微波輔助法提取紅柚白囊皮中總黃酮及其抗老化眼霜制備的應用研究*

吳家婷，何裕良，鄧詩如，張伊程，向海濤，羅 婷，張嘉祺，項怡樺

(廣東第二師范學院化學與材料科學學院，廣東 廣州 510800)

柚子是蕓香科、柑橘屬植物，果圓球形、扁圓形、梨形或闊圓錐狀[1]。柚子在中國已有3000多年栽培史，主要分布在浙江、廣東和廣西等地，我國的柚子種植面積及生產量均居世界首位[2]。柚子皮約占柚子總量45%，大部分會以廢棄物的形式直接排入環境。然而，柚子皮含有多種活性成分，在食品工業上和在醫學上都有其重要價值[3]。其中，柚子皮中富含的黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老的作用。

黃酮類化合物是一類具有C6-C3-C6骨架的2-苯基色原酮或色原烷的衍生物，在植物體內，大部分化合物是與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在[4]。黃酮類化合物酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結合生成黃酮自由基，進而與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應[5]，因此有較好的抗自由基和抗氧化作用。

近年來，隨著我國經濟水平的快速提高，人們的生活水平不斷上升，環境污染也日益嚴重，人口老齡化不斷推進，抗衰老化妝品的消費市場也在不斷地擴大[6]。隨著生物科技的發展，在抗衰老化妝品中添加天然植物提取物，逐漸成為化妝品行業發展的趨勢，同時也是社會大眾對現代化生活品質提出的新需求[7]。

在此前的研究中，張英等[8]發現竹葉中提取的黃酮可以有效地抗自由基、抗氧化，具有作為抗衰老護膚因子的潛能。劉燕等[9]利用銀杏葉所含黃酮提取物，開發了具有抗衰老效果的潔面膏和護膚爽等產品。陳雨亭等[10]發現從槐米中提取的黃酮類化合物蘆丁，可以明顯地清除細胞產生的活性氧自由基；基于此研究，龔盛昭[11]開發出了蘆丁抗皺霜。

為了探究柚子皮中的類黃酮提取物制備成具有抗氧化性能的眼霜，我們著重紅柚白囊皮提取總黃酮的工藝進行了研究，在全面考慮已有提取方法的優缺點及現有條件的基礎上，以總黃酮得率為指標，取柚子皮的中層白囊皮，選用微波輔助乙醇提取法，通過單因素試驗和正交試驗，確定較優的提取工藝參數。按有關標準對制得的產品進行了理化性能抗氧化性測定，并進行了感官性能測定。

1 實 驗

1.1 材 料

1.1.1 儀器與設備

RE100-Pro數控旋轉蒸發儀，上海珂淮儀器有限公司；LAMBDA 265紫外可見分光光度計，珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司；NN-GS575W微波爐，上海松下微波爐有限公司；KQ5200B舒美超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JK-MSH-Pro-60WL數顯電動攪拌機，上海精學學科儀器有限公司。

1.1.2 材料與試劑

柚子(紅柚)，市售；蕓香葉苷分析對照品(蘆丁標準品)、2，2-聯苯基-1-苦肼基自由基(DPPH·)，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸均為分析純；Glucate SS、Glucate SSE-20、鯨蠟硬脂醇、乳木果油、角鯊烷C15、辛酸/葵酸甘油三酯、卡波姆U20、EDTA-2Na、1，3-丁二醇、HA(透明質酸)、玫瑰香精、苯氧乙醇，廣州和順化工有限公司；去離子水，自制。

1.2 微波輔助乙醇提取黃酮類化合物

1.2.1 原料的處理

選擇無明顯發霉變質且色澤油亮的柚子皮進行清洗，并將其黃色外果皮與白色中層果皮分開，取中層果皮切成均勻的方塊，置于65 ℃烘箱中干燥5 h，將粉碎后的紅柚白囊皮置于干燥箱中備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制作

準確稱取100 ℃干燥恒重的蘆丁標準品3.70 mg，用體積分數為30%乙醇溶解并定容25 mL，得到濃度為148 μg/mL的蘆丁標準溶液。分別準確吸取蘆丁標準溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞刻度試管中，先加入體積分數為30%的乙醇溶液至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.6 mL，搖勻后靜置6 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.6 mL，搖勻后靜置6 min，最后加入10%的NaOH溶液2 mL，充分振蕩后放置6 min。以30%乙醇為空白對照，在波長510 nm下測定吸光度，并繪制蘆丁標準曲線[12]。

1.2.3 柚子皮中黃酮的提取

準確稱取2.0 g干燥的紅柚白囊皮粉末于錐形瓶中，按照所需料液比加入乙醇溶液，于微波中按照提取功率和時間提取黃酮，浸提10 min[13]。將浸提液用真空抽濾泵進行抽濾，將抽濾液經旋轉蒸發儀濃縮得到紅柚白囊皮黃酮提取液。

1.2.4 提取物的中黃酮含量的測定

將提取物定容至10 mL，準確取定容后的提取物2 mL。先加入體積分數為30%的乙醇溶液至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.6 mL，搖勻后靜置6 min，再加入10% AL(NO3)3溶液0.6 mL，搖勻后靜置6 min，最后加入10%的NaOH溶液2 mL，充分振蕩后放置6 min。以體積分數為30%乙醇為空白對照，在波長510 nm下測定吸光度。并根據標準曲線回歸方程，計算出柚子皮的黃酮得率。

1.3 抗老化眼霜的制備及性能測定

1.3.1 眼霜的制備

眼霜配方見表1[14-16]，分別稱取A相和B相組分原料與燒杯中，75 ℃水浴加熱攪拌30 min，使固狀物溶解。后將B相加入A相攪拌45 min使其乳化均勻，降溫至55 ℃加入C相繼續攪拌均勻，降溫至45 ℃將D相加入體系，繼續攪拌至冷卻到室溫，即得到柚子皮眼霜樣品。

表1 柚子皮保濕眼霜Table 1 Grapefruit peel moisturizing eye cream

1.3.2 眼霜的感官及理化性能的測頂

(1)感官性能測定

取制備的眼霜在室溫非陽光照射處，觀察其外觀，記錄眼霜的色澤、膏體是否細膩均勻，用嗅覺聞其氣味。

(2)理化性能測定

①pH值測定

取3.0 g眼霜于燒杯中，加30 mL去離子水，超聲后在(40±1)℃下分散均勻。用校正好的pH計測定樣品水溶液的pH[14]。

②耐熱耐寒測定

取兩份眼霜5.0 g于燒杯中，分別于40 ℃的烘箱和-10 ℃的冰箱冷凍層中放置24 h后恢復至室溫，觀察是否有水油分離狀[14]。

1.3.3 眼霜的抗氧化性能的測定

稱取制備的柚子皮眼霜0.25 g，用純水超聲分散后轉移至50 mL容量瓶中定容，得到質量濃度為5 mg/mL的樣品溶液用于測定抗氧化性。

(1)對DPPH·的清除率[17]

取三個具塞試管，分別加入3 mL樣品溶液與3 mL 2.0×10-4mol/L的DPPH·無水乙醇、3 mL純水與3 mL DPPH·無水乙醇溶液、3 mL樣品溶液與3 mL無水乙醇，搖勻，避光放置30 min后，測在517 nm處的吸光度，所得吸光度分別為Ai1、A01和Aj1，根據公式(1)計算清除率P1。

P1=[1-(Ai1-Aj1)/A01]×100%

(1)

(2)對·OH的清除率[14]

取2 mL 1.00×10-2mol/L的水楊酸-乙醇溶液、2 mL 9.00×10-3mol/L的FeSO4溶液、2 mL的樣品溶液和2 mL 8.8×10-2mol/L的H2O2溶液，搖勻后放置于37 ℃水浴中反應30 min，在510 nm下測定吸光度Ai2。以2 mL純水代替水楊酸溶液測定吸光度Aj2，2 mL純水代替樣品溶液測定吸光度A02。根據公式(2)計算清除率P2。

P2=[1-(Ai2-Aj2)/A02]×100%

(2)

2 結果與討論

2.1 微波輔助乙醇法提取黃酮類化合物

2.1.1 蘆丁標準曲線的繪制

蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可得，蘆丁標準曲線方程為y=90.953 29x-0.650 74，相關系數為0.999 01，說明其線性關系很好。將樣品的吸光度代入方程計算，即得到柚子皮中黃酮得率。

2.1.2 單因素試驗

初始條件為：微波功率550 W、料液比1∶30 g/mL、提取時間20 s、乙醇體積分數為80%[12-13]。在初始條件的基礎下，改變單因素：微波功率(200 W、300 W、400 W、550 W、700 W)、料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)(g/mL)、時間(0 s、10 s、20 s、30 s、40 s)、乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)，探究對柚子皮黃酮得率得影響。結果見圖2～圖5。

圖2 微波提取功率對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of microwave extraction power on the yield of flavonoids

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

圖4 微波提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave extraction time on the yield of flavonoids

圖5 乙醇體積分數對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid yield

由圖2～圖5可知，單因素試驗下微波輔助乙醇提取柚子皮中黃酮得率的最佳提取條件為：微波功率200 W、料液比1∶40 g/mL、時間30 s、乙醇體積分數60%。

2.1.3 正交試驗

以紅柚白囊皮黃酮得率為指標，在單因素試驗結果的基礎上，采用四因素三水平L9(34)正交設計表進行正交試驗。正交試驗因素與水平如表2所示，正交試驗設計及結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Orthogonal test factor level table

表3 正交試驗方案與結果Table 3 Orthogonal test scheme and results

由正交試驗得出結論，紅柚白囊皮微波輔助乙醇提取黃酮類化合物的最優條件為乙醇濃度60%、料液比1∶35、微波提取時間30 s、微波提取功率300 W。在此條件下，經多次平行試驗得出黃酮提得率平均值可達到0.79%。

2.2 抗老化眼霜的性能測定

2.2.1 感官及理化性能測定

制備出的眼霜樣品感官及理化指標測試結果見表4。由表4可知，眼霜感官(色澤、氣味、外觀)及理化(pH、耐寒、耐熱)指標符合QB/T 1857-2013行業標準的要求。

表4 感官及理化指標測試結果Table 4 Results of sensory and physic-chemical indexes

2.2.2 抗氧化性測定

眼霜在質量濃度為5 mg/L時測得的DPPH·和·OH清除率分別為44.55%、32.20%，說明該眼霜具有一定的抗氧化能力。

3 結 論

采用了微波輔助乙醇法提取紅柚白囊皮中黃酮類化合物，由正交實驗極差結果可知，影響提取黃酮得率的因素主要是乙醇濃度，提取液料比和提取時間次之，提取功率的影響最小。該實驗整個提取過程在室溫下操作，可有效保持柚子表皮黃酮類化合物生物活性，且時間短，能耗低，綠色環保，無環境污染。

柚子皮富含黃酮類化合物，隨著科學技術的不斷進步和發展，黃酮類化合物的獨特效能將得到不斷的發掘及應用，本實驗將提取的黃酮類化合物制備成眼霜，具有一定的抗氧化效果，為發展柚子皮中黃酮類化合物的應用提供一條新的思路，同時為將天然提取物添加于化妝品中提供研究基礎。