反相離子對色譜法測定復方丹參制劑中三七素的含量*

黃曉晨，羅亦靈，朱 敏

(1 南京中醫藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300；2 泰州市藥品檢驗院，江蘇 泰州 225300)

復方丹參制劑為中藥制劑，具有活血化瘀、理氣止痛等功效，能夠改善心臟、肝臟的微循環，多用于心腦系統血管疾病[1]。臨床有濃縮丸、噴霧劑、片劑、膠囊等多種劑型，大多數劑型在《中國藥典》中均有相應的規定，為防治心腦血管疾病不可缺少的有效藥[2]。其主要的原料藥物由丹參、三七、冰片組成，丹參的作用點側重于血管，三七的作用點側重于心肌；丹參與三七配伍后存在協同互補效應，用以增強藥物療效[3]。三七素是一種經過蒸燙后易分解的水溶性成分，主要能夠增加血小板數量，能夠縮短大鼠凝血的時間，其機制與激活血小板AMPA受體，進而調控鈣內流、cAMP生成，TXA2釋放有關；還推測它的止血作用可能與促進組胺而血管收縮有關，因為其可以增強誘導豚鼠主動脈收縮。

2020版《中國藥典》中沒有對復方丹參制劑中的三七素含量的規定，查閱整理相關文獻資料發現[4]，也沒有對復方丹參制劑中三七素的考察，而三七素作為三七藥材中擁有最強止血功效的單體活性成分，有待進一步的研究與開發。本文現采用Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)色譜柱，配合PDA檢測器，并且通過對樣品處理方法優化，對復方丹參制劑中的三七素含量進行研究，為進一步研究復方丹參制劑的質量、臨床應用提供參考依據，有利于復方丹參制劑的開發與利用。

圖1 三七素(三七氨酸)結構式圖Fig.1 Structure diagram of notoginsenoside

1 實驗儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters e2695型高校液相色譜儀(配2998PDA檢測器)；XS1050U型十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多；52000型KUDOS超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MERRLER TOLEDO SevenEasy pH計；色譜柱：Waters XTERRA反相C18(RP)，4.6 mm×250 mm，3.5 μm；ANPEL水相針式濾器(聚醚砜)，25 mm，0.45 μm；Milli-Q Reference超純水機，上海君翼設備有限公司；一次性使用無菌注射器(帶針，5 mL)。

1.2 試 藥

無水磷酸二氫鈉來源于國藥集團化學試劑有限公司(批號為20190611)；三七素對照品(批號為26620010)；10%濃度的四丁基氫氧化銨的水溶液為分析純，來源于國藥集團化學試劑有限公司(批號為20190601)；復方丹參制劑樣品來源于9批不同廠家。

表1 樣品生產廠家和批號Table 1 The manufacturers and lot numbers of the samples

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱使用的是Waters XTERRA RP18(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)。流動相為0.03%四丁基氫氧化銨的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉的甲醇溶液比例為95∶5，用磷酸調節pH值為3.4。柱溫為25 ℃，檢測波長：220 nm，流速：1 mol/mL，進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

采用十萬分之一電子天平精密稱定三七素對照品13.46 mg，置于50 mL容量瓶中，加入純水定容，超聲使其完全溶解后，再用純水定容至刻度線，搖勻，制成每1 L中含269 mg三七素的溶液，作為對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取復方丹參制劑樣品適量，稱重，研磨成細粉，取約0.8 g，精密稱定(萬分之一天平)，置具塞錐形瓶中，精密量取純水50 mL，超聲30 min，搖勻，經0.45 μm水相針式濾器濾過，過濾后所得溶液作為供試品溶液。

2.4 系統適應性

按“2.1” 項下色譜條件，分別精密量取10 μL對照品、樣品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。三七素對照品、復方丹參制劑樣品的色譜圖見圖2，空白溶劑和輔料的色譜圖見圖3。

圖2 三七素對照品(A)和復方丹參制劑樣品(B)的HPLC色譜Fig.2 HPLC chromatograms of the reference substance of Dencichine (A) and the sample of compound Danshen preparation (B)

圖3 輔料(A)和空白溶劑(B)的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of excipients (A) and blank solvent (B)

2.5 線性關系的考察

三七素供試品一系列溶液的制備：精密移取三七素對照品貯備液適量，定容，配制成一系列不同濃度對照品溶液，濃度分別為269.01，134.51，67.26，33.72，16.61，8.41，4.21，2.11 mg·L-1。按“2.1” 項下優選色譜條件，分別精密量取不同濃度溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積×10-4(A×10-4)為縱坐標(y)，濃度C(mg·L-1)為橫坐標(x)，建立線性回歸曲線，回歸方程為y=1.299 6x+0.11，相關系數r=1。結果表明三七素在2.01～269.11 mg·L-1濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.6 檢測限和定量限

2.6.1 定量限

精密量取濃度為2.10 mg·L-1的溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中定容，濃度為0.525 mg·L-1，測得信噪比S/N約為10，定量限為26.25 ng，色譜圖見圖4。

圖4 三七素定量限的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the limit of quantification of Dencichine

2.6.2 檢測限

精密量取“2.5”項下，濃度是33.72 mg·L-1的溶液0.5 mL置于50 mL容量瓶中，定容，取稀釋液2 mL至10 mL容量瓶中，定容，此時溶液濃度為0.067 mg·L-1，測得信噪比S/N約為3，其檢測限為3.36 ng，定量限的色譜圖見圖5。

圖5 三七素檢測限的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the detection limit of Dencichine

2.7 精密度

選取“2.5”項下，濃度為33.72 mg·L-1的對照品溶液，進樣10 μL，進樣6次，記錄色譜峰面積，計算RSD值。結果33.72 mg·L-1對照品溶液中三七素峰面積RSD為1.16%<2%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性

2.8.1 溶液的制備

照“2.3”項下，取編號為4的復方丹參片樣品，平行稱定6份，取樣量分別為0.803 7，0.803 9，0.803 6，0.803 9，0.803 9，0.803 9 g，加純水超聲30 min，制備成6份供試品溶液。

2.8.2 重復性檢測

按“2.1”項下，供試品進樣量10 μL，記錄色譜圖，色譜峰面積RSD分別為1.4%<2%，說明該方法重復性良好。

2.9 溶液穩定性

照“2.1”項下，供試品進樣量10 μL，記錄0 h峰面積，在室溫條件下放置2，4，8，12，24，48 h后再進樣，測的結果與0時的峰面積相比較，結果表明48 h內，7次測定三七素對照品溶液，其峰面積的RSD為1.08%。結論說明三七素供試品溶液能夠放置在室溫狀態下48 h以內保持穩定。

2.10 專屬性

量取3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉甲醇溶液和0.03%四丁基氫氧化銨，放置于100 mL燒杯中，加水溶解，配置為流動相，保持柱溫25 ℃[5]。在保證其他成分不干擾實驗測定的情況下，縮短分析時間，考察指標為保留時間、拖尾因子、分離度以及理論塔板數，并且對流動相比例、pH值大小、檢測器的波長進行單因素考察。

2.10.1 流動相比例的考察

朱靜等[6]在研究中發現將實驗的流動相比例調節在80∶20時，洗脫效果較佳，有較好分離效果。選用80∶20的流動相比例。采用不同比例的0.03%四丁基氫氧化銨的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉的(80∶20、85∶15、90∶10、95∶5)甲醇溶液，實驗結果見表2，最終選擇的流動相比例為95∶5。

表2 不同比例的流動相的實驗結果Table 2 Experimental results of different proportions of mobile phase

2.10.2 流動相pH值的考察

用Waters XTERRA(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)反相C18色譜柱，流動相為0.03%四丁基氫氧化銨水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉的甲醇溶液(95∶5)，流速設置為1 mL/min，調節流動相的pH值進行考察，綜合考慮保留時間、分離度、對稱因子和理論塔板數，選擇流動相的pH值為3.4，實驗結果見表3。

表3 不同pH值的流動相的實驗結果Table 3 Experimental results of mobile phases with different pH values

2.10.3 小結

通過對柱溫、流動相比例、pH值、檢測波長等4個方面的單因素考察，結果表明，柱溫設置為25 ℃，流動相為0.03%四丁基氫氧化銨的水溶液-3.5 mmol·L-1磷酸二氫鈉的甲醇溶液(95∶5，1 mol·L-1磷酸調節pH值為3.4)。檢測波長設置為220 nm色譜條件下，三七素與其他成分分離度較好，無干擾，保留時間大約為12.8 min，三七素的理論塔板數不低于12 000。

2.11 加樣回收實驗

精密稱定編號為4的復方丹參片粉末約0.4 g，置于具塞錐形瓶中，按照藥典，加入三七素對照品的量與供試品中待測定三七素量之比分別為1.5∶1，1∶1，0.5∶1，按照供試品溶液制備方法制成高、中、低三種質量濃度的溶液各三份(n=3)，測定其中所含三七素的含量，按照此公式：加樣回收率=測得量/(含有量+加入量)，計算加樣回收率，結果見表4。

表4 復方丹參制劑中三七素的加樣回收率Table 4 The recovery rate of Dencichine in compound Danshen preparations

復方丹參樣品中的三七素加樣回收率均在95%到105%之間，三種不同質量濃度溶液的回收率的RSD分別為1.49%，1.39%，0.95%，均小于2%，結果表明測量系統和本法的準確度均良好。

2.1.2 含量測定

取樣按照“2.3”項下，制備由9個生產廠家的供試品溶液各三份(n=3)，進樣量10 μL，按照“2.1”項下，進行測定，結果見表5。實驗表明，不同批次的復方丹參制劑中，三七素的質量分數為0.02～3.03 mg/g，含量存在顯著差異，尤其是編號為1號的含量最低，只有0.03 mg/g，7號公司生產的制劑中三七素含量最高，達到3.01 mg/g。

表5 不同來源樣品的復方三七片中三七素含量Table 5 The content of Dencichine in compound Sanqi tablets from different sources

從表5中可以看出，來自不同廠家的復方丹參制劑中三七素的含量存在明顯差異，對比含量測定的結果，不同劑型之間的差異也較大。造成上述差異的原因可能主要是兩個方面，原料和生產工藝的不同。原料藥的不同產地、不同加工方式、不同提取工藝以及可能存在的三七不同部位入藥的情況，都可能造成三七素的含量差異，表明以三七素為指標，復方丹參制劑的質量存在參差不齊的現象，因此有必要對復方丹參制劑進行多指標評價，以求全面把控復方丹參制劑的質量、保證本藥臨床使用的有效性。

3 樣品處理方法的優化

在尋找樣品最優處理方法時，選擇改變超聲時間，記錄超聲時間對應的樣品的峰面積。結果見表6。實驗結果表明，超聲時間為30 min，樣測得的含量最高，此時提取效率最高。鞠政財、何純勇等[7]研究證實，純水超聲提取的效率高于高溫水浴回流1 h所得到的含量。三七素極性較大，有較好的水溶性，且高溫下不穩定，因此選用純水超聲提取，簡單方便。

表6 超聲時間對三七素提取效率的影響Table 6 The effect of ultrasound time on the extraction efficiency of Dencichine

4 結 論

復方丹參制劑是以丹參為主要成分，三七和冰片為輔組成的具有代表性的中成藥，功能主治活血化瘀、理氣止痛。藥理學研究表明，其具有良好的臨床治療效果，如抗血栓、改善缺血細胞等作用[2]。楊艷麗等[8]研究表明其可作為心絞痛、冠心病的治療優選。目前在《中國藥典》中，對復方丹參制劑的含量測定主要是以丹參酮ⅡA、丹酚酸B，人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1為指標成分，其它相關研究也多以這幾種指標成分進行研究。但是復方丹參制劑中也使用了三七作為原料藥，其價格不菲，有金不換的美譽，三七中具有強止血功效的單體成分就是三七素，因此對其進行含量測定具有質量控制意義。中藥復方制劑是由多個成分協同配合發揮藥效，復方制劑中各成分在機體內互相反應互相作用。

本文主要探究了反相離子對色譜法測定復方丹參制劑中三七素的含量測定效果，這也是第一次利用反相離子對色譜法測定復方丹參制劑中三七素的含量。目前現三七素含量測定主要有柱前衍生化法，毛細管區帶電泳檢測法[9]，氨基酸自動分析儀測定等方法，但是考慮到成本、靈敏度不佳、操作繁瑣以及穩定性等原因，選擇使用反相離子對色譜法進行含量測定。對于反向離子的選擇，一般來說測定堿性樣品會選擇烷基磺酸類，測酸性樣品則是使用四丁基銨鹽[10]，四丁基氫氧化銨的銨離子能夠鏈接到C18上[11]，能夠對復方丹參片中三七素含量進行檢測。本實驗測定復方丹參制劑中三七素含量的方法具有準確、穩定、快速、方便等優勢，而且重復性良好、專屬性強、加樣回收率在95%～105%之間，可以用于復方丹參制劑中三七素的含量測定，為其臨床新應用的開發、拓展質量控制范圍提供一定參考。