著絲粒蛋白U在結(jié)直腸癌患者腸組織中的表達(dá)情況及臨床意義

王若淳 黃偉 葛思佳 陳婧 宣晗 顏楊 姜佳煒 肖明兵 陸翠華 劉肇修

[摘要]?目的?旨在探討著絲粒蛋白U（centromere?protein?U，CENPU）在結(jié)直腸癌患者腸組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合生物信息學(xué)分析其表達(dá)水平對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響。方法?通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative?real?time?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western?blot，WB）法以及免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CENPU在組織中的表達(dá)情況。結(jié)合患者臨床病例資料，通過單因素和多因素Cox回歸分析CENPU的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病例參數(shù)的相關(guān)性；然后通過繪制受試操作者操作特征（receiver?operating?characteristic，ROC）曲線和Kaplan-Meier生存曲線，探究CENPU的表達(dá)對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測作用。最后，通過生物信息學(xué)分析CENPU的表達(dá)對結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展影響的可能分子機(jī)制。結(jié)果?通過qRT-PCR、WB法以及IHC實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，與正常組織比較，CENPU在結(jié)直腸癌患者癌組織中表達(dá)顯著升高。Cox回歸分析表明CENPU的表達(dá)與患者的年齡和TNM分期顯著相關(guān)，是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。Kaplan-Meier生存曲線分析表明：CENPU高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的生存率顯著降低。ROC曲線結(jié)果表明：基于CENPU的表達(dá)建立的模型具有較高的預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的能力。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：CENPI、CENPN、CENPD、CENPK、CENPP、CENPM、CENPQ、CENPH、NDC80以及ITGB3BP這10個(gè)基因與CENPU基因具有相互作用關(guān)系；CENPU參與DNA修復(fù)、MYC/TARGETS/V1以及PI3K/AKT/MTOR等信號通路。結(jié)論?結(jié)直腸癌患者癌組織中高表達(dá)的CENPU與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，提示CENPU有望成為結(jié)直腸癌患者早期診斷及預(yù)測預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]?結(jié)直腸癌；著絲粒蛋白U；富集分析

[中圖分類號]?R735??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.001

Expression?and?clinical?significance?of?CENPU?in?intestinal?tissues?of?patients?with?colorectal?cancer

WANG?Ruochun1，2，?HUANG?Wei1，?GE?Sijia1，?CHEN?Jing1，2，?XUAN?Han1，2，?YAN?Yang1，2，?JIANG?Jiawei1，2，?XIAO?Mingbing1，2，???LU?Cuihua1，?LIU?Zhaoxiu1

1.Department?of?Gastroenterology，?Affiliated?Hospital?of?Nantong?University，?Nantong?226001，?Jiangsu，?China;?2.Clinical?Medical?Research?Centre，?Affiliated?Hospital?of?Nantong?University，?Nantong?226001，?Jiangsu，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?expression?of?centromere?protein?U?（CENPU）?in?the?intestinal?tissues?of?patients?with?colon?cancer，?and?to?analyze?the?effect?of?CENPU?expression?level?on?the?prognosis?of?patients?with?colon?cancer?combined?with?bioinformatics.?Methods?Firstly，?the?expression?of?CENPU?in?cancer?tissues?and?normal?tissues?of?colon?cancer?patients?was?analyzed?by?the?expression?of?CENPU?in?tissues?was?further?verified?by?real-time?quantitative?real?time?polymerase?chain?reaction?（qRT-PCR），?Western?blot?（WB）?and?immunohistochemistry?（IHC）.?Combined?with?clinical?data，?univariate?and?multivariate?Cox?regression?are?used?to?analyze?the?correlation?between?CENPU?expression?and?clinical?case?parameters?of?colon?cancer?patients.?Then，?the?predictive?effect?of?CENPU?expression?on?the?prognosis?of?colon?cancer?patients?are?explored?by?drawing?receiver?operating?characteristic?（ROC）?curve?and?Kaplan-Meier?survival?curve.?Finally，?the?possible?molecular?mechanism?of?the?effect?of?CENPU?expression?on?the?progression?of?colon?cancer?are?analyzed?by?bioinformatics.?Results?By?qRT-PCR，?WB?and?IHC?experiments，?we?find?that?compared?with?normal?tissues，?the?expression?of?CENPU?in?cancer?tissues?of?colon?cancer?patients?is?significantly?increased.?Cox?regression?analysis?show?that?the?expression?of?CENPU?is?significantly?correlated?with?the?age?and?TNM?stage?of?patients，?and?is?a?risk?factor?affecting?the?prognosis?of?patients.?Kaplan-Meier?survival?curve?analysis?show?that?colon?cancer?patients?with?high?CENPU?expression?has?significantly?lower?survival?rates.?ROC?curve?show?that?the?model?based?on?CENPU?expression?has?a?high?predictive?power?for?the?prognosis?of?colon?cancer?patients?area?under?the?curve（AUC=0.832）.?Bioinformatics?analysis?show?that?CENPI，?CENPN，?CENPD，?CENPK，?CENPP，?CENPM，?CENPQ，?CENPH，?NDC80?and?ITGB3BP?have?significant?interaction?with?CENPU?gene.?CENPU?is?involved?in?DNA?repair，?MYC/TARGETS/V1?and?PI3K/AKT/MTOR?signaling?pathways.?Conclusion?High?expression?of?CENPU?in?cancer?tissues?of?patients?with?colon?cancer?is?significantly?associated?with?poor?prognosis?of?patients，?suggesting?that?CENPU?is?expected?to?be?a?potential?target?for?early?diagnosis?and?prognosis?prediction?of?patients?with?colon?cancer.

[Key?words]?Colon?cancer;?Centromere?protein?U;?Prognosis;?Gene?set?enrichment?analysis

結(jié)直腸癌（colorectal?cancer，?CRC）是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，多數(shù)發(fā)生在乙狀結(jié)腸和直腸的交匯處[1]。發(fā)病年齡高峰為40～50歲，在男性和女性最常見惡性腫瘤中排第4位和第3位[2]。轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在肝臟，其次是肺、骨、腦[3]。許多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移到全身多處器官，預(yù)后極差。然而，盡管CEA、CA125和CA199等分子標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和預(yù)后評估，但是仍沒有標(biāo)志物可用于為結(jié)直腸癌患者的早期診斷和管理提供關(guān)鍵信息[4]。因此，尋找早期診斷CRC的新的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。

最新研究表明，CENP家族的多種分子參與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，著絲粒蛋白（centromere?protein?A，CENPA）的翻譯后修飾能夠調(diào)節(jié)著絲粒處的CENPA沉積、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和CCAN（組成型著絲粒相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)）募集[5]。著絲粒蛋白E（centromere?protein?E，CENPE）是一種驅(qū)動(dòng)蛋白-7動(dòng)粒靶向馬達(dá)，可以運(yùn)輸?shù)轿⒐苷耍瑥亩S持穩(wěn)定的動(dòng)粒微管附著[6]。

著絲粒蛋白U（centromere?protein?U，CENPU）也稱為髓性白血病因子1-相互作用蛋白（myeloid?leukemia?factor?1-interacting?protein，MLF1IP），它在動(dòng)粒蛋白組裝和有絲分裂過程中有著重要的影響[7]。據(jù)報(bào)道，它的缺乏會導(dǎo)致小鼠和荷斯坦牛的胚胎死亡[8]。Hua等[9]發(fā)現(xiàn)，CENPU是一種新型的微管結(jié)合蛋白，通過與Hec1的相互作用在動(dòng)粒-微管附著中發(fā)揮重要作用。目前許多研究已經(jīng)表明，CENPU在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，在多種腫瘤中表達(dá)增高。有研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌的T24細(xì)胞中，CENPU的敲低可以抑制G1期細(xì)胞的增殖、集落形成，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡[10]。Hanissian等[11]發(fā)現(xiàn)CENPU在各種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，并在紅白血病中起重要作用。這些均表明CENPU可能是各種腫瘤的驅(qū)動(dòng)因素。盡管如此，目前對于CENPU在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和預(yù)后作用的研究報(bào)道仍然較少。

本研究旨在探究CENPU在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其對結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后的價(jià)值及對結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性行為的影響，以探尋結(jié)直腸癌患者治療的潛在靶點(diǎn)。

1??資料與方法

1.1??數(shù)據(jù)獲取

從南通大學(xué)附屬醫(yī)院收集了66例結(jié)直腸癌患者的組織樣本。這些組織樣本的收集時(shí)間為：2010年1月8日到2011年6月9日，收集性別、年齡、細(xì)胞分化、TNM分期、腫瘤直徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床數(shù)據(jù)。本研究均經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2023-K109-01），并取得全體患者的知情同意書。

1.2??實(shí)驗(yàn)方法

將結(jié)直腸癌組織和鄰近組織固定，包埋在石蠟中，并切成4μm的切片。然后，將樣品在100℃下加熱15分鐘以進(jìn)行抗原修復(fù)。加入CENPU抗體（1∶200）作為一抗，4℃孵育過夜。第2天，用第二抗體免疫球蛋白G孵育，最后用二氨基聯(lián)苯胺和蘇木精染色。根據(jù)染色面積和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分（0～6分為低表達(dá)，7～12分為高表達(dá)）。照片在光學(xué)顯微鏡下觀察。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家獨(dú)立評估切片。

從組織中提取出總mRNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后通過SYBR?Premix?Ex?Taq檢測CENPU基因的表達(dá)情況。CENPU引物正向：3-GAAAAGAAA?AGGCAGCGTATGA-5，反向：3-AATATGCTGCATT?CCTAAGGG-5。以GAPDH作為內(nèi)參，正向：3-CAG?GAGGCATTGCTGATGAT-5，反向：3-GAAGGCTG?GGGCTCATTT-5。反應(yīng)條件：先95℃運(yùn)行5min，然后95℃，10s；60℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；共循環(huán)40次。

提取組織總蛋白，通過10%SDS-PAGE凝膠將蛋白質(zhì)分離，并將其遷移到聚偏氟丙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉1.5h，然后在4℃下，與相應(yīng)的一抗一起孵育過夜。第2天，將膜與稀釋的二抗孵育1.5h。最后，將ECL發(fā)光溶液均勻涂抹在PVDF膜上顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照。比較結(jié)直腸癌患者的癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.3??PPI網(wǎng)絡(luò)、富集分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）探索與CENPU相關(guān)樞紐基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，分析蛋白之間的相互作用。綜合評分>0.4分的相互作用被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

使用GSEA包對CENPU進(jìn)行功能富集分析，以確定有顯著變化的通路。對于每一個(gè)單獨(dú)的分析，對表達(dá)一致的通路進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算各基因的平均差異表達(dá)量。參數(shù)設(shè)定為隨機(jī)組合，并將其重復(fù)1000次，篩選出P<0.05的基因集，以此來確定顯著富集的基因集。

1.4??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad?Prism8和SPSS?Statistics?25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。采用Cox回歸分析和Kaplan-?Meier法分析CENPU表達(dá)對預(yù)后的影響。兩組比較采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??CENPU在結(jié)直腸癌患者癌組織中高表達(dá)

與正常組織比較，CENPU在癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。CENPU在癌組織中高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CENPU在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)情況，擴(kuò)大樣本量，共收66例組織，制備成組織芯片，通過IHC實(shí)驗(yàn)檢測CENPU的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CENPU在癌旁組織的腸上皮細(xì)胞中弱或幾乎不染色，而在癌組織中強(qiáng)染色，提示其在癌組織中高表達(dá)，且蛋白主要定位在細(xì)胞核中（圖1）。

2.2??CENPU的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

單因素Cox回歸分析結(jié)果表明，CENPU的表達(dá)水平與患者的年齡和TNM分期顯著相關(guān)；多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，患者的年齡、腫瘤TNM分期以及CENPU的表達(dá)水平是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（表1）。同時(shí)，66例結(jié)直腸癌患者的臨床病例資料中CENPU的表達(dá)與患者的TNM分期相關(guān)（P=0.039，表2）。

A.?Western?blot法檢測4對結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中CENPU的蛋白表達(dá)水平；B.qRT-PCR檢測8對結(jié)直腸癌及癌旁組織中CENPU的mRNA的表達(dá)水平；C.CENPU在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)（HE染色，×40）

2.3??高表達(dá)CENPU與結(jié)直腸癌患者預(yù)后

通過電話隨訪生存期，結(jié)合Kaplan-Meier生存曲線，分析CENPU的表達(dá)與患者總生存率的相關(guān)性。結(jié)果表明，與低表達(dá)CENPU的患者相比，高表達(dá)CENPU患者的生存率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖2）。

2.4??生物信息學(xué)分析

基于CENPU的表達(dá)，進(jìn)一步建立了結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測模型，結(jié)果提示，風(fēng)險(xiǎn)評分的曲線下面積（area?under?the?curve，AUC）為0.832，該模型具有較高的預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的能力（圖3）。為了深入探究CENPU對結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響的可能分子機(jī)制，首先利用STRING數(shù)據(jù)庫，尋找與CENPU相互作用的基因。結(jié)果顯示，CENPI、CENPN、CENPD、CENPK、CENPP、CENPM、CENPQ、CENPH、NDC80以及ITGB3BP這10個(gè)基因與CENPU基因具有相互作用關(guān)系。其次，通過GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)：DNA修復(fù)、MYC/TARGETS/?V1、PI3K/AKT/MTOR、G2M檢查點(diǎn)、有絲分裂紡錘體、糖酵解、WNT/BETA/?CATENIN、NOTCH、p53以及細(xì)胞凋亡與CENPU顯著相關(guān)。第三將數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者分為高表達(dá)和低表達(dá)CENPU組，對兩組樣本的轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步探究兩組樣本的差異表達(dá)基因譜（圖4）。

3??討論

目前，結(jié)直腸癌在全世界惡性腫瘤中病死率排第3位，由于缺乏早期診斷技術(shù)，許多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，因此無法進(jìn)行有效的手術(shù)治療，從而導(dǎo)致預(yù)后不良[12-13]。腫瘤標(biāo)志物對患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療至關(guān)重要[14]。所以，尋求有效的腫瘤標(biāo)志物和預(yù)測預(yù)后的因素對于提高結(jié)直腸癌患者的生存率尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，CENPU表達(dá)升高與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等指標(biāo)有關(guān)。既往有研究發(fā)現(xiàn)，CENPU表達(dá)增高與卵巢癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA?GATA3-AS1/miR-495-3p/CENPU軸促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[16]。此外，CENPU還可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[17]。因此，CENPU表達(dá)升高的患者總體生存率顯著降低，預(yù)示著腫瘤分化程度越低、浸潤程度更深、臨床分期更晚以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，這表明CENPU可以影響患者的預(yù)后，可以作為結(jié)直腸癌患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物[18]。

通過基因富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)CENPU參與了多種通路及代謝途徑，包括DNA修復(fù)、Notch信號通路、PI3K/AKT/MTOR/通路和細(xì)胞凋亡等。其中，Notch信號通路在維持祖細(xì)胞/干細(xì)胞群的正常生長和分化以及凋亡這三者的平衡之間充分發(fā)揮著作用[19]。科學(xué)研究表明，Notch1家族包含四種不同類型的受體，分別是Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，其中Notch4的異常激活可能會導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)展[20]。此外，Notch1還與調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal?transition，EMT）的轉(zhuǎn)錄因子（如SLUG、SNAIL和TGF-β）有著密切的聯(lián)系，形成了一個(gè)新的腫瘤微環(huán)境，從而加快了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)化[21]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)激酶B通路在多種癌癥中起作用，它不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、代謝、增殖，還可以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[22-23]。此外，有研究證實(shí)PIK3CA突變會對PI3K/AKT信號通路產(chǎn)生影響，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24]。因此，CENPU顯著富集Notch、PI3K/AKT/MTOR等相關(guān)信號通路，高度提示了高表達(dá)的CENPU可能通過這些信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展。

然而本文也具有一定的局限性。首先，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫及南通大學(xué)附屬醫(yī)院收集了許多結(jié)直腸癌的組織樣本。但是在分析這些臨床數(shù)據(jù)時(shí)，由于每個(gè)患者的情況不同，本研究只是通過患者的初步隨訪數(shù)據(jù)來進(jìn)行分析，結(jié)果可能存在一些偏倚，因此需要更多的樣本來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。其次，通過富集分析發(fā)現(xiàn)CENPU參與多種通路和代謝途徑的發(fā)生和發(fā)展，但尚未深入研究，后續(xù)需要通過更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

綜上所述，TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床指標(biāo)及患者的預(yù)后，這些都與結(jié)直腸癌組織中CENPU的高表達(dá)有關(guān)。這表明CENPU可以是一種致癌基因，也可以是結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，從而為臨床治療提供重要的參考依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–08–06）

（修回日期：2024–02–17）