線粒體DNA介導先天免疫反應在腸缺血再灌注損傷中的研究進展

景祎馨 張貽幗 潘 銳 丁 可 孟慶濤

腸缺血再灌注 (intestinal ischemia reperfusion, IIR) 損傷是臨床常見的一種損傷,可發生在多種病理生理條件下,例如急性腸系膜缺血、嚴重創傷、急性休克、小腸移植和敗血癥。在缺血期間,組織缺氧導致內皮細胞屏障功能受損和血管通透性增加,隨后在再灌注期間血流和氧氣的恢復導致細菌易位、組織損傷、炎性反應和氧化應激。除腸道局部損傷外,IIR還可引起腸道菌群移位、內毒素血癥及遠端器官損害,最終導致全身炎癥反應綜合征、多器官功能障礙綜合征甚至死亡[1]。

IIR損傷的病理進程中,線粒體已經成為關鍵的參與者和調節者。線粒體作為大多數真核細胞內必不可少的細胞器,主要通過氧化磷酸化產生ATP供應能量。線粒體擁有獨立于細胞核的遺傳物質——線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA),人類的mtDNA由高度保守的輕鏈及重鏈組成環狀結構,共編碼了氧化磷酸化相關的13種mRNA、2種rRNA以及22種tRNA[2]。內共生學說認為線粒體來源于真核生物吞噬的細菌,因此mtDNA與細菌基因具有結構的相似性,釋放到細胞質或循環中的mtDNA可作為“外來”分子被先天免疫系統中不同模式識別受體識別,從而觸發Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)及促炎反應[3]。本文討論了mtDNA釋放到胞質或循環中的可能機制,重點關注了mtDNA觸發的免疫反應在IIR損傷的作用,主要涉及Toll樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9)、環狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP,cGAS)和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)信號通路。

一、mtDNA的跨膜釋放機制

1. mtDNA胞質釋放機制:在生理情況下,mtDNA主要存在于線粒體基質內,缺氧、敗血癥、外傷或線粒體膜電位劇烈變化等刺激可造成mtDNA穿越線粒體膜而轉移到胞質中,這個過程與線粒體膜的結構與功能密不可分[3]。目前已有研究顯示多種線粒體膜孔道參與了mtDNA的胞質易位。

(1)線粒體通透性轉換孔:線粒體通透性轉換最初由Haworth和Hunter提出,他們發現高水平的鈣會引起線粒體內膜通透性的增加[4]。隨著進一步研究證實,這一現象由一種組裝在線粒體膜上的分子實體支持——線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP),該孔道直徑為2～3nm,可允許水及小于1.5kDa的溶質通過[5,6]。

mPTP開放除了允許代謝物流出外,也可介導mtDNA的釋放。線粒體在受到Fe2+、H2O2和鈣離子誘導的氧化應激刺激下,mtDNA的部分片段會通過mPTP離開線粒體[7]。同樣在小鼠腦線粒體中發現,輻射誘導的氧化應激會引起mtDNA氧化損傷及片段化,而且還會使mPTP自發打開和關閉的頻率增加,促進mtDNA片段易位到細胞質[8]。mPTP介導的mtDNA的胞質釋放在多種炎性疾病中得到廣泛研究。在肌萎縮性側索硬化癥模型中,一種核DNA/RNA結合蛋白TDP-43可錯位進入線粒體,打開mPTP導致mtDNA泄漏到細胞質中,從而進一步驅動cGAS介導的免疫信號[9]。

(2)BAK/BAX孔:Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的關鍵調控因子,目前已發現18種同源蛋白,其中BAX與BAK是關鍵的促凋亡蛋白[10]。在生理情況下,BAX和BAK主要以無活性的單體形式存在,但在細胞凋亡進程中,BAX/BAK會發生積聚并插入線粒體外膜,經歷構象重排與低聚等過程形成孔道,釋放細胞色素c等促凋亡因子以激活半胱天冬酶級聯反應,最終導致細胞收縮、染色質縮合和凋亡體形成[11]。

線粒體外膜形成的BAX/BAK孔隙不僅僅參與細胞凋亡的激活,近年來研究顯示,BAX/BAK孔介導的mtDNA釋放可激活先天免疫信號的轉導。使用晶格光片活細胞顯微鏡觀察凋亡細胞線粒體發現,線粒體外膜出現的BAK/BAX孔可允許攜帶mtDNA的線粒體內膜膨出,隨后線粒體內膜發生透化釋放mtDNA進入胞質[12]。在膜孔道的組裝過程中,BAX與BAK會形成單獨的線、弧和環狀結構,這些弧和環狀結構與膜孔的形成密切相關。此外BAX與BAK之間可進行相互調節,促進彼此組裝,兩者的組裝速率是mtDNA釋放動力學的主要決定因素[13]。

(3)電壓依賴性陰離子通道:電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)是線粒體外膜上嵌入的β-桶狀蛋白,控制著線粒體代謝物質的進出。VDAC可以在氧化應激條件下發生低聚,并且VDAC的低聚體可以形成大的線粒體外膜透化孔。在活細胞中,VDAC1或VDAC3的低聚都有助于線粒體外膜透化并促進mtDNA的釋放,此外,高效的VDAC1低聚化抑制劑VBIT-4抑制了mtDNA的流出。VDAC1的N端結構域包含3個帶正電荷的殘基可以與mtDNA的負電荷骨架相互作用,同時mtDNA可能會進一步促進VDAC1寡聚化,兩者之間的相互作用可進一步促進VDAC低聚并增加mtDNA釋放[14]。

2.mtDNA細胞外空間釋放機制:mtDNA可以釋放到細胞外,在血漿和血清、腦脊液或滑液等多種體液中都觀察到了循環mtDNA的存在,循環中存在的mtDNA水平與炎癥性疾病、癌癥、衰老、創傷或組織損傷密切相關[15]。

(1)細胞外陷阱:以中性粒細胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)為例,NET是中性粒細胞激活后釋放到胞外的網狀超微結構,主要由DNA骨架及附著的顆粒蛋白及肽類組成,NET可以直接捕獲致病微生物,是抵御微生物入侵機體的一道防線[16,17]。盡管NET中的大部分DNA來自細胞核,但這些結構中也包含mtDNA[18]。有研究顯示,激活后的中性粒細胞會以ROS依賴性方式釋放僅含有mtDNA的NET[19]。與NET類似,巨噬細胞可以產生由mtDNA組成的巨噬細胞外陷阱,從而抵御微生物入侵及擴散[20]。同樣在嗜酸性粒細胞及嗜堿性粒細胞中也發現含有mtDNA的細胞外陷阱形成[21,22]。

(2)細胞外囊泡:細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是一種細胞膜衍生結構,通常分為外泌體、微泡和凋亡小體3個亞型[23,24]。EV可以攜帶特定的蛋白質、脂質或基因片段,在細胞間成分交換與信號轉導等方面發揮著重要作用[25]。在慢加急性酒精性肝損傷中,循環中含有mtDNA的EV的水平增加,并且與中性粒細胞增多癥和肝毒性密切相關。在慢性心力衰竭患者,血漿來源的攜帶mtDNA的外泌體增加可通過TLR9途徑引發炎性反應,并且這種炎癥的作用程度與外泌體mtDNA拷貝數密切相關[26]。同樣,在抗磷脂抗體刺激后,含mtDNA的EV水平會增加可通過TLR9受體引起內皮細胞的活化,從而增加先兆子癇的風險[27]。

二、IIR損傷中mtDNA介導的先天免疫信號通路

線粒體是缺血再灌注病理進程的重要參與者和調節者,線粒體功能障礙會通過氧化應激,炎癥和凋亡加劇IIR損傷。在IIR期間,受損的線粒體所釋放mtDNA是內源性損傷相關分子模式的重要來源,可激活TLR9,cGAS和NLRP3等先天免疫的傳感器以增強促炎和Ⅰ型干擾素反應[28]。

1.TLR9:TLR9 是第一個發現對胞質DNA有反應的特異性受體,TLR9位于內質網中,可以識別DNA的低甲基CpG序列,mtDNA的低聚化CpG序列是TLR9的有效激活劑[29]。與DNA結合后,TLR9會通過銜接蛋白MyD88發出信號,在核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的存在下激活促炎性細胞因子的轉錄,此外還可通過干擾素調節因子7的磷酸化導致Ⅰ型干擾素基因的激活[30]。

TLR9已被證明在肝臟IR期間的加劇先天免疫反應,而TLR9的抑制可扭轉肝臟損傷[31]。有研究發現,在肝細胞受到凋亡刺激時,Bak/Bax孔介導的mtDNA釋放會誘導TLR9依賴性IFN-β產生。此外,在急性肺損傷中mtDNA可以通過激活TLR9/NF-κB通路介導隨后的炎性反應[32]。在腸組織中,創傷導致的細胞破壞可以釋放mtDNA至循環中,通過激活中性粒細胞TLR9受體介導促炎性細胞因子的釋放加劇腸道功能障礙[33,34]。但矛盾的是,Slone等[35]通過對TLR9基因敲除小鼠進行IIR后,檢查腸組織損傷及炎性相關指標后發現TLR9在IIR誘導的組織損傷及炎癥中似乎是可有可無的。因此,mtDNA觸發TLR9信號轉導的炎性反應可能有組織器官差異性,仍需要進一步研究。

2.cGAS:大量研究已經證實,cGAS信號軸可響應外源或內源DNA刺激而調節Ⅰ型干擾素的產生。在沒有DNA刺激的情況下,cGAS會以自抑制狀態存在。當cGAS檢測到DNA后可利用GTP和ATP作為底物,催化第二信使cGAMP的合成,隨后cGAMP與位于內質網的干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)結合并誘導構象變化,活化的STING與TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)結合,進而磷酸化干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3),隨后IRF3二聚化并易位到細胞核。此外STING還可招募并激活IκB激酶,從而誘導NF-κB易位到細胞核,進入細胞核的NF-κB與IRF3可以與其他轉錄因子一起發揮作用,誘導干擾素和炎性細胞因子的表達。

盡管激活cGAS的大多數內源性DNA都認為來源于核基因,但目前有多項研究證實,mtDNA也可用作為cGAS配體。Guo等[36]研究顯示,向玻璃體內注射mtDNA可導致細胞損傷和視網膜功能障礙,這一機制主要與mtDNA激活cGAS-STING通路誘導炎性反應密切相關。此外,在牙本質細胞炎癥及腎損傷等疾病中也觀察到mtDNA-cGAS-STING通路激活。在有關IIR的研究中,cGAS-STING信號轉導參與了mtDNA誘導的壞死性凋亡,mtDNA可通過誘導壞死性凋亡進一步促進IIR損傷,而STING敲除可改善mtDNA誘導的腸道損傷。此外,mtDNA-cGAS-STING的激活可通過誘導過量脂質過氧化而加重腸道損傷,在該研究中,mtDNA可以以劑量和時間依賴性的方式誘導脂質過氧化和細胞死亡,這一過程可通過STING的敲除而逆轉。

針對mtDNA-cGAS-STING信號軸的靶向治療可顯著減輕IIR損傷。使用線粒體靶向抗氧化劑減輕DNA損傷或DNase-1降解細胞外DNA可以有效改善IIR損傷。STING作為通路關鍵調節蛋白,STING的敲除可有效改善IIR中mtDNA引起的損傷,此外,STING的抑制劑已經在小鼠腎缺血再灌注保護中得到廣泛應用,因此STING在IIR預防及治療的作用值得進一步探究。

3. NLRP3:NLRP3是一種NLR家族的關鍵受體蛋白,NLRP3的激活可吸引ASC和caspase-1組裝成炎性小體,從而誘導caspase-1自切割和活化。活化的caspase-1一方面促進IL-1β和IL -18等炎性細胞因子的成熟和分泌,另一方面還可切割GSDMD引發焦亡,最終導致缺血再灌注的損傷。NLRP3激動劑不僅包括病原體相關的RNA、DNA、成孔毒素和肽聚糖,mtDNA也是NLRP3的有效激動劑。

既往研究提出,氧化的mtDNA易位到胞質后可直接導致NLRP3炎性小體激活,增加IL-1β的分泌。Xian等[37]進一步驗證了在線粒體中,氧化的mtDNA要么被DNA糖基化酶OGG1修復,要么被內切酶FEN1切割成500～650bp片段,這些片段通過mPTP和VDAC依賴性通道離開線粒體以啟動胞質NLRP3炎性小體活化,并導致了促炎性細胞因子的釋放。盡管目前缺乏IIR損傷中mtDNA激活NLRP3炎性小體的直接證據,但已有多項研究證實NLRP3炎性小體在IIR期間的損傷作用。一方面,NLRP3可以以GSDMD依賴性方式誘導焦亡加劇IIR損傷,另一方面,NLRP3活化所介導的炎性細胞因子生成也促進了IIR損傷。

mtDNA-NLRP3通路激活是IIR損傷的可能機制之一。研究顯示,VX-765作為一種選擇性caspase-1抑制劑,可有效抑制NLRP3炎性小體活化,VX-765預處理可以有效減輕IIR期間的氧化損傷及炎性反應。此外,靶向mtDNA氧化損傷及釋放也可有效推進IIR損傷治療進展。特異性內切核酸酶1可將氧化的mtDNA切割成小分子片段,其抑制劑FEN1-IN-4可減少mtDNA碎片化,mPTP抑制劑CsA與VADC孔抑制劑VBIT-4可有效減少mtDNA向胞質釋放,而上述抑制劑在小鼠模型中均有效抑制了下游NLRP3炎性小體活化及炎性細胞因子釋放,減弱了組織損傷,但未來仍需要進一步的實驗驗證其臨床可行性。

四、展 望

IIR常見于急性腸系膜缺血、創傷、感染性休克、燒傷以及外科操作等,線粒體與腸缺血再灌注損傷的發生、發展密切相關。研究發現線粒體的生理功能不單單局限于能量的生成,在外界或自身刺激下,線粒體自身基因組mtDNA可作為一種損傷相關分子模式激活TLR9、cGAS及NLRP3信號通路,誘導干擾素及炎性細胞因子的釋放從而進一步加重IIR。在這個過程中,mtDNA必須跨越線粒體內外膜才能到達線粒體外,其可能的機制主要包括了以mPTP、BAK/BAX 孔和VDAC孔為主的胞質釋放途徑,以細胞外陷阱及EV為主的胞外釋放途徑,但目前有關mtDNA釋放通路的具體機制尚未完全闡明。此外,釋放后的mtDNA如何特異性篩選并結合模式識別受體也有待于進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。