鹽脅迫；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

中圖分類(lèi)號(hào)：S541 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）04-1055-13

Excavation and Expression Analysis of NAC Transcription Factors Related to Salinity Resistance of Medicago sativa

RONG Meng-ru1， YU Ru-gang1， WEI Ying-ming1， WANG Guo-liang2， DU Xue-ling1*， YANG Gai-mei1， GAO Jia-jia1

Abstract：NAC （NAM，ATAF1/2 and CUC2） is a typical family of transcription factors in plants，which can regulate the response of plants to salinity stress. Based on the root and leave transcriptome analysis of two M. sativa cultivars differing in salinity tolerance，i.e.，GIB （salinity-tolerant） and LS （salinity-sensitive） under salinity stress，17 differentially expressed MsNAC members of the MsNAC transcription factor family were identified，and their sequence characteristics，phylogenetic relationship，cis-elements，and expression patterns under salinity stress were analyzed by bioinformatics methods. The results showed that 17 MsNAC members had typical NAM domains of NAC transcription factor，and their protein structures were similar. These 17 members were divided into 8 subgroups by phylogenetic analysis，and members within the same subgroup showed highly similar conserved motifs. Cis-elements analysis showed that 15 out of 17 MsNACs had ABA-responsive cis-element ABRE. The expression pattern analysis by RNA-seq and RT-qPCR showed that MsNAC1，MsNAC2，MsNAC35，MsJUB1 and MsNAC40 genes were up-regulated by salinity treatment in leaves of GIB，while down-regulated or unchanged in LS，suggesting that these genes were involved in regulating the salinity tolerance of M. sativa. The study provided reference for further study on the function of NAC transcription factor in M. sativa in response to salinity stress.

Key words：Medicago sativa L.;NAC;Salinity stress;Bioinformatics analysis;Expression patterns

土壤鹽漬化已成為世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)面臨的主要非生物脅迫之一［1-2］。鹽漬化的土壤通過(guò)氧化脅迫、滲透壓脅迫、離子平衡脅迫等途徑嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)、代謝和作物產(chǎn)量［3］。隨著人口增加，合理利用和開(kāi)發(fā)鹽漬化土地對(duì)現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。其中，挖掘耐鹽種質(zhì)及基因和培育耐鹽作物新品種是合理利用和開(kāi)發(fā)鹽漬化土地的一種有效途徑。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是優(yōu)良的多年生豆科牧草，其栽培歷史悠久且種植面積廣泛，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是地球上重要的植物種質(zhì)資源，為支持畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展做出了貢獻(xiàn)，被譽(yù)為“牧草之王”［4］。紫花苜蓿屬于非鹽生植物，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到土壤鹽漬化的影響［5］。但是，與其他牧草相比，紫花苜蓿具有較高的耐鹽性［6］，可作為鹽漬化土壤改良利用的首選牧草植物。不同品種紫花苜蓿之間的耐鹽性存在顯著差異［7-8］，篩選紫花苜蓿耐鹽品種，分離調(diào)控耐鹽性狀關(guān)鍵基因，可為紫花苜蓿進(jìn)一步的遺傳育種和品質(zhì)改良提供重要基因資源。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）在植物逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物及非生物脅迫反應(yīng)中均具有重要調(diào)控作用［9］。NAC最顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是編碼蛋白的N端均存在1個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，包含保守的A，B，C，D，E五個(gè)區(qū)；NAC結(jié)構(gòu)域也是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子中最大的一組中高度保守的氨基酸基序（約150～160個(gè)氨基酸）［10］。NAC蛋白C端氨基酸序列高度變異被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)（Transcriptional activation region），在蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中起激活子或者抑制子的功能［11］。

NAC轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)激素響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及生物應(yīng)激防御反應(yīng)等方面參與植物抵御非生物脅迫過(guò)程中的生長(zhǎng)調(diào)控［12-14］。近些年來(lái)，有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控耐鹽性已在多種植物中廣泛報(bào)道，如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［15］、海馬齒（Sesuvium portulacastrum）［16］和大豆（Glycine max）［17］中都鑒定出響應(yīng)鹽脅迫的NAC基因。番茄中過(guò)表達(dá)擬南芥JUNGBRUNNEN1（AtJUB1）基因，通過(guò)促進(jìn)脯氨酸的合成維持鹽脅迫下植物體內(nèi)水分含量，提高轉(zhuǎn)基因番茄株系的耐鹽能力［18］；過(guò)表達(dá)大豆GmNAC06基因株系通過(guò)增加脯氨酸和甜菜堿含量緩解ROS傷害，從而提高其耐鹽性［19］。敲除水稻OsNAC45基因會(huì)引起根中ROS積累進(jìn)一步加劇鹽脅迫的傷害［20］。目前，紫花苜蓿中鹽脅迫應(yīng)答NAC轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)分析和挖掘還鮮有報(bào)道。因此，本研究基于兩個(gè)品種在0和200 mmol·L-1NaCl處理下根和葉的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，挖掘響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)紫花苜蓿MsNACs基因，并對(duì)它們進(jìn)行序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位和順式作用元件等生物信息學(xué)分析，結(jié)合基因表達(dá)模式進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。研究結(jié)果為選育紫花苜蓿耐鹽品種和創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以紫花苜蓿品種GIB（高耐鹽性，G）和LS（鹽敏感性，L）為材料［7-8］，種子分別來(lái)源于北京百斯特草業(yè)有限公司和美國(guó)Legacy Seeds公司。選取顆粒飽滿、大小均一的種子置于8% NaClO溶液中消毒15 min，然后將種子接種在濕潤(rùn)的濾紙上，置于25℃下催芽2 d，出芽后種植在以河沙為基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽（13 cm×12 cm）中，25℃下光照16 h，黑暗8 h。播種1周后，將長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗移至含霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.8）的聚乙烯盆中培養(yǎng)（8株·盆-1）。培養(yǎng)1周后，使用含有0和200 mmol·L-1 NaCl溶液的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液處理，每2 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理2周后，分別取根和葉樣品，經(jīng)液氮冷凍后-80℃冰箱保存用于RT-qPCR驗(yàn)證分析。

1.2 參與紫花苜蓿鹽脅迫響應(yīng)的NAC轉(zhuǎn)錄因子鑒定

以GIB和LS為材料，設(shè)置0和200 mmol·L-1 NaCl 2個(gè)處理，進(jìn)行了根和葉的De novo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳到中國(guó)生物信息中心（Genome Sequence Archive，GSA，https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa/）（提交編號(hào)：SUBPRO028720）。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將鑒定的基因在NR，NT，PFAM，Swiss-Prot，GO和KEGG等6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，然后使用轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDB （http：//planttfdb.gao-lab.org）對(duì)所有基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子家族歸類(lèi)，鑒定兩個(gè)品種中所有MsNAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因。然后，以|log2（fold change）|≥1和Qlt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因。將篩選的差異表達(dá)MsNAC家族基因的FPKM值經(jīng)log2（FPKM+1）標(biāo)準(zhǔn)化繪制鹽脅迫下紫花苜蓿MsNAC基因的表達(dá)模式圖。同時(shí)，將獲得的NAC家族基因序列，與“新疆大葉”四倍體紫花苜蓿參考基因組［21］（https：//figshare.com/articles/dataset/genome_fasta_sequence_and_annotation_files/12327602）進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲得候選基因CDS的完整序列用于進(jìn)一步分析。

1.3 蛋白理化特性分析、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對(duì)17個(gè)MsNACs轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、總平均疏水?dāng)?shù)、脂肪系數(shù)及不穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SOPMA（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件對(duì)紫花苜蓿NAC蛋白家族蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)進(jìn)行分析；采用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ Cell-PLoc-2/）在線軟件對(duì)紫花苜蓿NAC蛋白家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 蛋白結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基于基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)NCBI CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線工具進(jìn)行MsNACs蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析。使用DNAMAN8.0軟件對(duì)篩選出的MsNACs氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并分析其保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和蛋白序列。利用MEGA11.0軟件構(gòu)建MsNACs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用在線軟件Multiple EM for Motif Elicitation （MEME，https：//meme-suite.org/meme/tools/streme）對(duì)MsNACs蛋白進(jìn)行保守Motif檢索，設(shè)定Motif數(shù)量為8，導(dǎo)出結(jié)果后采用TBtools［22］軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理和分析。

1.5 紫花苜蓿MsNACs基因染色體定位分析

通過(guò)TBtools軟件，從基因組的注釋文件中獲取組裝的染色體信息及MsNACs基因的染色體定位信息，根據(jù)MsNACs基因在染色體上的順序進(jìn)行可視化處理，并繪制定位圖。

1.6 紫花苜蓿MsNACs蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

從PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/family.php？sp=Athamp;fam=NAC）轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。使用MEGA11.0軟件，采用鄰位連接法構(gòu)建紫花苜蓿MsNACs與擬南芥AtNACs的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)，根據(jù)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族分類(lèi)［23］對(duì)篩選出的紫花苜蓿MsNACs蛋白進(jìn)行亞族鑒定與分組。

1.7 紫花苜蓿MsNAC基因順式作用元件分析

從基因組中提取17個(gè)MsNACs基因啟動(dòng)子序列（起始密碼子上游的2 000 bp），提交到Plant-CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。根據(jù)獲得的基因啟動(dòng)子序列和順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果，利用TBtools軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，繪制17個(gè)NAC基因的順式作用元件圖。

1.8 紫花苜蓿MsNAC基因RT-qPCR分析

利用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒（TIANGEN公司）提取0和200 mmol·L-1 NaCl處理下GIB和LS根和葉的總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用Aurora-900型超微量分光光度計(jì)（杭州海沛儀器有限公司）檢測(cè)總RNA濃度。然后，使用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。使用NCBI primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast）在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)MsNACs基因的特異性引物（表1），其中Actin為內(nèi)參基因。RT-qPCR使用ABI7300定量PCR系統(tǒng)，利用SYBR Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)體系中含有上下游引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、SYBR Premix Ex TaqTM I 10 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL和無(wú)菌水6.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用 2-ΔΔCt方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下紫花苜蓿MsNACs轉(zhuǎn)錄因子鑒定

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定到2 626個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族基因，其中有77個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)基因，并最終篩選出17個(gè)差異表達(dá)的MsNACs基因（表2）。同時(shí)，對(duì)17個(gè)MsNACs蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，顯示CDS序列長(zhǎng)度介于618～1 416 bp之間，其編碼蛋白質(zhì)序列的氨基酸數(shù)量介于206（MsNAC34）～472（MsNAC69）aa之間，平均氨基酸數(shù)量為322個(gè)（表3）。

2.2 紫花苜蓿MsNACs蛋白序列理化性質(zhì)分析

利用ExPASy在線軟件對(duì)17個(gè)紫花苜蓿MsNACs氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，17個(gè)MsNACs的分子量介于25.53 kDa（MsNAC34）～54.83（MsNAC69）kDa之間；理論等電點(diǎn)（PI）介于4.24～8.71之間，平均等電點(diǎn)為6.95，其中有8個(gè)蛋白等電點(diǎn)大于7.5，為堿性蛋白，9個(gè)蛋白等電點(diǎn)小于7.5，為酸性蛋白。17個(gè)MsNACs蛋白脂肪系數(shù)為53.01～76.55，不穩(wěn)定系數(shù)為30.35～52.27，其中有7個(gè)穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，剩余10個(gè)為不穩(wěn)定蛋白；蛋白平均疏水指數(shù)顯示17個(gè)MsNAC蛋白均為親水性蛋白，MsNAC77的親水性系數(shù)最低為-0.893，MsNAC34的親水性系數(shù)最高為-0.417（表3）。

通過(guò)SOPMA在線軟件對(duì)17個(gè)MsNACs進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示17個(gè)MsNACs蛋白均具有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。此外，利用TMHMM在線軟件分析顯示除MsNAC40蛋白在348～370 aa存在跨膜結(jié)構(gòu)外，其余16個(gè)MsNACs蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)Cell-PLoc 2.0在線軟件對(duì)17個(gè)MsNACs蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)17個(gè)MsNACs蛋白均定位在細(xì)胞核中（表3）。

2.3 紫花苜蓿MsNACs蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的CDD在線工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)17個(gè)MsNACs基因編碼的蛋白質(zhì)都含有保守的NAM結(jié)構(gòu)域（圖1）。其中，大多數(shù)MsNACs蛋白僅1個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，MsNAC69具有2個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，利用DNAMAN 8.0軟件對(duì)17個(gè)MsNACs氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白均含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，即A，B，C，D，E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，但有少數(shù)蛋白的五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域不夠完整（圖2）。在MsNACs蛋白的五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域中A，C，D穩(wěn)定性高，E亞結(jié)構(gòu)域最不穩(wěn)定。

2.4 紫花苜蓿MsNACs蛋白保守基序分析

為了進(jìn)一步研究MsNACs的特征，利用MEGA 11.0軟件對(duì)17個(gè)MsNACs蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，同時(shí)利用MEME在線軟件對(duì)MsNACs蛋白進(jìn)行保守基序檢索，基于TBtools軟件可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖3A，將8種保守基序命名為Motif1—Motif8，17個(gè)MsNACs中除MsNAC34（無(wú)Motif1和Motif5），MsNAC40（無(wú)Motif5），MsNAC77（無(wú)Motif5），MsNAC69（無(wú)Motif2和Motif5）外都含有Motif1，Motif2，Motif3，Motif4和Motif5。其中MsNAC1，MsNAC1-2和MsNAC2-2含有的基序基本一致，還同時(shí)含有Motif6和Motif7（圖3A）。圖3B中每個(gè)Motif中的氨基酸殘基的字符越大，表明該氨基酸位點(diǎn)的保守性強(qiáng)且穩(wěn)定。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同一亞族的NAC家族成員保守基序種類(lèi)和排布十分相似，因此，同一亞組的NAC成員可能具有相似的生物功能。

2.5 紫花苜蓿MsNACs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

NAC蛋白家族在擬南芥（A. thaliana）中可分為兩大族，其中又分為18個(gè)亞族［23］。本研究使用MEGA11.0軟件，采用鄰位連接法將17條紫花苜蓿MsNACs蛋白序列和138條擬南芥AtNACs蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，篩選出的17條紫花苜蓿MsNACs蛋白共分為8個(gè)亞族（圖4）。各亞族包含數(shù)量不等的MsNACs，其中ATAF亞族包含蛋白數(shù)量最多有5個(gè)，分別是MsNAC1，MsNAC1-2，MsNAC2，MsNAC2-2和MsNAC35；MsNAC10屬于ONAC003亞族；MsNAC69屬于ANAC001亞族；MsNAC40屬于OSNAC8亞族；MsNAC8，MsNAC72，MsNAC88屬于AtNAC3亞族；MsNAC37，MsNAC77，MsNAC100屬于NAM亞族；MsNAC34屬于NAC1亞族。

2.6 紫花苜蓿MsNACs染色體定位

根據(jù)參考基因組的注釋信息，采用TBtools軟件對(duì)篩選出的17個(gè)MsNACs轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行染色體定位分析。結(jié)果顯示，17個(gè)MsNACs定位到10條染色體上呈不均勻分布。其中chr8.4染色體上定位到的基因數(shù)量最多有4個(gè)；chr2.3染色體上有3個(gè)，chr3.3和chr3.4染色體上各有2個(gè)；chr2.4，chr7.4，chr3.1，chr4. 2，chr5.4和chr3.2染色體上各定位1個(gè)。另外，MsNAC34和MsNAC35，MsNAC8，MsNAC88在染色體chr3.4和chr8.4上分布密集，推斷其為2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇（圖5）。

2.7 紫花苜蓿MsNACs順式作用元件預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步分析紫花苜蓿MsNAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控耐鹽性相關(guān)的功能，本研究對(duì)17個(gè)MsNACs基因的啟動(dòng)子區(qū)域（上游2 000 bp）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)。去除無(wú)特殊意義的常見(jiàn)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和未知功能元件，共檢測(cè)到583個(gè)順式作用元件，與植物響應(yīng)脅迫有關(guān)的順式作用元件有284個(gè)，其中激素響應(yīng)元件數(shù)量最多有195個(gè)，包括脫落酸（ABA）響應(yīng)順式作用元件（ABRE）、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件（TGACG-Motif和CGTCA-Motif）、赤霉素（GA）應(yīng)答元件（GARE-Motif，P-box和TATC-box）、水楊酸（SA）反應(yīng)的順式作用元件（TCA-element）和生長(zhǎng)素（IAA）相關(guān)反應(yīng)元件（TGA-element和AuxRR-core），分布在17個(gè)MsNACs啟動(dòng)子序列中（圖6）。

在非生物脅迫響應(yīng)元件中，大部分成員都涉及低溫、無(wú)氧誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)等響應(yīng)元件。在激素響應(yīng)元件中，除MsNAC37與MsNAC40外其他15個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員都含有ABA誘導(dǎo)元件（ABRE）。除MsNAC3，MsNAC10和MsNAC100基因外其他14個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員都含有參與MeJA反應(yīng)的順式作用調(diào)控元件。因此，MsNACs轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控紫花苜蓿的耐鹽反應(yīng)。

2.8 紫花苜蓿MsNACs基因鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

基因表達(dá)模式分析是關(guān)鍵性狀基因挖掘的基礎(chǔ)，為了獲得鹽脅迫下紫花苜蓿NAC家族基因的表達(dá)模式，根據(jù)0和200 mmol·L-1 NaCl處理下GIB和LS的根（G0-R，G200-R，L0-R和L200-R）和葉（G0-L，G200-L，L0-L和L200-L）的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以FPKM值經(jīng)log2（FPKM+1）進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪制17個(gè)差異表達(dá)NAC家族基因的熱圖（圖7）。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，將17個(gè)基因分為兩個(gè)大組：高表達(dá)基因組（MsNAC2-2，MsNAC1，MsNAC40，MsNAC35，MsNAC2，MsNAC77，MsNAC88，MsNAC8和MsNAC72）與低表達(dá)基因組（MsNAC1-2，MsNAC37，MsNAC69，MsJUB1，MsNAC3，MsNAC100，MsNAC10，MsNAC8和MsNAC72）。在鹽脅迫下高表達(dá)組中MsNAC1，MsNAC2-2，MsNAC8，MsNAC77，MsNAC72和MsNAC88基因在GIB、LS兩個(gè)品種中葉片表達(dá)量均高于對(duì)照組，而MsNAC2，MsNAC35，MsNAC40基因在GIB中表達(dá)量高于對(duì)照組，在LS中的表達(dá)量低于對(duì)照組或基本保持不變，其中NAC40在GIB葉片中的表達(dá)量顯著高于在LS中的表達(dá)量。鹽脅迫下低表達(dá)組中的MsJUB1，MsNAC34和MsNAC10基因在GIB、LS葉片中表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中MsJUB1在GIB葉片中的表達(dá)量高于在LS中的表達(dá)量，MsNAC34基因在GIB葉片中的表達(dá)量顯著低于在LS中的表達(dá)量。此外，MsNAC1，MsNAC2，MsNAC35，MsJUB1和MsNAC40基因在鹽脅迫下GIB葉中上調(diào)表達(dá)，在LS葉中下調(diào)或者未發(fā)生變化。

2.9 紫花苜蓿MsNACs基因RT-qPCR驗(yàn)證分析

本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證分析了鹽脅迫下GIB和LS品種的根（圖8A）和葉（圖8B）中10個(gè)差異表達(dá)MsNACs基因（MsJUB1，MsNAC1，MsNAC2，MsNAC8，MsNAC10，MsNAC35，MsNAC40，MsNAC69，MsNAC72 和MsNAC7）的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，兩個(gè)品種中的10個(gè)基因在響應(yīng)NaCl脅迫下的表達(dá)量均有一定差異。GIB根和葉中，10個(gè)基因在NaCl處理下均呈不同程度上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖8）。LS根中MsNAC1，MsNAC2，MsNAC8，MsNAC10基因在NaCl處理下下調(diào)表達(dá)，MsNAC40與MsNAC77基因表達(dá)量未發(fā)生變化，MsJUB1，MsNAC35，MsNAC69與MsNAC72基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖8A）。LS葉中，除MsNAC8與MsNAC10基因外，其余8個(gè)MsNACs基因在NaCl處理下均呈不同程度的下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖8B）。

3 討論

NAC作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族在植物基因組中分布廣泛，并參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物響應(yīng)逆境脅迫等過(guò)程的調(diào)控［24］。本文基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從紫花苜蓿中篩選出17個(gè)在鹽脅迫下差異表達(dá)的MsNACs轉(zhuǎn)錄因子家族成員。通過(guò)對(duì)17個(gè)MsNACs蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白的親水性良好且都為熱穩(wěn)定性蛋白。NAC轉(zhuǎn)錄因子N端是有約150個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，三維結(jié)構(gòu)由多個(gè)反向平行的β折疊和α螺旋組成［10，25］。17個(gè)MsNACs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，其次是延伸鏈和小部分β-折疊。大部分NAC轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核，有些NAC轉(zhuǎn)錄因子C端含有跨膜元件［26］。本研究鑒定出的17個(gè)MsNACs蛋白均定位在細(xì)胞核中，除MsNAC40蛋白在348～370 aa存在跨膜結(jié)構(gòu)外，其余16個(gè)MsNACs蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，N端蛋白是一段保守的結(jié)構(gòu)域，C端是多變的轉(zhuǎn)錄激活域。N端的保守結(jié)構(gòu)域由A、B、C、D、E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，這些特定的結(jié)構(gòu)與核定位相關(guān)也與下游靶基因DNA序列的識(shí)別與結(jié)合密切相關(guān)，C端結(jié)構(gòu)則具有轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用［10］。通過(guò)對(duì)17個(gè)MsNACs蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)除極小部分MsNACs蛋白序列B、D亞結(jié)構(gòu)域不完整外，其余蛋白都含有NAC轉(zhuǎn)錄因子特有的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A-E），與NAC蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相符合。

啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，17個(gè)MsNAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中除MsNAC37與MsNAC40外，其余15個(gè)基因的啟動(dòng)子序列上都分布有個(gè)數(shù)不等的ABA響應(yīng)主要順式元件ABRE。研究報(bào)道，植物NAC轉(zhuǎn)錄因子依賴ABA途徑能提高植物的耐鹽能力［27］。例如水稻OsNAC3調(diào)控ABA響應(yīng)和耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高植株對(duì)ABA的敏感性，增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的耐性［28］。此外，NAC轉(zhuǎn)錄因子還通過(guò)生長(zhǎng)素、赤霉素等植物激素調(diào)節(jié)參與植物的鹽脅迫響應(yīng)［29-30］。本研究中MsNAC34，MsNAC37，MsNAC2-2，MsNAC35，MsJUB1，MsNAC77，MsNAC100，MsNAC8，MsNAC40和MsNAC2基因啟動(dòng)子序列上均有赤霉素應(yīng)答元件（P-box，GARE-Motif和TATC-box）。MsNAC34，MsNAC37，MsNAC1-2，MsNAC2-2，MsNAC77，MsNAC77，MsNAC100，MsNAC69，MsNAC3和MsNAC72基因啟動(dòng)子序列上均有生長(zhǎng)素相關(guān)反應(yīng)元件（TGA-element和AuxRR-core）。因此，推測(cè)這些基因可能通過(guò)生長(zhǎng)素、赤霉素等途徑調(diào)控紫花苜蓿響應(yīng)鹽脅迫。

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族被分為2個(gè)大族（I、II）和18個(gè)亞族［23］，且同一亞族的NAC基因具有相似的功能［13，31］。本研究結(jié)合擬南芥序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，將17個(gè)MsNACs分為8個(gè)亞族。其中，紫花苜蓿MsNAC1，MsNAC1-2，MsNAC2，MsNAC2-2，MsNAC35屬于ATAF亞族，與同亞族擬南芥AtNAC2和水稻OsNAC6基因高度同源。AtNAC2在鹽和重金屬的脅迫下能夠促進(jìn)植物側(cè)根生長(zhǎng)，抑制主根生長(zhǎng)以減少脅迫帶來(lái)的損害，從而提高了植物耐鹽性［30］。水稻中過(guò)表達(dá)OsNAC6基因提高了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱、高鹽等脅迫的耐性［32］。本研究中MsNAC1，MsNAC1-2，MsNAC2，MsNAC2-2和MsNAC35具有更相似保守基序（圖3A），其中MsNAC1，MsNAC2和MsNAC35基因在鹽脅迫下GIB葉中上調(diào)表達(dá)，在LS葉中下調(diào)或者未發(fā)生變化（圖7）。同時(shí)，RT-qPCR驗(yàn)證分析顯示MsNAC1，MsNAC2和MsNAC35基因在NaCl處理下GIB根和葉中均上調(diào)表達(dá)，且NaCl處理下GIB根和葉中的表達(dá)量均高于LS，因此推測(cè)這3個(gè)基因參與了GIB和LS品種耐鹽性差異的調(diào)控（圖8）。

MsNAC37，MsNAC77，MsNAC100屬于NAM亞族，水稻中敲除NAM亞族的OsNAC45基因引起根中ROS積累從而增加鹽脅迫傷害［20］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，鹽脅迫下MsNAC37，MsNAC77和MsNAC100基因在LS中的表達(dá)量高于GIB（圖7）。MsNAC8，MsNAC72，MsNAC88屬于AtNAC3亞族。研究表明，花生AhNAC2屬于AtNAC3亞族，可被ABA高效誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔大小來(lái)抵御干旱脅迫［33］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，鹽脅迫下MsNAC8，MsNAC72和MsNAC88基因在GIB和LS葉片中均上調(diào)表達(dá)，在根中均下調(diào)表達(dá)，同時(shí)在鹽脅迫下LS根和葉中的表達(dá)量均高于GIB（圖7）。因此，說(shuō)明MsNAC37，MsNAC77，MsNAC100，MsNAC8，MsNAC72和MsNAC88基因并不是兩個(gè)品種耐鹽性差異的調(diào)控因子。

MsJUB1與MsNAC3屬于ONAC022亞族，與同亞族中的擬南芥AT2G43000.1（AtJUB1）親緣關(guān)系最近。JUB1基因?qū)儆贜AC家族轉(zhuǎn)錄因子，番茄中過(guò)量表達(dá)擬南芥AtJUB1基因提高了鹽脅迫下的植物水分含量，從而提高耐鹽性［18］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，MsJUB1基因在鹽脅迫下兩個(gè)品種的根中下調(diào)表達(dá)，而葉中上調(diào)表達(dá)，同時(shí)NaCl處理下GIB葉中的表達(dá)量高于LS葉中（圖7）。此外，RT-qPCR驗(yàn)證分析顯示MsJUB1基因在NaCl處理下GIB根和葉中均顯著上調(diào)表達(dá)，且在NaCl處理下GIB根和葉中的表達(dá)量均高于LS。MsNAC69是ANAC001亞族成員，在響應(yīng)植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答等過(guò)程中發(fā)揮作用［34］。MsNAC34屬于NAC1亞族，研究顯示該亞家族中的基因參與調(diào)控植物根系發(fā)育［35］。MsNAC10屬于ONAC003亞族，水稻中敲除OsNAC3（ONAC003亞族）基因引起突變體芽中Na+積累增加鹽脅迫的敏感性［28］。MsNAC40屬于OSNAC8亞族，擬南芥AtNAC040基因通過(guò)GA途徑介導(dǎo)鹽脅迫環(huán)境下的種子萌發(fā)［29］。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，MsNAC34在鹽脅迫下兩個(gè)品種的根和葉片中均上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫下GIB根中的表達(dá)量高于LS，而在葉中LS的表達(dá)量高于GIB。MsNAC69在鹽脅迫下LS的根中上調(diào)表達(dá)，葉中下調(diào)表達(dá)，而在GIB根和葉中未發(fā)生變化（圖7）。MsNAC10在鹽脅迫下GIB和LS根和葉片上調(diào)表達(dá)，但是鹽脅迫下LS中的表達(dá)量高于GIB（圖7）。MsNAC40在鹽脅迫下GIB葉片中顯著上調(diào)表達(dá)，但是在LS葉中沒(méi)有變化（圖7），該結(jié)果與RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果一致（圖8）。因此，推測(cè)MsJUB1和MsNAC40基因可能參與GIB耐鹽性的正向調(diào)控（圖8）。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共鑒定到77個(gè)NAC家族的相關(guān)基因，并篩選獲得17個(gè)在鹽脅迫下差異表達(dá)的MsNACs。通過(guò)生物信息學(xué)分析明確了17個(gè)MsNACs轉(zhuǎn)錄因子的蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、染色體定位和順式作用元件等序列特征。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MsNAC1，MsNAC2，MsNAC35，MsJUB1和MsNAC40基因在鹽脅迫下GIB葉中上調(diào)表達(dá)，在LS葉中下調(diào)或者未發(fā)生變化，因此，推測(cè)這些基因是參與紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控的關(guān)鍵NAC轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步研究紫花苜蓿NAC轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽脅迫功能及作用機(jī)制提供有力支持。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-12-12；修回日期：2024-01-16

基金項(xiàng)目：安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2022AH050385）；安徽省重點(diǎn)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（202004a06020046）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）共同資助

作者簡(jiǎn)介：榮夢(mèng)茹（2000-），女，漢族，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理與生物技術(shù)研究，E-mail： rongmengru0525@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail： duxueling1208@126.com