基于LiCl法優(yōu)化釀酒葡萄葉片的RNA提取

摘 要：為獲得純度高、質(zhì)量好的釀酒葡萄植株葉片 RNA 以用于熒光實時定量分析，為后續(xù)以釀酒葡萄葉片 RNA 為材料研究相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控提供技術(shù)保障，以經(jīng)典釀酒葡萄赤霞珠葉片為試驗材料，比較分析了重蒸 酚法、Trizol 法、改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法和 LiCl 法（基于改良的 SDS 法）4 種方法對釀酒葡萄葉 片 RNA 提取的影響。結(jié)果表明，重蒸酚法提取 RNA 濃度較低，完整性較差，存在部分降解；Trizol 法提取的 RNA 則有部分 DNA 污染；改良 CTAB 法提取濃度較高，但蛋白和 DNA 污染嚴重；LiCl 法提取結(jié)果顯示，28S 的 條帶亮度是 18S 的 2 倍，條帶無拖尾，完整性較好，存在 DNA 污染和少量的蛋白污染。進一步在 LiCl法基礎(chǔ)上利 用醋酸鈉、DNAase 消化、苯酚抽提法進一步優(yōu)化，并采用熒光實時定量驗證，結(jié)果表明，醋酸鈉的加入 RNA 質(zhì)量 無明顯改善；然而，經(jīng)氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 2 次，氯仿抽提 1 次，氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 1 次，并經(jīng) DNAase 進行消化，最終提取出質(zhì)量濃度為 173.611 μg/mL、A260/280為 1.803 純度高、完整性較好且無蛋 白和 DNA 污染的葡萄葉片總 RNA；經(jīng)實時熒光定量 PCR 進一步驗證，該方法提取的 RNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得較好 的擴增曲線以及融解曲線，并能夠?qū)ο嚓P(guān)基因進行定量分析。

關(guān) 鍵 詞 ：釀酒葡萄；赤霞珠；RNA 提取；LiCl法優(yōu)化；qRT-PCR

中 圖 分 類 號 ：S663.1 文 獻 標 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0050?08

葡萄隸屬于葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis）， 是一種原產(chǎn)于西亞、歐洲和北非落葉藤本植物，它是 世 界 第 三 大 果 樹[1] ，國 際 葡 萄 和 葡 萄 酒 組 織 （OIV）發(fā)布的 2021 年全球葡萄酒行業(yè)最新數(shù)據(jù)報 告顯示，2020 年中國葡萄種植面積位列全球第 3， 僅次于西班牙和法國[2] 。葡萄的使用用途分為 2 種， 一種是鮮食葡萄，也可制作成葡萄干；另一種為釀 酒葡萄[3] 。調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄酒行業(yè)具有很大的 市場潛力，釀酒葡萄作為葡萄酒的原料，是葡萄酒 品質(zhì)的決定性指標，赤霞珠作為經(jīng)典釀酒葡萄備受 關(guān)注。

隨著葡萄基因組全序列的測序完成，葡萄分子 生物學(xué)研究領(lǐng)域已經(jīng)擴展到基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組 學(xué)、植物生理及病理等各個方向，更精確到基因分 析、cDNA 文庫構(gòu)建、蛋白質(zhì)的互作研究等[4] 。而無 蛋白和 DNA 污染且濃度高的 RNA 則是上述研究 工作的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，植物各組織總 RNA 提取 比動物或者微生物組織總 RNA 提取難度要大得 多，根本原因在于植物組織具有堅硬的細胞壁，細 胞內(nèi)含有多種豐富的次級代謝產(chǎn)物，破碎細胞后， 此類物質(zhì)將在不同時間以不同形式干擾 RNA 的提 取。另外，組織細胞內(nèi)、操作過程中產(chǎn)生的核糖核 酸抑制劑均會對分離樣品中的 RNA 進行降解，其 高穩(wěn)定性是造成 RNA 分離困難的主要原因。葡萄 的不同組織在不同發(fā)育階段其結(jié)構(gòu)和成分有著或 多或少的差異[5] ，特別是葡萄中含有大量干擾 RNA 提取的物質(zhì)：如多酚和多糖類，其中，多酚在提取 RNA 的過程中非常容易被氧化為醌類物質(zhì)，RNA 可 以 與 其 發(fā) 生 不 可 逆 結(jié) 合 ，影 響 RNA 提 取 的 純 度[6-7] ；多糖則由于其許多理化性質(zhì)與 RNA 相似，在 提取的過程中會與 RNA 結(jié)合形成難以分開的共沉 淀[8] 。基于以上原因，最終導(dǎo)致葡萄組織 RNA 的提 取效率不高，且往往耗費大量的時間及試驗成本， 成為急需解決的問題。

目前，植物 RNA 的提取方法有很多種，常用方 法 有 異 硫 氫 酸 胍 法[9-10] 、苯 酚 法 、改 良 Gomez 法 、 LiCl-尿素法、CTAB 法和改良 CATB 法[11-12] 、SDS 法 和 改 良 SDS 法 、Trizol 法 、成 品 試 劑 盒 法[13] 等 。 針對試驗材料的不同，不同的方法各有其優(yōu)劣性。

王暑輝等[14] 對 SDS 酚法進行改進，從側(cè)柏中提取 RNA；淦國英等[15] 采用改良 CTAB 法從香蕉葉片 中提取了高質(zhì)量的 RNA。針對葡萄組織中多酚、 多糖類物質(zhì)含量較高，張今今等[16] 比較了改良 SDS- 酚法、成品試劑盒和異硫氰酸胍法這 3 種完全不同 的 方 法 ，以 期 獲 得 質(zhì) 量 高 、完 整 性 好 的 總 RNA； YANG 等[17] 采用 SiO2自旋柱的提取方法，成功從葡 萄 果 實 中 提 取 出 可 用 于 病 毒 RT-PCR 的 高 質(zhì) 量 RNA；房經(jīng)貴等[18] 采用 CTAB 法從葡萄冬芽中提 取 RNA，李紅熙等[19] 采用 CTAB 結(jié)合 SDS 法從蛇 龍珠葡萄中提取的 RNA 可以滿足 RT-PCR 的要 求；付陽等[20] 采用改良 CTAB 法從山葡萄提取了適 用于 RT-PCR、構(gòu)建 cDNA 文庫等研究的總 RNA； RNA 試劑盒法是獲取植物高質(zhì)量 RNA 樣品的常 用技術(shù)[13] ，具有操作簡便、耗時短和試驗重復(fù)性好 的優(yōu)點[21] ；楊曉燕等[13] 將 3 種常用的試劑盒進行改 進，從葡萄葉片中提取出適合轉(zhuǎn)錄組測序的 RNA； BEUVE 等[22] 采用試劑盒法成功從黑比諾葡萄的綠 葉中提取出可用于檢測葡萄卷葉病毒的總 RNA。 盡 管 已 經(jīng) 有 很 多 研 究 者 經(jīng) 過 大 量 試 驗 對 這 4 種 RNA 提取法進行調(diào)整、優(yōu)化，進而用來提取不同植 物 葉 片 的 總 RNA，但 對 釀 酒 葡 萄 赤 霞 珠 葉 片 總 RNA 的提取尚未見系統(tǒng)的研究與分析。

基于試驗方法的廣泛性及試驗條件的要求，本 研 究 采 用 重 蒸 酚 法 、Trizol 法 、改 良 CTAB 結(jié) 合 SDS 法以及 LiCl 法（基于改良 SDS 法）4 種方法，從 經(jīng)典釀酒葡萄赤霞珠葉片中提取總 RNA，通過比 較 4 種方法提取得到的總 RNA 的純度和濃度確定 較適合的提取方法，并在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，最終 獲得適用于實時熒光定量 PCR 分析的最優(yōu)方法， 旨在為后續(xù)以釀酒葡萄赤霞珠葉片為材料進行研 究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究所用植物材料為實驗室種植的 3 年生 赤霞珠（Cabernet Sauvignon），于 2022 年 3 月種植 于營養(yǎng)土∶蛭石∶椰糠體積比為 7∶2∶1 的土壤中，在 光暗交替（光照 16 h）、溫度為 25 ℃的溫室中常規(guī)化 管理，于赤霞珠植株生長至 10 片葉時采樣。

1.2 RNA 提取方法

1.2.1 Trizol 法（Trizol method） RNase free 2 mL EP 管中加入 0.2 g 新鮮葉片，放入無菌氧化鋯，加 入 600 μL Trizol，50 Hz 破碎 180 s，具體操作參照 文獻[23]進行。

1.2.2 重蒸酚法（Resteam phenoi method） 將 0.2 g 新鮮葉片經(jīng)液氮研磨成粉末，加入 1.2 mL 預(yù)熱后 的 重 蒸 酚 和 10 μL（3 mol/L）NaAC，后 續(xù) 參 照 苗 琪[24] 的研究方法進行。

1.2.3 CTAB結(jié)合SDS法（Improved CTAB method） 稱取 0.4 g 新鮮葉片于研缽中，加入 0.05 g PVP， 加入適量液氮迅速研磨成粉末，參照 HENRIQUE 等[25] 以及王杰等[26] 的研究方法進行。

1.2.4 LiCl 法（LiCl method） 稱取 0.1 g 的新鮮葉 片，用液氮在研缽中研磨成粉末，參照張彥蘋等[27] 以及彭婧等[28] 的方法提取，采用 1% 的瓊脂糖凝膠 電泳檢測 RNA 的完整性和純度。

1.3 LiCl法的優(yōu)化處理

在 LiCl 法基礎(chǔ)上利用醋酸鈉、DNAase 消化、 苯酚抽提法進一步優(yōu)化（表 1）。

1.4 RNA 檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀上 觀察 RNA 條帶，以篩選出濃度高、無污染的赤霞 珠植株葉片總 RNA。同時采用超微量分光光度 計（Micro Drop）測定 1 μL 樣品中 RNA 濃度，并分 別 檢 測 260 nm 和 280 nm 下 吸 光 光 度 值 ，并 計 算 A260/280值[29] 。

1.5 實時熒光定量 PCR 分析

參 照 文 獻 [30]將 獲 得 的 釀 酒 葡 萄 植 株 葉 片 RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，向 8 聯(lián)管內(nèi)依次添加 Primer F、Primer R、dTOP Mix（實時熒光定量檢測 預(yù) 混 酶 試 劑）、ddH2O。 Real Time PCR 儀 器 為 LightCycle?480II。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種不同方法提取赤霞珠葡萄葉片 RNA 比較

在樣品基本一致的前提下，不同提取方法處理 樣品方式不同，Trizol 法是需要借助儀器對植物組 織進行破碎，其他方法則需液氮研磨后放-80 ℃保 存?zhèn)溆谩＠?Trizol法提取的 RNA時間短，約 6.5 h， 而利用重蒸酚法提取時間 7 h，CTAB 結(jié)合 SDS 法 用時約為 9 h，LiCl 法總體用時最長，需要過夜；但 是相比前 3 種方法，LiCl 法實際操作時間比較短， 且 LiCl法不需要組織研磨儀和水浴鍋等，操作比較 簡單。

經(jīng) 4 種方法提取的 RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢 測，結(jié)果顯示（圖 1），重蒸酚法和 Trizol法提取 RNA 的 18S 和 28S 的條帶亮度相近且均很弱，表明提取 RNA 濃度較低，完整性較差，其中，Trizol 法提取的 RNA 存在基因組 DNA 污染。改良 CTAB 法、LiCl 法提取的 RNA 條帶則表現(xiàn)出較強的亮度，表明這 2 種方法提取的赤霞珠總 RNA 濃度高，其中改良 CTAB 法提取結(jié)果顯示有大量彌散條帶以及膠孔 位置的阻滯條帶，表明存在 DNA 污染以及蛋白污 染；LiCl 法提取的 RNA，28S 的條帶亮度是 18S 的 2 倍，并且條帶無拖帶現(xiàn)象，表明這種方法提取的 RNA 完整性較好，濃度較高，但是依然有 DNA 污 染和少量的蛋白污染。總之，上述結(jié)果表明，重蒸 酚法和 Trizol 法提取率低，改良 CTAB 法和 LiCl 法 盡管能夠保證濃度，但 CTAB 法 DNA 以及蛋白污 染程度更高，僅采用上述 4 種方法均不能直接用于 釀酒葡萄赤霞珠葉片 RNA 的提取，因此，選擇完整 性高、污染程度較弱的 LiCl 法繼續(xù)優(yōu)化，以期最終 提取出完整性好、濃度高、無 DNA 及蛋白污染的赤 霞珠葉片 RNA。從重蒸酚提取葡萄葉片中可以發(fā) 現(xiàn)，盡管提取的 RNA 完整性較差，但是沒有 DNA 污染。對照組沒有優(yōu)化的 LiCl 法（只加 50 μL 的 β- 疏基乙醇）提取的 RNA，濃度和完整性均較好，但 是 DNA 污 染 比 較 嚴 重 ，并 且 仍 存 在 少 量 蛋 白 污染。

2.2 不同處理優(yōu)化 LiCl法

醋酸鈉在植物提取總 RNA 過程中起到去除多 糖、基因組 DNA、維持提取液的酸性環(huán)境、不破壞 RNA 結(jié) 構(gòu) 的 作 用[31] ，因 此 ，首 先 利 用 醋 酸 鈉 優(yōu) 化 LiCl 法。由圖 2-A 可知，僅醋酸鈉時無電泳條帶 （Lane2）；當組合 25 μL 和 50 μL β-疏基乙醇時（分 別對應(yīng) Lane3 和 Lane4），出現(xiàn)蛋白質(zhì)和 DNA 污染 條帶，但所得 RNA 條帶仍不清晰。而僅有 50 μL β-疏基乙醇時，盡管存在蛋白質(zhì)和 DNA 污染嚴重， 但 RNA 條帶清晰（Lane1）。

為了除去 RNA 提取中的 DNA 污染，進一步選 用 RNase-Free DNase I 處理，結(jié)果如圖 2-B 所示， 用 RNase-Free DNase I 消 化 后 的 2 條 泳 道 中 28S 和 18S 的條帶亮度都比較清晰，無拖尾現(xiàn)象，RNA 完整性較好，并且沒有出現(xiàn)基因組 DNA 的條帶，表 明 用 這 個 方 法 可 以 有 效 去 除 提 取 總 RNA 中 的 DNA 污染。對于結(jié)果顯示的少量的蛋白污染將做 進一步優(yōu)化。

在提取 RNA 的過程中，氯仿作為有機溶劑可 以使蛋白變性，同時對溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)起到一定除雜作用；水飽和酚也具有去除蛋 白和 DNA 污染的作用[32] 。本研究中，采用 2 種試劑 進行多次抽提，并在最后均使用無 RNA 酶的 DNA 酶處理消化 DNA，結(jié)果如圖 2-C所示，經(jīng)氯仿和水飽 和酚（體積比 1∶1）抽提 2 次的 RNA 存在嚴重蛋白 污染（圖 2-C-I），RNA 質(zhì)量濃度為 160.950 μg/mL， 且 A260/280為 1.211（表 2），也證實蛋白污染嚴重；經(jīng) 氯仿抽提 1 次、水飽和酚抽提 2 次、氯仿和水飽和 酚（體積比 1∶1）抽提 1 次之后的 RNA 條帶比較清 晰，完整性比較好（圖 2-C-II），但仍存在少許的蛋 白污染且質(zhì)量濃度 RNA 較低（70.204 μg/mL）（表 2），可能是由于提取過程中損失較多；經(jīng)氯仿和水飽 和酚（體積比 1∶1）抽提 5次的 RNA 無明顯的蛋白污 染（圖 2-C-III），但濃度較低（93.652 μg/mL）（表 2）； 氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 2 次、氯仿抽提 1次、氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 1次的 RNA， 28S 和 18S 的條帶亮度都很好，并且條帶無拖尾（圖 2-C-IV），質(zhì) 量 濃 度 為 173.611 μg/mL，A260/280 為 1.803（表 2），表明這種方法提取的 RNA 完整性好 且濃度高。上述結(jié)果表明，水飽和酚氯仿優(yōu)化 LiCl 中采用方案 IV，即氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽 提 2 次、氯仿抽提 1 次、氯仿和水飽和酚（體積比 1∶ 1）抽提 1次能夠最終獲得完整性最好、濃度最高、無 明顯蛋白污染的赤霞珠葡萄葉片總 RNA。

將獲得的釀酒葡萄植株葉片 RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄 為cDNA在PCR儀中反應(yīng)后，用RNase-Free dd H2O 稀釋，接著加入 Primer F、Primer R、dTOP Mix（實 時熒光定量檢測預(yù)混酶試劑）、ddH2O 等物質(zhì)進行 反應(yīng)。qRT-PCR 是在標準 PCR 體系中加入了熒 光物質(zhì)通過熒光信號的積累能夠?qū)崟r監(jiān)測每次循 環(huán)后 PCR 產(chǎn)物的變化，并生成熒光擴增曲線，該技 術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對初始模板的定量分析[33] 。qRT-PCR 試驗要求提取的 RNA 有 2 個要素，一是濃度高、完 整性較好，二是無蛋白和 DNA 污染，二者缺一不 可。圖 3 結(jié)果顯示，對內(nèi)參基因進行 qRT-PCR 擴 增后出現(xiàn)對應(yīng)的擴增曲線，且融解曲線為單峰，為 80～90 ℃，表明擴增產(chǎn)物特異性好，提取 RNA 可用 于實時熒光定量 PCR 分析；同時內(nèi)參基因的 Ct 值 在 19 左右，大部分目的基因的 Ct 值為 20～30，少數(shù) 2 個基因在 30 左右（表 3）。按照圖 4 的 RNA 提取 流程，結(jié)果表明，優(yōu)化后 LiCl法得到的 RNA 質(zhì)量良 好，能夠用于 qRT-PCR 分析。

3 結(jié)論與討論

本研究在分析比較 4 種常用 RNA 提取方法的 基礎(chǔ)上，確定從 LiCl法出發(fā)，從基因組 DNA 污染和 蛋白污染 2 個方面進行優(yōu)化，最終獲得用于提取釀 酒葡萄赤霞珠葉片總 RNA 的方法。該方法提取的 RNA 完整性好、純度高、無污染，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn) 錄以及實時定量 PCR 分析，為后續(xù)其作為材料的 相關(guān)代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

研究結(jié)果顯示，LiCl 法（基于改良 SDS 法）提 取 RNA 效果最好，RNA 條帶清晰不拖尾，亮度高， 雖然有輕微 DNA 和蛋白污染，但是無論是濃度還 是完整性均是最佳，有利于后續(xù)試驗的進行。改良 CTAB 法提取的 RNA 完整性較好、濃度較高，但是 提取葡萄葉片需要的樣品量較多、樣品較少時，不 利于實驗進行，且有蛋白和 DNA 污染。使用 Trizol 法和重蒸酚法很難從赤霞珠葉片中提取出高質(zhì)量 的總 RNA，盡管重蒸酚法中基本上無 DNA 和蛋白 污染，Trizol 法存在嚴重降解和污染等問題。有研 究表明，重蒸酚法提取喜樹 RNA 的效果較好[34] ，而 在本研究中對葡萄葉片的提取效果不理想，這可能 是因為葡萄赤霞珠葉片中含有較多的有機酸、多酚 和其他一些次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)可與 RNA 相 互作用，形成不溶于水相的復(fù)雜混合物，在抽提過 程中 RNA 可與這些物質(zhì)共聚合而損耗，從而影響 RNA 的提取量和質(zhì)量。有報道指出，Trizol 對葡萄 RNA 的提取質(zhì)量好，條帶銳利，可清晰看出 28S 與 18S 亮度比為 2∶1[35] 。但在本試驗中，提取效果不 理想，推測可能是由于提取組織的不同，導(dǎo)致雜質(zhì) 未去除完全。上述結(jié)果表明，這 2 種方法均不適合赤霞珠葉片總 RNA 的提取，最終選在 LiCl 法的基 礎(chǔ)上進行改良。

根據(jù)上述結(jié)果，從基因組 DNA 污染和蛋白污 染 2 個方面進行優(yōu)化。針對 DNA 污染，研究發(fā)現(xiàn)， 在用重蒸酚提取 RNA 的方法中無基因組污染，選 擇加入醋酸鈉進行優(yōu)化，結(jié)果并沒有提高 RNA 的 提取質(zhì)量，甚至使 RNA 降解；RNase-FreeDNase I 消化是比較常用的去除 RNA 溶液中 DNA 的方法， 結(jié)果顯示，無明顯基因組 DNA 條帶。進一步利用 氯仿和水飽和酚這 2 種試劑去除蛋白污染，發(fā)現(xiàn)氯 仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 5 次和氯仿水飽和 酚（體積比 1∶1）抽提 3 次中間加 1 遍氯仿效果是比 較理想的，消除了蛋白污染，RNA 濃度也較高。

本研究進一步利用其反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，并以 其為模板進行熒光實時定量分析，內(nèi)參基因以及其 他基因的 Ct 值約為 20 左右，符合實驗要求。同時 利用實時定量成功檢測到一些抗寒基因不同程度 的表達，這與文獻報道相一致[36] ，表明制備的 RNA 可以用于后續(xù)熒光實時定量分析，這為釀酒葡萄葉 片以及其他組織 RNA 提取提供一定參考。

本研究通過對 4 種常規(guī) RNA 提取方法比較發(fā) 現(xiàn)，LiCl 方法相對較優(yōu)，進一步針對 RNA 降解以及 蛋白和 DNA 污染問題進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，β-疏基乙醇、 氯仿和水飽和酚（體積比 1∶1）抽提 2 次，然后加入 氯仿抽提 1 次，最后用氯仿和水飽和酚（體積比 1∶ 1）抽提 1 次是提取赤霞珠葡萄葉片 RNA 的最適宜 方法，進一步經(jīng) RNase-FreeDNase I 進行消化，就 可以得到純度高、完整性好、用于實時定量 PCR 的 釀酒葡萄葉片 RNA。盡管本研究獲得最佳的試驗 方法，解決了完整性、高純度無污染的問題，但用時 較長，后續(xù)將進一步對實驗操作精簡進行研究。

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