微小RNA-138/NGAL對缺血再灌注誘導人腎小管上皮細胞的影響

邱冬豪

[摘要]?目的?探究微小RNA-138（microRNA-138，miR-138）調控中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin，NGAL）對缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）誘導人腎小管上皮（HK-2）細胞損傷的影響。方法?HK-2細胞構建I/R模型，分別轉染miR-138?模擬物、miR-138?抑制劑、NGAL、NGAL?+?miR-138?模擬質粒，qRT-PCR測定不同細胞miR-138或NGAL?mRNA表達鑒定轉染結果，細胞活力檢測（cell?counting?kit-8，CCK-8）法和流式細胞術測定細胞活性和凋亡。ELISA、Western?blot法分別測定miR-138模擬物、miR-138抑制劑對I/R細胞白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）水平，以及Toll樣受體4（toll?like?receptor?4，TLR4）、核因子κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（inhibitor-NF-κB，IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL蛋白表達的影響。結果?I/R細胞miR-138?mRNA表達、細胞活力降低，凋亡增加（P<0.01）。質粒轉染成功，miR-138模擬物促進IR細胞活力，降低凋亡和NGAL?mRNA表達（P<0.01）；miR-138?抑制劑、NGAL?模擬降低IR細胞活力，增加凋亡和NGAL?mRNA表達（P<0.01）；NGAL?模擬對IR細胞的損傷作用可被miR-138?模擬逆轉。miR-138?抑制劑可增加I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，上調TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達，下調IκBα蛋白表達（P<0.05）；miR-138模擬物可降低I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平和凋亡，下調TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達，上調IκBα蛋白表達（P<0.05）。結論?miR-138通過調節NGAL和TLR4/NF-κB途徑降低細胞凋亡和炎癥因子水平，對I/R誘導的HK-2細胞發揮保護作用。

[關鍵詞]?人腎小管上皮細胞；缺血/再灌注；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；TLR4/NF-κB通路

[中圖分類號]?R692.6??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.11.012

Effect?of?microRNA-138?on?the?ischemia/reperfusion?of?human?renal?tubular?epithelial?cells

QIU?Donghao

Department?of?Nephrology，?Affiliated?Hangzhou?First?Peoples?Hospital，?Zhejiang?University?School?of?Medicine，?Hangzhou?310008，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?effect?of?microRNA-138?（miR-138）?on?injury?of?ischemia/reperfusion?（I/R）?induced?human?renal?tubular?epithelium?（HK-2）?cells?through?neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin?（NGAL）.?Methods?HK-2?cells?were?used?to?construct?I/R?model?cells，?and?transfected?with?miR-138?mimic，?miR-138?inhibitor，?NGAL，?NGAL?+?miR-138?mimic?plasmids，?respectively.?qRT-PCR?determined?the?expression?of?miR-138?or?NGAL?mRNA?in?different?cells?to?identify?the?transfection?results.?Cell?counting?kit-8?（CCK-8）?method?and?flow?cytometry?were?used?to?detected?the?activities?and?apoptosis?of?cells.?ELISA?and?western?blot?were?used?to?determine?the?effects?of?miR-138?mimic?or?miR-138?inhibitor?on?levels?of?interleukin?（IL）-6，?IL-1β，?tumor?necrosis?factor?（TNF-α）?and?protein?expression?of?toll?like?receptor?4?（TLR4），?nuclear?factor?kappa-B?（NF-κB），?inhibitor?of?NF-?κB?（IκBα），?pho-IκBα?（p-IκBα），?NGAL?of?cells.?Results?miR-138?mRNA?expression?and?cell?activity?were?decreased，?while?apoptosis?increased?in?I/R?cells?（P<0.01）.?Plasmid?transfected?well，?miR-138?mimic?increased?activity?while?decreased?apoptosis?and?NGAL?mRNA?expression?of?I/R?cell.?miR-138?inhibitor?or?NGAL?mimic?inhibited?activity?and?increased?apoptosis?and?NGAL?mRNA?expression?of?I/R?cell.?The?negative?effects?of?NGAL?mimic?on?I/R?cell?were?reversed?by?miR-138?mimic.?miR-138?inhibitor?increased?levels?of?IL-6，?IL-1β，?TNF-α?of?I/R?cell，?and?increased?TLR4，?NF-κB，?p-IκBα，?NGAL?protein?expression?and?decreased?IκBα?protein?expression?（P<0.05）.?While?miR-138?mimic?decreased?levels?of?IL-6，?IL-1β，?TNF-α?of?I/R?cell，?and?decreased?TLR4，?NF-κB，?p-IκBα，?NGAL?protein?expression?and?increased?IκBα?protein?expression?（P<0.05）.?Conclusion?miR-138?reduced?apoptosis?and?inflammation?factor?levels?to?play?a?protective?role?on?I/R?induced?HK-2?cells?may?through?regulating?NGAL?and?TLR4/NF-?κB?pathway.

[Key?words]?Human?renal?tubular?epithelial?cells;?Ischemia/reperfusion;?Neutrophil?gelatinase?related?lipid?transporter;?TLR4/NF-κ?B?pathway

腎臟缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）在臨床中常見，多出現于腎臟移植、心臟外科手術等過程中，是造成急性腎損傷（acute?kidney?injury，AKI）最常見的原因之一[1-2]。腎I/R損傷發生的病理機制復雜，涉及內質網應激、活性氧聚集、凋亡、炎癥等一系列病理生理過程，導致腎小管上皮細胞凋亡引起腎功能損傷[3]。

微小RNA（microRNA，miR）是生物體內高度保守的非編碼小分子RNA，可作為腎臟I/R損傷診斷與鑒別診斷的生物標志物[2]。中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin，NGAL）廣泛存在于各種細胞類型中，可用于臨床早期腎損害風險預測[4-6]。NGAL在糖尿病腎病組織中顯著高表達，與Toll樣受體4（toll?like?receptor?4，TLR4）/核因子κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）通路共同參與促進腎組織炎癥和纖維化[7-9]。miR138可抑制NGAL發揮抗腫瘤作用，但其兩者在腎I/R損傷中作用還未明確。因此，本研究初步探究miR-138/NGAL在腎臟I/R損傷中的表達及可能作用。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??細胞和試劑??HK-2細胞（賽百慷生物技術公司，iCell-h096）；HK-2專用培養基（賽百慷生物技術公司，iCell-h096-001b）；CCK8檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β試劑盒（睿信生物科技公司）；TLR4、NF-κB、NF-κB抑制蛋白（IκBα）、磷酸IκBα（p-IκBα）、NGAL抗體（美國Affinity抗體公司）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Proteintech公司）；流式凋亡試劑盒（美國BD公司）。

1.1.2??儀器??BB150細胞培養箱、Micro17R低溫高速離心機、Nanodrop?one?mRNA定量儀（美國賽默飛公司）；AE2000光學顯微鏡（德國Motic公司）；CMaxPlus酶標儀（美國MD公司）；Ts2-FC倒置顯微鏡（日本尼康公司）；Mastercycler普通PCR儀（德國Eppendorf公司），實時熒光定量PCR儀（美國羅氏公司），NovoCyte流式細胞儀（美國安捷倫公司），610020-9Q化學發光儀（中國勤翔公司）。

1.2??方法

1.2.1??體外I/R模型制備方法??HK-2細胞于5%?CO2、37℃的培養箱中常規培養。取對數生長期細胞繼續培養，至細胞融合生長至80%，平衡鹽溶液替換培養基。80?mol/L抗霉素A和10mmol/L?2-脫氧-d-葡萄糖共孵育1h，以誘導HK-2細胞缺血性損傷。完全生長培養基中培養誘導后細胞實現I/R模型細胞。

1.2.2??細胞轉染??采用脂質體3000試劑轉染miR-138?模擬/抑制劑質粒、NGAL過表達質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司構建合成）。取I/R模型細胞，按照說明書將miR-138?模擬物及對照（NC）、miR-138?抑制劑質粒及對照、NGAL、NGAL?+?miR-138?模擬質粒轉染I/R細胞。根據轉染的質粒，將細胞分為組1：對照組、I/R組、I/R?+?miR-138?模擬組、I/R?+?miR-138?抑制劑組；組2：I/R組、I/R?+?miR-138?模擬物組、NGAL?+?I/R組、NGAL?+?I/R?+?miR-138?模擬物組。

1.2.3??qPCR測定miR-138、NGAL?mRNA表達??Trizol試劑提取2組細胞的RNA。反轉錄為互補DNA（complementary?DNA，cDNA），PCR進行DNA擴增。

引物序列：人NGAL上游：5-CCACCTCAGACCT?GATCCCA-3，下游：5-CCCCTGGAATTGGTTGT?CCTG-3；人miR-138上游：5-TCCGAGCCTGACTA?AGTGTTGTGGTCGA-3，下游：5-GTGCAGGGTCC?GAGGT-3；人U6上游：5-CTCGCTTCGGCAGCAC?ATA-3，下游：5-GTCGAGGGTCCGAGCT-3；人GAPDH上游：5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-?3，下游：5-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。U6、GAPDH分別作為miR-138、NGAL內參，2-△△CT法對結果進行相對定量分析。

1.3??檢測方法

制備兩組細胞的細胞懸液，接種至96孔板培養。加入10μl?CCK-8試劑，孵育2h。酶標儀測定450nm處的吸光度，計算細胞細胞活性。

將兩組細胞接種于6孔板。預冷PBS清洗，調整細胞濃度至1×106個/ml。加入500μl結合緩沖液，離心棄上清，再加入100μl結合緩沖液混勻后，分別加入5μl?Annexin?V-FITC與10μl?碘化丙啶（propidium?iodide，PI），充分混勻；室溫避光反應15min。最后加入結合緩沖液400μl，1h內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

收集組1細胞，離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書，測定IL-6、IL-1β、TNF-α含量。收集組1細胞，清洗，離心，裂解液處理細胞，制備蛋白樣本。BCA法測定總蛋白含量。電泳，轉膜。5?%脫脂奶粉孵育，清洗3遍。稀釋后的TLR4、NF-κB、IκBα、p-IκBα、NGAL、GAPDH抗體孵育過夜。TBST清洗，孵育對應二抗。顯影蛋白條帶，GAPDH做內參，計算各蛋白的相對表達量。

1.4??統計學方法

采用SPSS?16.0統計學軟件對數據進行處理分析。計量資料以均值±標準差（）表示，采用One-way-ANOVA單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??miR-138轉染對I/R細胞活力的影響

與對照組比較，I/R組細胞miR-138?mRNA表達量以及細胞活力顯著降低（P<0.01）。與I/R組相比，I/R+miR-138?模擬物細胞mRNA表達量、細胞活力顯著升高（P<0.01），I/R+miR-138?抑制劑細胞miR-138?mRNA表達量、細胞活力則顯著降低（P<0.01），而I/R+miR-138?模擬物-NC與I/R+miR-138抑制劑-NC細胞miR-138?mRNA表達量、活力差異無統計學意義（P>0.05），見圖1。

2.2??miR-138、NGAL轉染對I/R細胞活力的影響

與I/R組相比，I/R?+?miR-138?模擬物細胞NGAL?mRNA表達量降低、細胞活力升高（P<0.01），?NGAL?+?I/R細胞NGAL?mRNA表達量升高、細胞活力降低（P<0.01）。與NGAL+I/R細胞相比，NGAL?+?I/R?+?miR-138模擬細胞NGAL?mRNA表達下降、活力升高（P<0.01），見圖2。

2.3??miR-138、NGAL轉染對I/R細胞凋亡的影響

與對照組比較，I/R組細胞凋亡增加（P<0.01）。與I/R組比較，I/R?+?miR-138?模擬組細胞凋亡降低（P<0.01），I/R?+?miR-138?抑制劑組細胞凋亡增加（P<0.01）。與I/R組比較，NGAL?+?I/R細胞凋亡增加（P<0.01）；與NGAL?+?I/R細胞相比，NGAL?+?I/R?+?miR-138?模擬細胞凋亡下降（P<0.01），見圖3。

2.4??miR-138對I/R細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影響

與對照組比較，I/R組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01）；與I/R組比較，I/R+miR-138模擬組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P<0.01），而I/R?+?miR-138?抑制劑組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01），見圖4。

2.5??miR-138對I/R細胞蛋白表達的影響

與對照組比較，I/R組細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達增加，IκBα蛋白表達降低（P<0.01）。與I/R細胞比較，I/R?+?miR-138?模擬物細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達降低（P<0.05），IκBα蛋白表達增加（P<0.01）；I/R?+?miR-138?抑制劑細胞TLR4、NF-κB、p-IκBα、NGAL蛋白表達增加（P<0.05），IκBα蛋白表達降低（P<0.01），見圖5。

3??討論

腎組織近曲小管對缺血最為敏感[10]。腎缺血后，內皮細胞和平滑肌細胞迅速受損；而當血流恢復/再灌注時，血流增加，白細胞激活、聚積后通過炎癥反應和細胞毒性反應可增加腎組織細胞損傷[11-13]。而miRs可通過抑制細胞自噬、凋亡，減輕腎組織損傷，發揮I/R后腎保護作用[14-15]。本研究中，所構建的I/R細胞活力下降、凋亡增加、miR-138表達降低；miR-138抑制劑轉染加重了上述細胞的I/R表現；而miR-138模擬轉染可促進I/R細胞活力、減少凋亡，提示miR-138表達對I/R細胞具有保護作用。NGAL是脂質運載蛋白超家族的成員之一，腎小管上皮細胞缺血后出現細胞內水腫及細胞核凋亡，釋放NGAL成為其主要來源[16]。在I/R誘導的急性腎損傷小鼠腎組織內，NGAL蛋白表達增加[17]。本研究中I/R細胞NGAL?mRNA及蛋白表達顯著升高，NGAL?模擬轉染增加了I/R細胞的凋亡，而miR-138?模擬可逆轉NGAL?模擬對I/R細胞的促凋亡作用，推測miR-138可能靶向負調控NGAL，抑制腎I/R細胞的凋亡。

TLR4/NF-κB參與腎臟I/R炎癥反應過程，NF-κB作為關鍵分子可誘導炎性TNF-α、IL-6、IL-1表達，改變腎小球基底膜通透性，加重組織纖維化和炎癥反應[18-19]。κB激酶抑制劑IκBα可通過與NF-κB結合，阻止NF-κB發揮轉錄功能，緩解組織炎癥損傷[20-21]。本研究中I/R細胞TLR4/NF-κB通路、p-IκBα表達增加，IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；miR-138抑制劑加重了I/R細胞上述表現；而miR-138模擬物能夠促進I/R細胞IκBα表達，抑制TLR4/NF-κB通路表達，降低IL-6、IL-1β、TNF-α水平，因此推測miR-138可能抑制TLR4/NF-κB信號減輕I/R細胞的炎癥損傷。

綜上所述，miR-138可減少I/R誘導的人腎小管上皮細胞炎癥、凋亡，其作用可能通過調控NGAL、TLR4/NF-κB通路實現。miR-138與NGAL兩者聯合對腎I/R的診斷預后及治療作用還需臨床進一步明確。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] 任燕，?崔建民，?沈文.?腎臟缺血再灌注損傷的功能MRI實驗研究進展[J].?國際醫學放射學雜志，?2019，?42（6）：?688–691.

[2] 潘旭鳴，?陳丹壘，?馬紅珍.?miRNA在腎臟缺血再灌注損傷中的作用研究進展[J].?浙江醫學，?2019，?41（10）：?1091–1095.

[3] 徐鴻，?梁國標.?內質網應激-凋亡途徑在腎缺血再灌注損傷中的研究進展[J].?遵義醫科大學學報，?2022，?45（1）：?118–126.

[4] 杜飛璇，?曲輔政.?中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白在心血管疾病及相關腎損害中的研究進展[J].?中國當代醫藥，?2023，?30（6）：?39–43.

[5] 車春紅，?朱國貞.?NGAL與腎臟疾病相關性的研究進展[J].?生命科學，?2019，?31（1）：?99–105.

[6] 姜亞倩，?毛冰昆，?付安冉，?等.?中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白在婦產科領域中的研究進展[J].?中國現代醫生，?2022，?60（5）：?189–191.

[7] ASHRAFI?JIGHEH?Z，?GHORBANI?HAGHJO?A，?ARGANI?H，?et?al.?Empagliflozin?attenuates?renal?and?urinary?markers?of?tubular?epithelial?cell?injury?in?streptozotocin-induced?diabetic?rats[J].?Indian?J?Clin?Biochem，?2020，?35（1）：?109–114.

[8] WU?C，?CHEN?F.?The?function?of?miR-199a-5p/Klotho?regulating?TLR4/NF-κB?p65/NGAL?pathways?in?rat?mesangial?cells?cultured?with?high?glucose?and?the?mechanism[J].?Mol?Cell?Endocrinol，?2015，?417：?84–93.

[9] LEE?Y?C，?TZENG?W?F，?CHIOU?T?J，?et?al.?MicroRNA-138?suppresses?neutrophil?gelatinase-associated?lipocalin?expression?and?inhibits?tumorigenicity[J].?PloS?One，?2012，?7（12）：?e52979.

[10] ZHANG?Y，?NAKANO?D，?GUAN?Y，?et?al.?A?sodium-glucose?cotransporter?2?inhibitor?attenuates?renal?capillary?injury?and?fibrosis?by?a?vascular?endothelial?growth?factor-dependent?pathway?after?renal?injury?in?mice[J].?Kidney?Int，?2018，?94（3）：?524–535.

[11] LEGRAND?M，?MIK?E?G，?JOHANNES?T，?et?al.?Renal?hypoxia?and?dysoxia?after?reperfusion?of?the?ischemic?kidney[J].?Mol?Med，?2008，?14（7-8）：?502–516.

[12] ZHAO?H，?ALAM?A，?SOO?A?P，?et?al.?Ischemia-?reperfusion?injury?reduces?long?term?renal?graft?survival：?Mechanism?and?beyond[J].?EBioMedicine，?2018，?28：?31–42.

[13] 李昕，?王芷寧，?付璐，?等.?缺血-再灌注氧化損傷機制及其對不同器官功能的影響[J].?中國比較醫學雜志，?2022，?32（7）：?149–154.

[14] 李莎莎，?劉曉茜，?黃靜，?等.?miR-145-5p對腎缺血/再灌注損傷大鼠的腎臟保護作用及其機制[J].?山東醫藥，?2022，?62（35）：?29–33.

[15] SONG?T，?CHEN?M，?RAO?Z，?et?al.?miR-17-92?ameliorates?renal?ischemia?reperfusion?injury[J].?Kaohsiung?J?Med?Sci，?2018，?34（5）：?263–273.

[16] 何虹，?王睿，?水華.?NGAL在窒息新生兒急性腎損傷中的研究進展[J].?武漢大學學報（醫學版），?2023，?44（3）：?376–379.

[17] 余婷，?張妮，?陳思羽，?等.?貓爪草對缺血再灌注小鼠急性腎損傷的作用及機制[J].?貴州醫科大學學報，?2021，?46（11）：?1301–1308.

[18] 殷春曉，?馬亞瓊，?劉萍，?等.?黃芪甲苷通過TLR4/NF-κB信號通路對腎臟缺血再灌注大鼠的影響[J].?社區醫學雜志，?2022，?20（8）：?430–434.

[19] ZHOU?Y，?MA?X?Y，?HAN?J?Y，?et?al.?Metformin?regulates?inflammation?and?fibrosis?in?diabetic?kidney?disease?through?TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p?inflammatory?loop[J].?World?J?Diabetes，?2021，?12（1）：?19–46.

[20] 張華陽，?張俊勇，?鄭白術，?等.?腎缺血-再灌注肺損傷發病機制及治療[J].?臨床與病理雜志，?2022，?42（9）：?2284–2291.

[21] 侯道榮，?劉振，?崔斯童，?等.?丹參酮II-A通過調控TLR4/IκBα/NFκB信號通路抑制LPS誘導的細胞炎癥[J].?中國藥理學通報，?2021，?37（2）：?210–214.

（收稿日期：2023–08–02）

（修回日期：2024–02–19）