黃花菜組織培養常見問題及建議

摘 要：黃花菜兼具食用價值、觀賞價值和藥用價值，現今越來越受到人們的廣泛關注。長期以來，黃花菜新優 品種缺乏、繁殖手段單一，限制了產業健康快速發展。組織培養擁有繁殖系數大、周期較短、不受季節約束、苗整 齊度高以及節省育苗用地等優點，因此，利用組培技術快速擴繁對黃花菜的市場開發、應用和推廣具有重要意 義。旨在為應對黃花菜的組培中出現的各類問題、提高黃花菜組培苗成活率提供一定的參考，為黃花菜遺傳轉 化以及新優品種工廠化育苗提供理論依據，以黃花菜為研究對象，闡述了在組織培養過程中存在的各項內在影 響因素，包括植物材料的基因型、選取的外植體類型；以及外在影響因素，包括外植體取材時期、基本培養基類 型、植物生長調節劑以及培養條件。結果發現，黃花菜的組織培養體系仍不成熟，存在著外植體及其采集標準的 不確定、愈傷組織誘導困難、最優培養基配方不統一、再生植株移栽成活率低等問題。為優化這樣的問題，仍需 摸索一套適合黃花菜的再生體系，并加強對組培苗的移栽后管理。此外，對組織培養過程中存在的污染、褐化及 玻璃化問題作出歸納總結，并對黃花菜組織培養未來的發展趨勢進行了展望。

關 鍵 詞 ：黃花菜；組織培養；愈傷組織；再生

中 圖 分 類 號 ：S644.3 文 獻 標 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0145?08

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）來源于阿 福花科萱草屬，是一種多年生宿根草本植物，又名忘憂草、金針菜[1] 。黃花菜的花蕾中含有豐富的維 生素、蛋白質、糖類、纖維素、卵磷脂、鈣、鐵、磷、硒 等物質，是一種藥食兼用的特色蔬菜[2-3] 。一直以 來，黃花菜以其優美的花型、對環境較好的適應性 廣泛應用于園林景觀中，具有較高的觀賞價值。 黃花菜種質資源豐富，廣泛分布于世界各地。 目前來看，分芽、切片等分株繁殖仍為黃花菜的普 遍繁殖方式[3] ，這種傳統的繁殖方法存在著培育周 期長、繁殖系數低、種性褪化以及易感染病蟲害等 問題[4] ，利用組織培養技術可在一定程度上克服以 上缺點。本文以黃花菜為研究對象，介紹了目前其 組織培養研究概況，以及組織培養過程中的主要影 響因素和存在的常見問題，針對這些因素和問題提 出了相應建議，以期為黃花菜的快速繁殖提供理論 依據，進而對黃花菜優良種質的擴大有重要生產實 踐意義。

1 黃花菜組織培養概況

植物組織培養以細胞的全能性為理論基礎，將 植物離體器官、組織、細胞、胚胎或原生質體等外植 體[5] ，通過適當的培養基、生長條件和培養技術，在 體外環境下維持其生長、增殖和分化的過程[6] ，從而 形成完整再生植株[7] ，整個過程實現了細胞的全能 性表達。由于外植體是在完全無菌的離體條件下進 行培養，因此，組織培養又被稱為離體培養。1902年 著名德國植物學家 Haberlandt 首次提出“細胞具有 全能性”這一學說[8] ；1937 年 White 發現，植物細胞 的全能性表達往往受到限制，需要某種因素的激發 才能打破這樣的狀態，即細胞的脫分化和再分化的 能力成為決定植物組織培養成敗的重要因素[9] ；此 后直到 1948 年，Skoog 和 Tsui以煙草的莖段作為外 植體，成功獲得了煙草離體再生植株[10] ，這是植物組 織培養上的巨大突破；1958 年 Steward 等以胡蘿卜 根為外植體建立了細胞懸浮培養體系，完全驗證了 細胞全能性這一學說[11] 。隨著國內外學者不斷對組 織培養技術上的創新改良，至今已有 1 000 多種植 物利用組織培養技術成功獲得離體再生植株，并在 科研和產業化生產方面得到了廣泛的應用[12] 。

黃花菜組織培養研究在 20 世紀 70 年代開始出 現，HEUSER 等[13] 率先從黃花菜及其種間雜種組 織中獲得了愈傷組織和不定苗。黃花菜的再生途 徑有多種，主要包括 4 種類型：從外植體直接分化 出芽器官得到無根苗，再生根獲得完整植株，稱為 器官型；從外植體脫分化形成愈傷組織，進而再分 化出不定芽然后生根獲得完整植株[14-15] ，稱為器官 發生型；外植體經愈傷組織形成類胚體結構，由胚 狀體誘導不定芽生根發育成苗[16-17] ，稱為胚狀體發 生型；外植體誘導愈傷組織，而后形成球狀體再分 化不定芽進而形成試管苗生根[18] ，稱為球狀體發生 型。目前來看，雖然有學者不斷地研究黃花菜離體快 繁技術，但仍然沒有一個完整的體系來實現黃花菜 的工廠化快繁，對于什么是適宜黃花菜組培的最佳 外植體，組培的最佳再生方式還是沒有一個定論，實 質上黃花菜的組織培養研究仍舊處于探索階段[19] 。

2 黃花菜組織培養的主要影響因素

在黃花菜的組織培養中，愈傷組織能否正常分 裂分化，不定芽是否能正常生長發育，以及根的形 成至煉苗移栽后組培苗的成活等等各項技術要點 都會受到各種各樣因素的影響。主要有內在因素 包括植物材料的基因型、選取的外植體類型等；外 在因素包括外植體取材時期、基本培養基類型、植 物生長調節劑以及培養條件等[20] 。

2.1 內在因素

2.1.1 基因型 不同物種或同一物種的基因型不 同，導致形態發生能力不同，往往分化能力也不同， 這就證明了組織培養的難易程度依賴于基因型的 影響。不同基因型植物的細胞受到創傷后，其脫分 化和再分化的能力及所用的時間也不同。在黃花 菜的不同個體間分化能力同樣存在著基因型的差 異，周樸華等[21] 發現同源四倍體黃花菜的愈傷組織 繁殖能力和分化能力都較二倍體黃花菜強，張超美 等[22] 通過對同源四倍體黃花菜的愈傷組織繼代培 養發現，形成致密的球狀體愈傷組織與二倍體黃花 菜培養結果類似，繁殖和分裂能力較強；黃花菜的 基因型還影響著胚狀體的發生，如王榮梅[23] 對黃花 菜未受精胚珠離體培養得出結論，黃花菜的單倍體 培養中，供體植株的基因型是影響雌核離體誘導的 主要因素，姜華武等[24] 則發現了胚狀體細胞內部基 因的選擇性表達與外部形態發生之間存在聯系。 但值得考慮的是，培養材料如果在親緣上或遺傳上 相接近的話，其組織培養的條件往往也是相類似 的[25] 。目前來看，單倍體及多倍體的黃花菜離體培 養研究較少，通過篩選有更佳培養效果的基因型， 對推動黃花菜的育種進程有實踐意義。

2.1.2 外植體選擇 外植體的選取也是組織培養 中需要考慮的一大因素。通常外植體的取材器官 和組織的不同、外植體大小不同、生理年齡不同等都會影響植物體的再生能力。根據前人研究，黃花 菜組織培養的外植體有很多，包括種子、葉片、短縮 莖、花葶（花莖）、花梗（花柄）、花蕾、花藥、花絲、子 房、胚珠等，但不同的外植體一旦接種后，其再生方 式、愈傷組織的誘導能力以及芽的分化能力等都是 有差異的。前人研究表明（表 1），除黃花菜的種子 可在短期內直接誘導出胚芽，其他類型外植體均能 在 20～40 d 內誘導出愈傷組織，不同外植體的愈傷 組織誘導率有所差異。褚煥寧等[26] 以黃花菜種子 為外植體進行了無菌播種試驗，經誘導的種子發芽 率為 80.00%，后直接分化成為再生苗。LI 等[27] 以 黃花菜葉片為外植體，研究了愈傷組織增殖和分 化 ，發 現 起 重 要 作 用 的 植 物 生 長 調 節 劑 6-BA 與 NAA 是黃花菜離體再生的必要條件。徐迪新等[18] 研究以黃花菜的幼葉、花藥、子房、花莖、花梗和花 蕾作為外植體，發現均可誘導愈傷，分化成苗，但花 梗的愈傷組織誘導率最高為 100.00%，培養效果最 好。還有研究表明，通過比較心葉、短縮莖、花蕾和 花莖 4 種外植體的組培效果，得出的結論為花蕾的 出愈率較高為 75.00%，而心葉得到非胚性的愈傷 組織，質地疏松且很難形成再生植株[28] 。黃花菜外 植體的大小也會影響組培情況，如外植體過大，會 使消毒滅菌不徹底而引起污染，但適合組培快速繁 殖；如外植體過小，會降低其分化能力，延長培養周 期，存在較高死亡率，但這在離體脫毒中或在胚胎 培養中較為常見，因此，要根據培養目的來確定黃 花菜外植體的大小[29] 。在黃花菜的一生中，一般情 況下，幼年期植物組織要比老年期植物組織有更高 的分化能力，更易誘導愈傷組織，且生根能力會更 強[30] 。而生理年齡越大的組織，在發育上相對來說 更加成熟，因而就越容易形成花器官[31] 。目前來 看，前人對黃花菜各種外植體類型均有所研究，如 從取材上來看，葉片和花葶數量豐富，易于取材，可 為黃花菜工廠化擴繁的理想材料。

2.2 外在因素

2.2.1 取材時期 植物組織培養中外植體的取材 不是隨時可以進行的，在黃花菜開始萌動生長的季 節可以說是采樣的最佳時期，此時外植體分裂旺 盛，離體培養成功率較高[33] 。如果過了生長期或是 在休眠期取樣，則外植體的誘導能力弱或已經失去 了誘導能力[34] 。黃花菜的田間采樣挑選晴天的中 午比較好，因為中午陽光直射有一定的殺菌作用， 此時外植體及時接種不易產生污染[35] ，而上午或是 陰天采樣的外植體易引發污染，下午由于長時間曝 曬可能會影響植株的分化能力。在取材季節上，一 般取黃花菜的短縮莖或心葉外植體可在早春 2— 3 月，而花葶外植體由于受到花期的限制，一般在 6—7 月取材[36] 。

2.2.2 基本培養基類型 按照培養基狀態，可分為 固體培養基、半固體培養基和液體培養基 3 種培養 基類型，常見的基本培養基有 MS、1/2 MS、B5、N6、 LS 等。通常我們直接將黃花菜外植體接種于固體 培養基表面即可誘導再生，瓊脂是最常用的凝固 劑[37] 。在已報道的黃花菜組織培養研究中，MS 培 養基和 N6 培養基是愈傷組織誘導和芽分化的常用 基本培養基。唐世建等[17] 用 MS 和 N6 作為基本培 養基對 4 種黃花菜外植體愈傷組織誘導，誘導效果 沒有明顯的差別；董雅茹等[38] 則認為 MS 培養基適 合愈傷的誘導，而 N6 培養基促進芽的分化。在黃 花菜組培苗生根研究中，帥娜娜等[32] 使用 1/2 MS 培養基生根速度快，根系發達；蘇承剛等[39] 則在不 添加任何激素的 MS 培養基中也得到了較為理想 的生根率。半固體培養基常用來培養菌類，更適合 于觀察菌類的運動能力，一般不適于黃花菜器官或 組織的離體培養。液體培養基通常用于細胞懸浮 培養。FIDEMANN 等[40] 通過植物細胞懸浮培養優 化了培養基成分，且利用植物生物反應器細胞懸浮 培養技術得到飛速發展[41] 。目前，國內外有關黃花 菜的細胞懸浮培養仍沒有建立起完整的體系，建議 利用液體培養基的手段進行細胞大規模培養，從而有利于在黃花菜細胞水平上進行各種遺傳操作和 生理生化活動的研究。

2.2.3 植物生長調節劑 植物生長調節劑是植物 離體形態發生的最關鍵因素，又稱為植物激素，生 長 素 與 細 胞 分 裂 素 是 組 培 中 常 用 的 兩 種 植 物 激 素[42] 。目前，被廣泛用于誘導體細胞胚胎發生的生 長素類似物有 2，4-D、NAA 等，除玉米素（ZT）、激動 素（KT）、外，具有同樣作用的 6-BA、TDZ 等都是 常用的細胞分裂素。MATAND 等[43] 研究 TDZ的添 加對黃花菜組織培養的影響，證明了 10 mg/L TDZ 對黃花菜愈傷組織的強誘導分裂能力，誘導率最高 為 95.70%；蔡宣梅等[44] 研究發現，適宜黃花菜花蕾 愈 傷 組 織 誘 導 的 激 素 條 件 為 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.25 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L，生 根 激 素 條 件 為 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L+2， 4-D 0.1 mg/L；韓志平等[14] 采用 MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L 作 為 種 子 誘 導 、繼 代 培 養 基 ，1/ 2MS+NAA 0.2 mg/L 作為生根培養基進行組織 培養，獲得了完整植株；張秀珊等[45] 以野生黃花菜 無 菌 苗 的 莖 段 為 材 料 ，在 MS+BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L 培養基上誘導愈傷組織及不定芽， 并用這種培養基進行快速繁殖，最后在 1/2MS+ NAA 0.2 mg/L 的生根培養基上壯苗生根形成完整 植株；劉鳳民等[46] 以黃花菜莖尖為外植體進行組培 快繁，研究采用了誘導培養基 MS+BA 3.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L、繼代培養基 MS+BA 4.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L、生根培養基1/2MS+NAA 0.2 mg/L 或 1/2MS+IBA 0.2 mg/L 的組織培養再生系統。 國內大多數學者采用的是 6-BA 與 NAA 或 6-BA 與 2，4-D 配合的方法來誘導黃花菜愈傷和不定芽， 單獨使用低濃度的 NAA 或 2，4-D 即可有良好的生 根效果。赤霉素和脫落酸等有時也被用于植物組織 培養。GA3對器官的形成表現出了良好的促進作 用，張馨悅[47] 在研究萱草花粉離體培養中發現，添 加 GA3 的培養基中萱草花粉具有良好的萌發效 果，這對于萱草屬植物黃花菜的花粉離體培養研究 有一定借鑒。ABA 抑制植物生長、促進休眠，對植 物 生 長 與 表 征 和 對 逆 境 過 程 的 響 應 發 揮 重 要 作 用[48] ，且 解 除 抑 制 后 的 組 培 苗 容 易 恢 復 生 長[49] 。

GHANATI 等[50] 通過研究組織培養中脫落酸 ABA 與過量 6-BA 互作對芽形成的影響，得出 ABA 的施 加抑制球形胚和心形胚分化成芽，但培養基中高濃 度 6-BA 的添加并不能改善 ABA 的作用。在超低 溫冷凍保存植物資源時，脫落酸甚至可以使植物停 止生長，這是由于它促使植物體抗寒力的形成，從 而使材料得以順利保存。因此，在植物組織培養 中，脫落酸對黃花菜愈傷組織的離體保存可能有一 定促進作用。

2.2.4 培養條件 同其他植物組織培養的共性培 養條件一樣，黃花菜的組織培養全過程需要在一個 密閉無菌的環境條件下進行，培養環境的優劣與否 關系到組培苗的生長好壞，培養間主要的環境條件 包括溫度、光照、氣體情況、濕度等[51] 。溫度影響著 植物細胞的生長速度，也影響著愈傷組織分化增殖 以及器官建成等發育進程，通常情況下黃花菜組織 培養的常設溫度為 20～30 ℃，一般采用（25±2） ℃ 為佳。溫度過低時，植物組織停止生長，常用超低 溫冷藏法來保存愈傷組織和胚狀體。有研究發現， 愈傷組織在保存溫度為 8 ℃或 10 ℃時，1 a 后仍具 有較高的生存能力，在新鮮培養基中按最佳條件培 養時可恢復正常生長[52] 。溫度過高，植物容易產生 褐化、玻璃化現象[53] 。由于培養基中有足夠的碳 源，因此光照在黃花菜的離體培養中并不作為提供 光合作用的能源，僅作為一種誘導因子來影響外植 體脫分化和再分化，一般傷口產生愈傷組織的過程 不需要光照或僅需弱光，因為光照過強會抑制傷口 周緣細胞的增殖，使傷口迅速褐化[54] ，而愈傷組織 在光照條件下才會變綠產生芽點進而分化器官。

培養容器中由于有培養基的存在濕度相對較 高，培養環境中的濕度一般在 70%～80%，環境的 相對濕度對培養基水分的蒸發有一定影響，進而影 響培養基滲透勢，以至于影響植株的生長[55] 。外植 體通過呼吸作用、物質交換、能量代謝等過程才能 生長[56] ，因此，在黃花菜的組培過程中需提供適宜 氣體環境。無糖組培技術是應用了外源二氧化碳 來代替碳源為植物提供能量，實質是植物的光合自 養，在植物壯苗、生根、煉苗、防止污染和玻璃化等 方面具有重要作用。例如在黃花菜的組織培養上 前期傳統有糖誘導試管苗，后期新型無糖壯苗生 根，2 種組培技術相互配合，可以在一定程度上提高 其生產效率、節約成本，商業化高效生產試管苗。

3 黃花菜組織培養的常見問題

3.1 污染

植物組織培養中，污染關系著植物體能否正常 生長發育和后續操作能否正常進行。污染的原因有 多種，如接種人員操作不當引起的污染、操作環境 不清潔造成的污染、培養環境不清潔造成的污染以及 預 處 理 下 外 植 體 消 毒 滅 菌 不 徹 底 引 起 的 污 染 源[57-58] 。在黃花菜的組織培養中，外植體的預處理 即消毒滅菌處理往往是最重要的一項工作，外植體 不同，污染情況也不同，且消毒劑的使用和消毒時 間 均 有 所 不 同（表 2），根 據 以 往 的 研 究 ，70% 或 75% 酒精溶液、0.1% 升汞是最常用的 2 種消毒劑， 新潔爾滅溶液和漂白粉溶液也曾被用作黃花菜花 蕾和種子的消毒，也能在一定程度上減少污染。且在 多數研究中，使用酒精溶液浸泡一般不超過 30 s，使 用 0.1% 升汞溶液浸泡時間為 5～15 min，如用短縮 莖作為外植體，由于短縮莖屬于地下部分或接近地 表，常常含有多種內生菌，預處理下很難消除，因而 消毒滅菌時間可能更長。有些植物內生菌隱藏較 深，預處理時表面消毒無法徹底去除，通常在初代 培養中體現不出來，而經過多次繼代培養，菌量累 積才得以出現在培養基表面[59] 。黃小榮等[60] 則認 為，植物組織培養中休眠菌芽孢萌發是造成菌類污 染的結果。因此，為減少黃花菜組織培養過程中的污 染，除了選擇合適的消毒劑和控制處理時間外，還 可以在培養基添加抗生素、規范接種過程中的各項 操作流程以及定期對培養室殺菌消毒等。

3.2 褐化

在植物組織培養技術實現之前，褐化問題已經 在 園 藝 產 品 及 其 加 工 制 品 中 帶 來 了 很 多 不 利 影 響[61] 。高等植物中的酚類物質有著抵抗菌類侵染、 抗氧化作用、抗逆境條件等重要的生理作用[62] ，同 時它也是引起組織培養褐變的關鍵底物[63] 。在黃 花菜的離體培養中，外植體的生理狀態、植物生長 調節劑、繼代次數和培養基狀態等多種因素都會引 起褐化。程宵婧等[64] 研究花藥離體培養誘導出的 黃白色愈傷組織，后期出現褐化；王靜[15] 以幼葉作 為外植體，未產生愈傷組織的幼葉會慢慢褐化死 亡；在姜華武等[24] 的研究中，愈傷組織繼代培養后， 在其下部周圍有褐化產生。賈薈芹等[65] 以黃花菜 的愈傷組織為試驗材料，研究發現，培養基中添加 活性炭在培養初期對褐變有一定抑制作用，但并不 能從源頭上解決問題，若能與低溫的培養條件相結 合，則能顯著減少褐變的發生。由此可見，可以在 培養基中添加常見的抗褐變劑：活性炭（AC）、抗壞 血 酸（Vc）、聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮（PVP）、硫 代 硫 酸 鈉 （Na2S2O3）等，以及在培養過程中調控培養溫度，從 而在一定程度上預防褐化的產生。

3.3 玻璃化

黃花菜再生苗玻璃化的表現形式有植株矮小、 葉片卷曲失綠、角質層蠟質含量缺少以及苗含水量 高等特點，導致植物體玻璃化的原因包括溫度過 高、瓶內濕度大、通氣不佳等[66] 。目前，有關黃花菜 的玻璃化研究較少。離體植物一旦出現玻璃化，會 直接導致植物死亡，結果將是不可逆轉的。韓志平 等[67] 研究發現，黃花菜離體培養生根階段由于溫濕 度較高，光照較弱，培養基中植物材料的光合作用 等原因，有部分植株葉片呈透明或半透明狀態，出 現玻璃化現象，這時將玻璃化植株從所在的組培 環境中轉移到自然光照下，葉片顏色逐漸回綠，但 1 周后地上部仍然萎蔫直至死亡。事實證明，玻璃化現象在黃花菜組織培養中影響很大，植株一旦出 現玻璃化將無法挽救。為減少或避免黃花菜再生 植株的玻璃化，我們可以通過調整培養基的配方、 降低環境的溫濕度、增加光照等使其有更好的生根 環境，從而后續的移栽煉苗才能易于成活。

4 展望

隨著黃花菜在我國栽培面積的不斷擴大，越來 越多的黃花菜產品出現在人們的生活中，如即食黃 花、黃花榨菜、代餐粉、風味糕點、黃花茶等[68] 。證 明了黃花菜產業成為我國特色農業的代表，具有極 大的發展潛力。長期以來，不少學者對黃花菜的組 織培養進行探索，在外植體的選擇、培養基的配方、 培養條件等方面都有一定的研究，但培養過程中存 在的各項問題層出不窮，仍沒有一個完整的黃花菜 組培快繁體系，以支撐其周年生產及規模化生產。 因此，技術與成本問題成為目前生產上必須解決的 現實問題。另外，黃花菜的組培技術結合單倍體育 種、多倍體育種、基因工程育種、篩選突變體等的研 究都較少，且處于起步階段，建立和優化黃花菜的 離體再生體系，并將其應用于育種、種質資源的保 存等方面，具有廣闊的研究前景。

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