77份山西黍稷DNA二維碼身份證的構建

摘 要：為了更好地管理黍稷資源，分辨其身份以及追溯來源，創(chuàng)建一個高效可行的種質(zhì)資源鑒定系統(tǒng)十分必 要。以山西省內(nèi)各地 77 份黍稷資源為材料，用上海生工生物股份有限公司合成上游 5'端加 FAM （blue）熒光基 團 標 記 對 77 份 黍 稷 資 源 進 行 PCR 及 毛 細 管 電 泳 。 結 果 發(fā) 現(xiàn) ，僅 用 5 個 標 記 組 合（RYW3、RYW6、RYW20、 RYW37 和 RYW40）可 區(qū) 分 全 部 材 料 。 其 中 ，組 合 RYW6+RYW37 可 區(qū) 分 60 份 ；組 合 RYW6+RYW20+ RYW37 可 區(qū) 分 69 份 ；組 合 RYW6+RYW20+RYW37+RYW40 可 區(qū) 分 73 份 ；組 合 RYW3+RYW6+ RYW20+RYW37+RYW40 可區(qū)分全部 77 份。77 份材料在 8 個位點共檢出 79 個等位變異，每個位點檢出平均 為 9.875 個，檢測到的有效等位變異（Ne）為 2.675 9，Shannon 多樣性指數(shù)（I）為 0.991 6，Nei's 基因多樣性指數(shù) （Nei）為 0.426 0，多樣性信息含量（PIC）為 0.553 3。在此基礎上，利用 ID analysis 4.0 在線條形碼生成器將對應字 符串生成可掃描的條形碼 DNA 分子身份證；利用二維碼在線技術將材料基本信息轉(zhuǎn)化成可掃描的二維碼 DNA 分子身份證。

關 鍵 詞 ：SSR；黍稷；二維碼；山西

中 圖 分 類 號 ：S516 文 獻 標 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0008?08

黍 稷（Panicum miliaceum L.），又 名 黍 子 、稷 子、糜子、糜黍，具有早熟、生育期短，耐旱、水分利用效率高，耐瘠、豐產(chǎn)潛力大等特性。它是干旱半 干旱地區(qū)人們?nèi)粘Ｉ畋Ｕ系奶厣Z食作物，也是 重要的救災作物[1-2] 。黍稷是起源于中國黃河流域 黃土高原地區(qū)最古老的作物[3] ，而山西是其起源中 心和種質(zhì)資源的遺傳多樣性中心。目前，全世界有 26 197 份黍稷資源保存在中國、俄羅斯、印度、美 國、烏克蘭、波蘭、墨西哥、日本的 10 家研究機構 中，中國國家種質(zhì)資源庫現(xiàn)有黍稷資源 9 885 份，其 中山西有 1 592 份[4-6] 。近年來，由于新種質(zhì)資源的 不斷收集、引進和分散保存，造成種質(zhì)間重復引進、 同種異名、同名異種以及親緣關系不清等問題，而 且 目 前 對 黍 稷 資 源 進 行 系 統(tǒng) 化 整 理 的 研 究 也 很 少[7] ，嚴重影響了其高效利用。因此，打造一個準確 可 靠 、操 作 便 捷的鑒定體系成為當務之急。SSR （Simple sequence repeats，SSR）又 稱 微 衛(wèi) 星 ，是 廣 泛應用于作物染色體圖譜構建、品種選育鑒定等方 面的 DNA 分子標記技術[8] 。DNA 分子身份證是在 SSR 基礎上，將不同資源基因?qū)用娴牟町愑脭?shù)字轉(zhuǎn) 化成字符串、條形碼和二維碼，使每份資源擁有特 定的數(shù)字代碼，便于保護種質(zhì)資源的知識產(chǎn)權[9-11] 。 本研究擬利用 8 個 SSR 標記來分析山西省不同市 縣的 77 份黍稷種質(zhì)資源，通過構建條形碼 DNA 分 子身份證和二維碼 DNA 分子身份證，旨在為種質(zhì) 資源精準鑒定創(chuàng)造高效便捷條件。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗材料來源如表 1 所示。

本研究所用黍稷資源共 77 份，來自山西省各 地區(qū)（大同市 13 份：靈丘縣 3 份、渾源縣 2 份、天鎮(zhèn) 縣 5 份、懷仁縣 2 份、陽高縣 1 份；朔州市 11 份：朔城 區(qū) 4 份、應縣 5 份、平魯區(qū) 2 份；忻州市 22 份：代縣2 份、河曲縣 5 份、偏關縣 1 份、岢嵐縣 1 份、五臺縣 9 份、保德縣 2 份、五寨縣 2 份；太原市 4 份：尖草坪 區(qū) 3份、陽曲縣 1份；陽泉市 3份：城區(qū) 1份、盂縣 1份、 平定縣 1 份；晉中市 13 份：榆次區(qū) 3 份、昔陽縣 1 份、 平遙縣 2 份、壽陽縣 2 份、和順縣 1 份、太谷縣 1 份、 介休市 2 份、榆社縣 1 份；呂梁市 5 份：方山縣 1 份、 汾陽市 1 份、柳林縣 1 份、離石區(qū) 1 份、文水縣 1 份； 長治市襄垣縣 1 份；臨汾市襄汾縣 1 份；運城市 4 份： 萬榮縣 1 份、聞喜縣 3 份），詳見表 1。

1.2 基因組 DNA 提取與質(zhì)量檢測

77 份材料種植于人工氣候箱中，剪取三葉期黍 稷 葉 片 ，采 用 改 良 CTAB 法[12] 提 取 基 因 組 DNA， DNA 質(zhì)量檢測方法同石甜甜等[13] 。

1.3 引物選擇

毛細管電泳熒光引物為單色熒光，用上海生工 生物股份有限公司合成上游 5'端加 FAM（blue）熒 光基團標記對 77 份黍稷材料進行 PCR 擴增及毛細 管電泳。8 對熒光 SSR 標記信息見表 2。

1.4 構建分子身份證

用 Gene Marker V2.2.0 讀取數(shù)據(jù)，獲得 SSR 擴 增片段的精確分子量，并進行數(shù)字+英文字母編 碼。將每對標記擴增所有樣品的不同帶型，按分子 量從大到小用數(shù)字 1～9 依次表示，超出 9 的用英文 字 母 A～Z 依 次 表 示 ，無 帶 用 0 表 示 。 用 PopGen 1.32[14] 計 算 遺 傳 多 樣 性 指 數(shù) ，用 PowerMarker 3.25[15] 分析多態(tài)性信息含量（PIC），采用資源特征 分析軟件 ID Analysis 4.0 確定標記及標記順序，構 建字符串形式的 DNA 分子身份證[16] 。利用在線條 形碼生成器（http：//barcode.cnaidc.com/app/html/ bcgcode128.php）將對應字符串生成可掃描的條形 碼 DNA 分子身份證；利用二維碼在線技術（https：// cli.im/）將材料基本信息（包括名稱、統(tǒng)一編號、來 源地和字符串 DNA 分子身份證）轉(zhuǎn)化成可掃描的 二維碼，即二維碼 DNA 分子身份證。

2 結果與分析

2.1 基于熒光 SSR 的山西黍稷核心種質(zhì)的遺傳多 樣性

用 8 對熒光 SSR 標記，擴增 77 份山西黍稷核心 種質(zhì)，分析其遺傳多樣性，結果見表 3。

由表 3 可知，77 份材料在 8 個位點共檢出 79 個 等位變異，每個位點檢出 4～29 個（平均 9.875 個）； 檢 測 到 的 有 效 等 位 變 異（Ne）為 1.13（RYW18）～ 9.38（RYW37），平均值為 2.68；Shannon 多樣性指 數(shù)（I）為 0.29（RYW18）～2.63（RYW37），平均值為 0.99；Nei's基因多樣性指數(shù)（Nei）為 0.12（RYW18）～ 0.89（RYW37），平 均 值 為 0.43；多 樣 性 信 息 含 量 （PIC）為 0.25（RYW18）～0.95（RYW37），平均值為 0.55。 8 個 標 記 中 有 5 個 標 記 具 有 高 度 多 態(tài) 性 （PICgt;0.5），為高多態(tài)性 SSR。

2.2 基于 SSR 的山西黍稷核心種質(zhì) DNA 分子身份 證的構建

對毛細管電泳結果進行“數(shù)字”編碼，將RYW3、 RYW5、RYW6、RYW18、RYW20、RYW35、RYW37 和 RYW40 引物的特征編碼結合形成特定的字符 串。鑒定 8 對熒光 SSR 對供試材料的區(qū)分程度，發(fā) 現(xiàn)任何 1 對熒光 SSR 均不能將全部供試種質(zhì)資源 分開。分子身份證的最終目的是對所有供試材料 賦予可辨的分子身份證，同時又要滿足用最少的標 記區(qū)分最多材料的要求。因此，通過逐步增加標記 設定標記組合，篩選可以將全部材料完全區(qū)分的標 記。整合 PIC 值大和區(qū)分率高的熒光 SSR 標記，結 果發(fā)現(xiàn)僅用 5 對標記即可區(qū)分全部材料。其中，組 合 RYW6+RYW37 可 區(qū) 分 60 份 ；組 合 RYW6+ RYW20+RYW37 可 區(qū) 分 69 份 ；組 合 RYW6+ RYW20+RYW37+RYW40 可 區(qū) 分 73 份 ；組 合 RYW3+RYW6+RYW20+RYW37+RYW40 可 區(qū)分全部 77 份。單個熒光 SSR 標記對于黍稷種質(zhì) 的區(qū)分見表 4，不同熒光 SSR 組合對于黍稷種質(zhì)的 區(qū)分見表 5。

對毛細管電泳結果按表 4 進行數(shù)學+英文字 母 + 符 號 編 碼 ，將 RYW3、RYW6、RYW20、 RYW37 和 RYW40 用于 DNA 分子身份證的構建。 按上述順序?qū)?5 對熒光 SSR 對應的編碼組合，構成 黍稷核心種質(zhì) DNA 分子身份證，即字符串 DNA 分 子身份證，77 份黍稷材料的字符串 DNA 分子身份 證見表 6。將上述字符串 DNA 分子身份證導入在 線條形碼生成器，獲得條形碼 DNA 分子身份證。 將各供試材料的基本信息和字符串 DNA 分子身份 證錄入在線二維碼生成框，得到二維碼 DNA 分子 身份證。77 份黍稷材料的條形碼和二維碼 DNA 分 子身份證見圖 1、2。

3 討論

3.1 熒光 SSR 在黍稷遺傳多樣性上的應用

毛細管電泳檢測技術具有一系列優(yōu)點，在小 麥[17-18] 、玉米[19] 、油菜[20] 、煙草[21] 等植物中廣泛應用， 但在黍稷上相關報道不多[22-24] 。王璐琳等[23] 用 15 對 熒光 SSR 檢測 132 份黍稷種質(zhì)資源，引物平均等位 基因數(shù)為 7 個，I 值為 0.529 8，PIC 值為 0.486 4。寇 淑君等[24] 利用 22 對標記檢測 131 份黍稷種質(zhì)資源， 平均每對 SSR 標記擴增出 5.82 個主要等位變異， I 值為 1.206 2，PIC 值為 0.587 4。本研究的平均等 位基因數(shù)為 9.875 0，I值為 0.991 6，PIC值為 0.553 3， 具有較高的利用價值。

3.2 黍稷分子身份證的構建和實際應用

種質(zhì)資源的分子身份證與其地理來源密切相 關[25-28] ，地理來源接近的分子身份證類似[29-32] ；地理 來源存在較大差異，則分子身份證很容易區(qū)別開 來[33-36] 。陳巍等[37] 構建中國桃品種分子身份證，發(fā)現(xiàn) 來源于吉林的吉林 8501 和吉林 8601，其分子身份 證分別為 432566620382554 和 4325766103855545， 極為相似 ；而分別來源于新疆的喀什 3 號和陜西 的陜甘山桃，其分子身份證分別為4367566143957525 和 1502233222010434，差異較大。本試驗也有類似 結果。基于熒光 SSR 構建的分子身份證中，氣死風 粘糜（序號 35）和灰粘糜（序號 36）均來自忻州市五 臺縣，其分子身份證分別為 7A0k2 和 5A0k2，差別 不大；而二白黍（序號 7）和白軟黍（序號 61）來自大 同和運城，其分子身份證分別為 091d9 和 560H2，地 理來源差異較大，其分子身份證也有較大差別。本 研究利用 5 個 SSR 標記來構建 77 個黍稷種質(zhì)資源 的分子身份證，并結合圖 1 的 77 份黍稷資源的條形 碼與二維碼身份證表述材料信息，能夠?qū)崿F(xiàn)該作物 種質(zhì)資源更加高效規(guī)范的管理，為今后的種質(zhì)資源 管理提供依據(jù)。

4 結論

用 5 個熒光高基元 SSR 標記組合構建的 77 份 山西黍稷資源二維碼 DNA 分子身份證，為標準化管 理該作物種質(zhì)以及后續(xù)追溯作物來源提供了參考。

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