柱花草SgALMT1基因克隆與表達分析

摘要：為探索鋁激活蘋果酸轉運蛋白（Aluminum-activated malate transporter，ALMT）在植物適應酸性土壤鋁毒害中的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）為研究材料，克隆了柱花草SgALMT1基因，并進行了生物信息學、亞細胞定位及基因表達分析。結果表明：SgALMT1基因全長為1 350 bp，編碼450個氨基酸殘基，蛋白分子量為50.6 kDa，包含6個跨膜結構域；亞細胞定位分析表明，SgALMT1蛋白定位在擬南芥原生質體細胞膜上，為膜蛋白。定量PCR結果表明，SgALMT1基因在柱花草葉中的表達量高于根中的表達量；鋁處理增強了SgALMT1基因在柱花草根中的表達，表明SgALMT1基因可能參與了柱花草應對鋁脅迫；另外，缺氮處理增強了SgALMT1基因在柱花草葉中的表達，而缺磷處理增強了SgALMT1在根中的表達。本研究結果為解析柱花草響應鋁毒害和養分缺乏的機理提供了候選基因資源。

關鍵詞：柱花草；鋁毒害；基因表達；蘋果酸；亞細胞定位

中圖分類號：S541 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）04-1078-09

Cloning and Expression Analysis of SgALMT1 in Stylosanthes guianensis

MIAO Ye LIU Huai-jin1， LIU Li-ting1， LUO Li-juan1， CHEN Zhi-jian2，3*

Abstract：To investigate the important role of aluminum （Al）-activated malate transporter （ALMT） in plant adaptation to Al toxicity in acidic soils，SgALMT1 gene was cloned from stylo （Stylosanthes guianensis），its bioinformation，subcellular localization and expression pattern were subsequently analyzed in this study. The results showed that the SgALMT1 gene was 1 350 bp in length，encoding 450 amino acids. The SgALMT1 protein possessed a molecular weight of 50.6 kDa and was predicted to include six transmembrane domains. Subcellular localization analysis in Arabidopsis protoplasts showed that SgALMT1 was localized on the plasma membrane，suggesting it was a membrane protein. RT-qPCR analysis demonstrated that the expression of SgALMT1 in leaves was higher than that in roots. Al treatment enhanced the expression of SgALMT1 in roots of S. guianensis，suggesting that SgALMT1 may be involved in the response of S. guianensis to Al toxicity. In addition，the transcripts of SgALMT1 in leaves was increased by nitrogen deficient treatment，while its expression was up-regulated in roots by phosphorus deficiency. Taken together，the study provides a candidate gene for dissecting the adaptative mechanism of S. guianensis to Al toxicity and nutrient deficiency.

Key words：Stylosanthes guianensis;Aluminium toxicity;Gene expression;Malate;Subcellular localization

酸性土壤是pH值低于5.5的土壤，占全球耕地面積50%以上，并主要分布在熱帶和亞熱帶地區［1-2］。在我國，酸性土壤主要分布在南方省區，約占全國耕地面積的21%［3］。在酸性土壤中，存在有影響作物產量的諸多不利因素，包括有機質含量低、鋁（Al）和錳（Mn）元素毒害以及磷（P）、鈣（Ca）和鎂（Mg）等營養元素缺乏［4］。其中，鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長的主要障礙因素之一。在低pH酸性條件下，土壤溶液中的鋁主要以3價鋁離子（Al3+）形式存在［5-6］，而鋁離子會抑制植物根尖細胞的伸長，減少植物對水分和養分的吸收［7］。植物在長期進化過程中形成了內部忍耐和外部排斥的耐鋁毒機制。內部忍耐機制包括有機酸在細胞質內螯合鋁和將鋁隔離在液泡等，而外部排斥機制包括根系分泌有機酸螯合鋁、提高根際pH值和細胞壁固定鋁等方面［2］。其中，根系分泌有機酸（如蘋果酸、檸檬酸和草酸）螯合鋁離子，阻止鋁進入根尖細胞，減少鋁的吸收被認為是植物耐鋁的重要機制［8-9］。

近年來，介導有機酸轉運的基因已被克隆，其生物學功能也已被鑒定。例如，鋁激活蘋果酸轉運蛋白（Aluminum-activated malate transporter，ALMT）負責蘋果酸的轉運，而多藥物及毒性化合物外排轉運蛋白（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）負責檸檬酸的轉運［9］，它們在植物耐鋁中發揮重要作用。小麥（Triticum aestivum）TaALMT1是首個被克隆的植物ALMT基因。TaALMT1是細胞膜蛋白，該蛋白能被鋁離子激活表達，在鋁脅迫下參與根系蘋果酸的轉運，從而增強小麥的耐鋁能力［10］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［11-13］、油菜（Brassica napus）［14］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［15］和大豆（Glycine max）［16-17］等植物中也相繼報道了ALMT的同源基因。例如，在擬南芥中，包含有14個AtALMTs基因［11-13］。AtALMT1也被發現具有介導蘋果酸轉運從而參與鋁耐受性的功能，而AtALMT6和AtALMT9參與了氣孔調節［11-13］。另外，在油菜中共鑒定到39個BnALMTs基因［18］，其中，BnALMT1和BnALMT2具有調控蘋果酸轉運的功能，外源表達BnALMT1和BnALMT2均增強了煙草（Nicotiana tabacum）細胞的耐鋁性［19］。因此，ALMT家族成員在響應鋁脅迫、氣孔調節和陰離子平衡等方面發揮作用［20］。

柱花草（Stylosanthes guianensis）是重要的熱帶豆科牧草，起源于熱帶和亞熱帶地區。柱花草可廣泛用于綠肥覆蓋、果園間作和牧草飼料等方面［21］。因柱花草種植于熱帶亞熱帶地區，而這些地區同時也是酸性土壤分布的主要區域，表明柱花草對酸性土壤養分逆境脅迫具有較強的適應性，是研究植物適應酸性土壤生長的豆科先鋒牧草［22-23］。前期研究對不同柱花草的耐鋁能力進行了評價分析［24-25］，發現柱花草蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶具有調控根系蘋果酸合成的生物學功能，參與了柱花草響應酸鋁脅迫［26-27］。然而，迄今為止，未有對柱花草蘋果酸轉運蛋白基因進行克隆及分析的報道，蘋果酸參與柱花草耐鋁毒的分子機制仍不清楚。因此，本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，并進行了生物信息學、亞細胞定位及基因表達分析，為深入研究SgALMT1基因參與柱花草耐鋁毒的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料為‘熱研5號’圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料培養及處理 柱花草種子去種皮后放入裝有去離子水的離心管中，并置于80℃水浴鍋中加熱3 min，隨后將種子平鋪在放有浸濕濾紙的培養皿中，避光萌發2～3 d。將萌發后的柱花草幼苗轉移至Hoagland營養液（pH 5.8）中進行培養［28］。柱花草正常培養28 d后，分別進行以下處理：①收獲葉和根系樣品，并收獲距離根尖0～1 cm，1～2 cm和大于2 cm的不同根段樣品，用于基因組織表達分析［28］；②由于500 μmol·L-1CaCl2溶液可以有效維持細胞的滲透壓，因此，將柱花草轉移至含有0，100 μmol·L-1AlCl3，40 μmol·L-1CdCl3和20 μmol·L-1LaCl2的500 μmol·L-1CaCl2溶液（pH 4.2）中分別進行鋁（Al）、鎘（Cd）和鑭（La）處理［29］，處理24 h后收獲根系樣品，用于分析不同金屬處理對基因表達的影響；③將柱花草置于0，100，200和400 μmol·L-1 AlCl3處理液（pH 4.2）中，處理48 h后收獲根系樣品，另外，將柱花草置于200 μmol·L-1 AlCl3處理液（pH 4.2）中，分別于處理第0，12，24，36和48 h收獲根系樣品，用于基因表達分析；④將柱花草置于缺氮（-N）、缺磷（-P）和缺鉀（-K）的Hoagland營養液（pH 5.8）中［27］，處理14 d后，收獲葉和根系樣品，用于分析不同缺素處理對基因表達的影響。以上處理均包括3個生物學重復。

1.2.2 柱花草RNA的提取與cDNA的合成 取0.1 g柱花草葉或根系樣品用TRIzol Universal RNA提取試劑（Tiangen，中國）提取總RNA，取2 μg總RNA使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesie Kit試劑盒（Vazyme，中國）合成cDNA，cDNA置于—20℃保存備用。

1.2.3 SgALMT1基因的全長克隆 參考Song等［27］方法，獲得SgALMT1基因全長序列，根據基因序列信息設計全長克隆引物SgALMT1-ORF-F/R（表1）。以柱花草cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：2 μL 10× PCR buffer，1.6 μL dNTP，1 μL引物（10 μmol·L-1），0.1 μL Ex Taq（Takara，中國），1 μL cDNA模板，補充dd H2O至20 μL。PCR反應程序為：94℃ 4 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35次循環。獲得SgALMT1基因全長片段，將PCR產物連接到pMD18-T載體上（Takara，中國）。通過熱擊法，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α（上海唯地生物技術有限公司，中國），將菌液涂布到含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養基（10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl和15 g Agar）上，于37℃培養箱倒置培養12 h，挑取單克隆于LB液體培養基（10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和10 g NaCl）上，PCR鑒定陽性克隆后，于生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

1.2.4 SgALMT1基因生物信息學分析 使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白基本信息；通過InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）分析蛋白結構域；使用MEGA6來構建進化樹，并使用Evolview（Evolview：Tree View）進行進化樹美化。

1.2.5 SgALMT1基因實時熒光定量（RT-qPCR）分析 參考Song等［27］方法，用QuantStiduoTM Real-Time PCR（Thermo Fisher，美國）和SYBR Green（Vazyme，中國）進行基因表達分析。RT-qPCR反應體系為：10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6 μL dd H2O，1 μL引物（10 μmol·L-1），2 μL稀釋50倍的cDNA模板。RT-qPCR反應程序為：94℃ 1 min，94℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循環。以SgEF1a為內參基因計算基因的相對表達量。RT-qPCR引物如表1所示。

1.2.6 SgALMT1蛋白亞細胞定位分析 根據SgALMT1基因序列設計SgALMT1-GFP-F/R特異引物（表1）進行PCR擴增，并將PCR產物連接到pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp瞬時表達載體上［27］。參考Yoo等［30］制備原生質的方法，即切取2～4片生長3周的擬南芥葉片，并切成1 mm寬的長條，迅速放入10～15 mL酶解液（20 mmol·L-1嗎啉乙磺酸，含1.5% 纖維素酶R10、0.4% 離析酶R10、0.4 mol·L-1甘露醇和 20 mmol·L-1 KCl，pH 5.7）中，27℃ 70 r·min-1反應3 h。4℃ 100×g（離心力）離心2 min，棄上清液。加入5～10 mL預冷的W5溶液（2 mmol·L-1嗎啉乙磺酸含154 mmol·L-1 NaCl、125 mmol·L-1 CaCl2和5 mmol·L-1 KCl，pH 5.7），輕輕重懸沉淀，4℃ 100×g離心2 min，棄上清液。加入10 mL預冷的W5溶液，重懸沉淀，冰上靜置30 min，4℃ 100×g離心2 min，小心收集沉淀。加入適量預冷的MMG溶液（4 mmol·L-1 2-嗎啉乙磺酸含0.4 mol·L-1甘露醇和15 mmol·L-1 MgCl2，pH 5.7），小心重懸原生質體。取10 μL質粒加入至制備好的100 μL原生質體中，加入110 μL PEG（聚乙二醇）/Ca2+溶液，輕輕混勻，室溫放置15 min。加入500 μL W5溶液，輕輕混勻，100×g離心2 min，棄上清，重復該步驟2次，加入1 mL W5溶液混勻，室溫避光培養12 h。采用激光共聚焦顯微鏡Nikon C2（Nikon，日本）進行熒光觀察并拍照。

1.3 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2021進行數據分析和作圖。使用SPSS V26.0（SPSS Institute，美國）進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 柱花草SgALMT1基因全長克隆

本研究首先根據SgALMT1基因序列設計全長克隆引物，以柱花草cDNA為模板進行PCR擴增，獲得SgALMT1基因全長片段。DNA凝膠電泳分析發現，PCR產物片段在1 000～1 500 bp之間（圖1），經測序后發現，SgALMT1基因全長為1 350 bp。

2.2 SgALMT1蛋白特性和結構分析

利用Expasy在線工具分析發現SgALMT1蛋白包含450個氨基酸殘基，蛋白分子量為50.6 kDa，等電點為7.4，屬于親水性蛋白。利用InterPro在線工具分析發現SgALMT1蛋白屬于ALMT家族成員，包含ALMT蛋白的保守序列PF11744。此外，SgALMT1蛋白具有6個跨膜螺旋結構，分別位于N端的40～58，65～87，97～116，123～140，150～167和180～202氨基酸。

2.3 系統進化樹分析

系統進化樹分析表明，不同植物的ALMT蛋白可被分為3大組（圖2）。第1組包括擬南芥、大豆、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum），油菜等植物的ALMT蛋白；第2組包括大豆、水稻和擬南芥的ALMT蛋白；柱花草SgALMT1蛋白被分在第3組，與大豆的GmALMT3和水稻OsALMT1/3同源性較高，且與大豆GmALMT1、擬南芥的AtALMT3/4/5/6和繡球花（Hydrangea macrophylla）HmALMT9在同一大組中，表明其可能具有這些ALMT同源蛋白類似的功能。

2.4 SgALMT1蛋白亞細胞定位分析

本研究在擬南芥葉片原生質體中瞬時表達SgALMT1蛋白，分析SgALMT1的亞細胞定位情況。由圖3可以看出，空載體對照（35S∶GFP）的熒光信號在整個細胞中均可觀察到，并主要集中在細胞質中，而SgALMT1蛋白（35S∶SgALMT1-GFP）的熒光信號定位在細胞膜上，表明SgALMT1為膜蛋白，可能具有轉運功能。

2.5 柱花草SgALMT1基因組織表達分析

本研究進一步通過RT-qPCR方法分析了SgALMT1基因在柱花草葉和根中的表達情況。從圖4A可以看出，SgALMT1基因在葉和根中均有表達，且在葉中的表達量高于根中的表達量。另外，SgALMT1基因在不同根段中的表達差異不顯著（圖4B）。

2.6 不同金屬處理對SgALMT1基因表達的影響

從圖5可以看出，與對照（CK）相比，鋁（Al）處理顯著增強了SgALMT1基因在柱花草根中的表達，而鎘（Cd）和鑭（La）處理對SgALMT1基因表達的影響不顯著；在鋁處理下，SgALMT1基因的表達量是對照處理的7.5倍，差異顯著（圖5）。結果表明SgALMT1基因特異地響應金屬鋁毒害。

2.7 不同鋁濃度和鋁時間處理對SgALMT1基因表達的影響

由圖6A可以看出，隨著鋁處理濃度的增加，SgALMT1基因的表達量逐漸增加，當鋁濃度為200 μmol·L-1時，SgALMT1表達量達到最高，是對照處理（0 μmol·L-1）的2.8倍；類似的，隨著鋁處理時間的延長，SgALMT1基因的表達量逐漸增加，當鋁處理48 h后，SgALMT1表達量最高，是0 h處理條件下的110.0倍，差異顯著（圖6B）。

2.8 不同缺素處理對SgALMT1基因表達的影響

本研究進一步分析了缺氮（-N）、缺磷（-P）和缺鉀（-K）處理對SgALMT1基因在柱花草葉和根中表達的影響。如圖7A所示，與對照（CK）相比，缺氮處理顯著增強了SgALMT1基因在葉中的表達，而缺磷和缺鉀處理對SgALMT1基因表達的影響不顯著；與對照相比，缺磷處理顯著增加了SgALMT1基因在柱花草根中的表達，而缺氮和缺鉀處理對SgALMT1表達的影響不明顯（圖7B）。結果表明SgALMT1基因在葉和根中對缺素的響應有所差異。

3 討論

3.1 柱花草SgALMT1具備植物ALMT膜蛋白的結構特征

鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長和產量的重要障礙因素。在長期進化過程中，植物形成了多種耐鋁毒機制，其中，調節根系分泌蘋果酸是植物重要的耐鋁機制之一［2，31］。此外，蘋果酸也可作為滲透調節劑，參與氣孔調節、礦質營養吸收、果實酸度和種子發育調節等過程［32］。鋁激活蘋果酸轉運蛋白ALMT被報道具有轉運蘋果酸的生物學功能［33-35］。因此，本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，并對其蛋白結構進行了分析。以往研究發現，ALMT家族成員具有高度保守的二級結構，包括含有5～6個跨膜結構域的N端以及強親水性的C端［20］。N端由不同的基序組成，是離子通道并參與鋁信號傳導，而C端則調節了基因對鋁離子的響應，這些高度保守的結構特征表明了它們對ALMT蛋白的重要性［32，36］。與已報道的植物ALMT蛋白相似，柱花草SgALMT1包含ALMT蛋白的保守序列，且其N端具有6個跨膜螺旋結構，表明柱花草SgALMT1具備植物ALMT蛋白的典型結構特征。亞細胞定位分析發現，柱花草SgALMT1蛋白定位于細胞質膜上（圖3），屬于膜蛋白，進一步表明SgALMT1具有轉運蘋果酸的生物學功能。

3.2 SgALMT1可能參與不同的生理過程

蛋白系統進化分析表明，柱花草SgALMT1蛋白與大豆、水稻、擬南芥、番茄和小麥等植物ALMT蛋白被分在第3組（圖2）。在該組中，大豆GmALMT1是一種質膜定位的蘋果酸轉運蛋白，鋁處理會增強其編碼基因的表達，進一步分析發現GmALMT1具有介導根系分泌蘋果酸，提高轉基因大豆和擬南芥耐鋁能力的功能［16］。在繡球花中，HmALMT9蛋白也具有增強酵母細胞耐鋁能力的功能［37］。另一方面，擬南芥AtALMT4，AtALMT6和AtALMT9均定位于液泡膜上，被報道參與調節了保衛細胞運動［38-39］。AtALMT4可以介導液泡釋放蘋果酸，并且響應脫落酸而關閉氣孔，表明AtALMT4通過調節細胞內蘋果酸穩態響應干旱脅迫［39］。AtALMT6和AtALMT9也參與了液泡蘋果酸的運輸，且它們在液泡蘋果酸轉運中存在功能冗余［38］。在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlALMT5蛋白定位于內質網上，可以轉運蘋果酸和無機陰離子，如硝酸鹽和氯化物，超量表達SlALMT5提高了轉基因番茄成熟種子中蘋果酸和檸檬酸的含量，表明由SlALMT5介導轉運的蘋果酸影響了成熟種子中有機酸的含量［40］。因此，SgALMT1可能參與了柱花草不同的生理過程。

3.3 SgALMT1基因可能通過轉運蘋果酸參與柱花草耐鋁毒和低磷脅迫

基因表達分析表明，鋁處理增強了SgALMT1基因在柱花草根系中的表達（圖5和6）。研究表明，鋁處理能增強小麥［41］、擬南芥［42-43］、大豆［16］、苜蓿［15］、油菜［19］和黑麥（Secale cereale）［44］等植物ALMT同源基因的表達。例如，在大豆中，不同鋁濃度和鋁時間處理增強了GmALMT1在根系中的表達，且GmALMT1基因表達與根系蘋果酸分泌密切相關［16］。在苜蓿中，不同鋁時間處理也增強了MsALMT1基因的表達，并且，超量表達MsALMT1促進了轉基因煙草根系蘋果酸分泌，并增加了鋁脅迫下轉基因煙草的相對根長［15，45］。在繡球花中，鋁處理增強了多個HmALMTs基因的表達，且外源表達HmALMT9能顯著增強酵母細胞的耐鋁能力［37］。以上結果表明，鋁誘導表達的ALMT基因具有轉運蘋果酸、增強植物耐鋁能力的生物學功能。另外，本研究發現，缺氮和缺磷處理分別增強了SgALMT1基因在柱花草葉和根中的表達（圖7），表明SgALMT1可能參與了柱花草響應養分缺乏脅迫。類似的，大豆GmALMTs家族成員對磷饑餓表現出不同的響應，其中，受缺磷增強表達的GmALMT5具有轉運蘋果酸活化土壤難溶性磷的功能［17］。在柑橘（Citrus sinensis）中，缺磷處理也增強了CsALMT1的表達，表明其可能參與柑橘對磷饑餓的響應［46］。小麥TaALMT1和擬南芥AtALMT1也被報道參與了植物對缺磷的響應［47-48］。另一方面，SgALMT1基因在柱花草葉部的表達量高于根部，表明其在葉部中也發揮功能，但具體的生物學功能有待深入研究。

4 結論

本研究克隆了柱花草SgALMT1基因，發現SgALMT1蛋白定位于細胞質膜上。鋁處理增強了SgALMT1基因在根中的表達，表明了SgALMT1可能參與柱花草響應鋁毒害。本研究為深入解析SgALMT1介導蘋果酸參與柱花草耐鋁毒的生物學功能提供參考。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-12-24;修回日期：2024-02-23

基金項目：國家自然科學基金項目（31861143013，31672483）；財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系（CARS-34）資助

作者簡介：繆野（1999-），女，漢族，四川內江人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草抗逆研究，E-mail：3326848781@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：jchen@scau.edu.cn