銀杏酸純化、結(jié)構(gòu)修飾及活性研究進展*

楊兆麒，徐佳元，陳 旺，2，馮自立，2，3

(1 陜西理工大學，陜西 漢中 723000；2 陜西省天然活性產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000；3 秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建重點實驗室，陜西 漢中 723000)

銀杏葉中除了黃酮、內(nèi)酯等活性成分外，還含有具有毒副作用的烷基酚酸類化合物，包括一系列漆酚酸類銀杏酸(Ginkgolic acid，GA)，由于其具有致敏毒性[1]，2020年國家藥典規(guī)定銀杏酸在銀杏葉提取物中的含量不得超過5 mg/L，通常在銀杏葉提取物生產(chǎn)加工過程中需要專門工藝脫除。

銀杏酸是6烷基水楊酸或6烯基水楊酸的衍生物，主要由5種酚酸組成[2]，它們的差異主要在于烷基上側(cè)鏈的不同，即側(cè)鏈R為C13H27、C15H31、C15H29、C17H33和C17H31，即C13：0、C15：0、C15：1、C17：1和C17：2，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 銀杏酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of ginkgolic acid

銀杏酸具有強烈的殺蟲、抑菌、殺菌的作用[3]。近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗氧化[4]等多種藥理活性，在應(yīng)用于治療阿爾茨海默病等神經(jīng)衰退行性疾病方面的前沿上也具有廣闊的前景[5-9]。

1 銀杏酸的純化

1.1 銀杏果外種皮來源

銀杏外種皮中含有豐富的銀杏酚酸類物質(zhì)。沈鳳俊等[10]在研究銀杏外種皮中銀杏酸對真菌的抑制作用時，從銀杏外種皮中提取出銀杏酸粗品，通過大孔樹脂與硅膠純化后，經(jīng)HPLC分析得銀杏酸純度達69.18%。在祝娟娟[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，通過水洗與硅膠層析結(jié)合的方法及NaOH萃取法對銀杏酸進行純化，利用HPLC法進行銀杏酸含量的檢測，得到水洗法結(jié)合硅膠層析法的最優(yōu)工藝，水洗法可將銀杏酸的純度由33.9%提升到47.82%；硅膠層析法可將水洗后的銀杏酸純度提高至67.5%；NaOH溶液萃取法可將銀杏酸醇提液的純度由33.9%提高到62.3%。

唐仕榮等[12]采用大孔樹脂和高速逆流色譜聯(lián)合法，在以DM130為吸附樹脂，75%的乙醇溶液動態(tài)解吸條件下，銀杏酸的純度達到40.18%，在采用高速逆流色譜技術(shù)進一步純化后，高效液相色譜分析得到譜峰中的3個主要成分C13：0、C15：1和C17：1的面積比值分別達到了81.5%、95.1%和98.3%，研究前景十分廣泛。Heng Zhu等[13]的實驗研究中，建立了一種高效配位的高速逆流色譜法從銀杏種皮中制備分離銀杏酸。通過研究了配位劑的類型、濃度和機理，成功地分離了五種主要銀杏酸，包括C13：0、C15：0、C15：1、C17：1和C17：2，純度均大于98%。因此，采用高速逆流色譜法(HSCCC)分離銀杏酸具有消除不可逆吸附、高樣品回收率、低成本、低成本，樣品變性風險低，制備能力大[14-15]等優(yōu)點。

1.2 銀杏提取物副產(chǎn)物回收

近年來高純度銀杏酸在科研研究、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域上的應(yīng)用日益廣泛。安曉東等[16]在大孔樹脂脫除銀杏葉提取物中銀杏酸的工藝研究中，通過對比幾種大孔樹脂對銀杏酸靜態(tài)吸附能力的強弱，最后確定了大孔樹脂HDP5000的吸附效果最好，吸附量達60～70 mg/mL，很好的脫除銀杏葉提取物中的銀杏酸，為銀杏提取物副產(chǎn)物的回收提供了很好的指導作用。徐京[17]在溶劑萃取法脫除銀杏酸的工藝研究中，確定了最佳的銀杏酸脫除可回收的最佳體系，唐霖[18]在超臨界CO2流體萃取脫除銀杏葉提取物中銀杏酸的工藝中，優(yōu)化了吳向陽等[19]超臨界CO2脫除銀杏酸的工藝，結(jié)果也確實證明了此方法穩(wěn)定可行。

2 銀杏酸母核的結(jié)構(gòu)修飾

對銀杏酸的母核結(jié)構(gòu)進行修飾后，會使得其活性或其他的性能變得更具有可研究性，然而目前國內(nèi)外還尚無有關(guān)銀杏酸結(jié)構(gòu)修飾的報道，但銀杏酸與槚如酸結(jié)構(gòu)很相似，兩者母核都為水楊酸，且差異在于銀杏酸的側(cè)鏈碳原子數(shù)主要從13～19，且雙鍵數(shù)為0～2個，而槚如酸側(cè)鏈碳原子數(shù)為15，雙鍵數(shù)為0～3個，兩者的母核結(jié)構(gòu)具有相似性，因此使得槚如酸結(jié)構(gòu)修飾的方法對銀杏酸母核的結(jié)構(gòu)修飾具有可借鑒性。結(jié)構(gòu)式見圖2。因此本文對與銀杏酸同母核結(jié)構(gòu)的槚如酸結(jié)構(gòu)修飾作簡要綜述，以期對銀杏酸的研究提供參考。

圖2 槚如酸的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of cardanolic acid

2.1 烷基側(cè)鏈的修飾

與水楊酸相比，槚如酸的抗菌活性可能與側(cè)鏈烷基的存在有關(guān)，因此考慮到烷基側(cè)鏈的修飾。為清楚了解槚如酸基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)變化與其活性強弱的關(guān)系，Green等[20]合成了一系列槚如酸衍生物，這些衍生物在槚如酸苯環(huán)上均含不同的不飽和側(cè)鏈基團(C-8位有雙鍵)。此外，通過氧化裂解反應(yīng)，Swamy等[21]將槚如酸上的不飽和側(cè)鏈轉(zhuǎn)變?yōu)槿╊惢衔?，醛基與異煙肼配對得到N-異煙?；?N’-8-[(2’-羧基-3’-羥基)苯基]辛醛腙，有很好的抗菌活性。見圖3。

圖3 N-異煙酰基-N’-8-[(2’-羧基-3’-羥基)苯基]辛醛腙Fig.3 N-Isonicotinyl-N’-8-[(2’-carboxyl-3’-hydroxy)phenyl] octylaldehyde hydrazone

2.2 羧基和羥基的修飾

Paramashivappa等[22]以苯環(huán)側(cè)鏈為直鏈C15H31的槚如酸為原料，通過一系列的反應(yīng)，最終合成了苯并咪唑/苯并噻吩/苯惡唑的衍生物。如圖4所示。為了驗證這些衍生物抑制COX-1和COX-2的能力，通過實驗，最終了解到化合物6對COX-2的抑制性是對COX-1的384倍，化合物12則高達470倍，有極其明顯的選擇性抑制作用，有效地緩解且消除了常用NSAIDs類消炎鎮(zhèn)痛藥的不良反應(yīng)與癥狀。

圖4 苯并咪唑/苯并噻吩/苯惡唑的衍生物Fig.4 Derivatives of benzimidazole/benzothiophene/benzoxazole

3 銀杏酸的活性進展

3.1 抗炎抗菌作用

氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)是炎癥反應(yīng)的重要標志物，并且在動脈粥樣硬化(Atherosclerosis)的發(fā)病機制中起著重要作用。在Juan Zhang、Yan[23]的研究中，觀察了銀杏酸對ox-LDL誘導的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)和人外周血單個核細胞(npbmc)抗氧化和抗炎癥作用。結(jié)果顯示，銀杏酸處理能提高ox-LDL處理的細胞活力，顯著降低細胞內(nèi)ROS，促炎細胞因子下調(diào)等。表明了銀杏酸具有抗炎作用。

體外抗菌活性研究結(jié)果提示，銀杏酸對革蘭氏陽性菌(G+)有較強的抑制作用，但對革蘭氏陰性菌(G-)并不敏感[24]。對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和青霉[25]、產(chǎn)紫青霉、沙門柏干酪青霉、黑曲霉均起到抑制的作用，且作用較為明顯的是大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、青霉。據(jù)文獻報道[26]，銀杏酸抑制細菌、真菌生長效應(yīng)的藥效部位在于C-6位的側(cè)鏈，并且決定銀杏酸抗菌作用強弱的關(guān)鍵在于側(cè)鏈的長短。抑菌效果最強為C13：0，其次C15：1，下來C15：0，最弱抑菌效果為C17：1，側(cè)鏈過長過短都起不到良好的抑菌效果。由于銀杏酸的化學結(jié)構(gòu)上，含有酚羥基和羧基，此為親水性基團。但側(cè)鏈上則村子疏水性基團，因此，側(cè)鏈上雙鍵的多少，以及側(cè)鏈的長短，將決定整個分子結(jié)構(gòu)親酯性/親水性的強弱。此外，有推測銀杏酸分子的親酯性/親水性的強弱，與抑菌抗菌作用有關(guān)聯(lián)。

3.2 抑制癌細胞和腫瘤的生長與疾病改善治療

3.2.1 抑癌作用和抑制腫瘤的生長

在Liang等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏酸(GA)在胃癌細胞中誘導生成活性氧ROS的效應(yīng)十分顯著，并抑制Stat3/JAK2通路的激活。此外，GA誘導的細胞凋亡和Stat3/JAK2活性降低很大程度上取決于ROS的產(chǎn)生。在體內(nèi)，GA顯著降低了胃腫瘤的生長。因此，可以認為GA是一種有效的治療方法，可以防止人胃腫瘤生長。

在Ke Liu，Wang等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，使用CCK-8分析以時間和劑量為依賴性的方式評估GA的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)該化合物具有降低口腔鱗狀細胞癌(OSCC)活性的能力。在5 Μm濃度時，用GA處理，發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)了轉(zhuǎn)化生長因子b1(TGF-b1)誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化細胞(EMT)(10 mg/mL)，OSCC細胞系中N-鈣粘蛋白和波形纖維蛋白表達的下調(diào)及E-鈣粘蛋白與a-連環(huán)蛋白表達的上調(diào)。即GA在5 μM濃度下表現(xiàn)出相當大的抗遷移活性，說明了GA具有低毒性的抗轉(zhuǎn)移活性。此外，10 μM濃度下GA的治療會導致凋亡細胞的顯著積累。

倪學文等[29]研究發(fā)現(xiàn)等研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌Hela細胞可以通過銀杏酚酸處理，從而抑制增殖，且持續(xù)抑制作用的時間與銀杏酚酸藥物濃度有關(guān)系。當濃度為24 mg/L時，增殖抑制率超過70%。因此，銀杏酚酸對抑制腫瘤生長有重要意義，是一種值得深入研究的天然活性抗癌藥物。

許素琴和吉民[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，銀杏酸是通過抑制磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)來阻止腫瘤細胞的增殖，PI-PLC激活后水解肌醇磷脂第三位酯鍵產(chǎn)生第二信使甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，通過激活蛋白激酶C(PKC)對瘤細胞內(nèi)多種底物蛋白磷酸化和對細胞內(nèi)Ca2+的影響促進瘤細胞的增殖，因此抑制PI-PLC可以阻止這個進程的發(fā)生從而達到抗腫瘤目的。PI-PLC有多種同工酶β1、β2、γ1、γ2、δ1、δ2。其中特別是對γ1亞型的抑制是最能夠阻止腫瘤細胞的增生擴散。3種銀杏酸單體對PI.PLCγl均存在了抑制作用，其中C17：1毒副作用最小，活性最好。與甲基化銀杏酸、乙?；y杏酸和水楊酸的活性進行對比，并對抑制PI.PLCγl的活性機制進行探討，最終發(fā)現(xiàn)銀杏酸的活性，與C-6位不飽和長鏈與C-2位羥基有重要的關(guān)系。C-6位不飽和長鏈中存在的雙鍵會提高其抗腫瘤活性。且在活性對比下，C17：1最強，C15：1次之C13：0最弱。且不飽和長鏈的銀杏酸C15：1和C17：1(不飽和長鏈)與含有飽和長鏈的銀杏酸相比較，其具有更小的細胞毒性。此外，存在于銀杏酸結(jié)構(gòu)中的酚羥基和羧基，與其抗腫瘤活性的強弱大小存在很大的聯(lián)系[31]。

以上相關(guān)實驗研究表明，GA能抑制癌癥細胞的增殖、遷移并記過相關(guān)酶反應(yīng)，促使細胞凋亡。因而，銀杏酸未來將會會為一種輔助抗癌的藥物，用于腫瘤治療[32]。

3.2.2 疾病改善治療

Shamini Vijayakumaran與Yasuko Nakamura等[33]以SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞和大鼠原代皮層神經(jīng)元為研究對象。細胞經(jīng)GA或相關(guān)化合物(抗壞血酸)預(yù)處理后，α-syn和SUMO-1免疫陽性的胞漿內(nèi)聚集物明顯減少，兩種化合物也檢測到自噬體的頻率增加。去極化后24 h的GA處理也顯著減少了α-syn聚集體承載細胞，表明了預(yù)先形成的聚集體的清除。自噬抑制劑阻斷了α-syn聚集體對GA依賴性清除，但不增加自噬體頻率。Western分析表明，GA預(yù)處理后α-syn聚合頻率的降低并沒有伴隨SUMO共軛物豐度的顯著變化。所以，在目前的研究結(jié)果中可以表明，GA能促進α-syn聚集體的自噬依賴性清除，并且，還可能在疾病修飾治療中具有很大的潛力。

3.3 殺滅釘螺作用

Kubo等[34]發(fā)現(xiàn)類似銀杏酸的結(jié)構(gòu)的漆酚酸組分具有一定的殺螺活性。毛佐華等[35]證實了銀杏酸單體C13：0、C15：0、C15：1、C17：1和C17：2具有滅殺釘螺的能力。受其側(cè)鏈碳原子數(shù)量及雙鍵數(shù)目的影響，殺滅釘螺的作用也因而不同，它們活性強弱順序為：C13：0>C15：1>C15：0>C17：1>C17：2。

進一步的實驗研究表明[36]，為了查明具有最佳滅螺活性的碳鏈長度的銀杏酸在酰胺化后活性的變化規(guī)律，因此分別合成側(cè)鏈為C-9、C-11和C-13的烷基水楊酸。由于酰胺化在合成中反應(yīng)的產(chǎn)率太低，因此沒有進行更深入的滅螺活性研究。實驗表明，C-9表現(xiàn)出較強的滅螺活性，因此在C-9～C-13范圍內(nèi)，烷烴側(cè)鏈長短與滅螺活性成反比。實驗結(jié)果為進一步進行結(jié)構(gòu)改造、研發(fā)高效低毒的新型的殺螺劑奠定了基礎(chǔ)。

3.4 其它活性作用

根據(jù)多項研究表明，銀杏酸具有多種效用，例如抑制真菌細菌的生長、存在抗腫瘤作用、與青霉素協(xié)同作用對耐青霉素金葡菌株有很好的抑制作用[37]、增白皮膚的效果。此外，銀杏酸對臨床耐青霉素金葡菌株有抑制作用[38]、由于具有殺滅釘螺作用，因而能防治血吸蟲病，并在其滅螺濃度范圍內(nèi)對魚沒有毒性[39]。

4 結(jié) 語

銀杏酸存在于諸多顯著的優(yōu)勢，因此在銀杏酸的深入研究、開發(fā)、應(yīng)用上均具有廣袤的前景。銀杏酸絕大部分來源于銀杏外種皮，并且是結(jié)構(gòu)上各不相同的一系列混合物，這些混合物的各單體極性相差很小，因而在分離、純化上存在了問題，銀杏酸也因此不適合工業(yè)上規(guī)?；笈可a(chǎn)。隨著對銀杏酸的研究日益加深，現(xiàn)在主要通過高壓制備色譜、高速逆流色譜等新的技術(shù)進行純化制取。銀杏酸具有許多顯著的藥理作用，在抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤癌癥以及心腦血管方面都有很強的藥理作用。所以，銀杏酸進一步的研究開發(fā)，提供成熟的、完整的、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的路線，提供大量銀杏酸單體，并繼續(xù)在藥理作用、構(gòu)效關(guān)系等多種活性機制上進行深入探討與研究，具有重要的意義，是今后這一領(lǐng)域的重要課題。