梨小食心蟲卵黃原蛋白基因的鑒定及表達(dá)分析

摘 要：為明確重要果樹害蟲梨小食心蟲（Grapholita molesta）卵黃原蛋白（Vitellogenin，Vg）基因功能及其生殖 調(diào)控機(jī)制，為 GmVg 基因功能的深入研究奠定理論基礎(chǔ)，克隆鑒定了梨小食心蟲卵黃原蛋白基因（GmVg）并進(jìn) 行生物信息學(xué)分析，通過 qRT-PCR 分析 GmVg 在梨小食心蟲不同發(fā)育時期、不同性別和不同組織的表達(dá)模式。 結(jié)果表明，GmVg 基因全長 5 573 bp，開放閱讀框（ORF）5 364 bp，編碼 1 787 個氨基酸，信號肽長度為 15 個氨基 酸，分子式為 C9041H14090N2544O2743S57；氨基酸組成中丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Gln）和絲氨酸（Ser）占比最大，分別為 8.2%、7.9% 和 7.8%，酸性殘基的數(shù)量（Asp+Glu）為 187 個，堿性殘基的數(shù)量（Arg+Lys）為 204 個，預(yù)測蛋白質(zhì) 分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為 204.1 ku 和 8.79，具有 Vitellogenin-N、DUF1943 和 VWD 共 3 個典型保守結(jié)構(gòu)域 。 GmVg 成蟲期的表達(dá)量顯著高于卵、幼蟲和蛹期，且羽化后 24 h 時達(dá)到峰值。GmVg 的表達(dá)具有性別特異性，在 雄蟲中表達(dá)量極低。GmVg 在雌成蟲頭部、卵巢和脂肪體中的表達(dá)呈現(xiàn)組織特異性，其中脂肪體顯著高表達(dá)，分 別是頭部和卵巢表達(dá)量的 21.49 倍和 16.4 倍。

關(guān) 鍵 詞 ：梨小食心蟲；卵黃原蛋白；基因克隆；發(fā)育時期表達(dá)；組織表達(dá)

中 圖 分 類 號 ：S436.612.2 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0058?07

梨 小 食 心 蟲（Grapholita molesta）屬 鱗 翅 目 （Lepidoptera）卷蛾科（Tortricidae），是一種全球性 的重要果樹害蟲[1] ，可嚴(yán)重危害桃、梨、蘋果等多種 經(jīng)濟(jì)果樹[2] 。強(qiáng)大的生殖潛力是該蟲暴發(fā)和擴(kuò)張的 重要原因，目前國內(nèi)外對梨小食心蟲生殖生理的研 究主要集中在生殖系統(tǒng)解剖和卵巢發(fā)育分級上[3] ，生殖相關(guān)基因的研究較少。卵黃原蛋白（Vitellogenin， Vg）是昆蟲一類重要的生殖蛋白，大部分昆蟲的 Vg 在脂肪體產(chǎn)生，進(jìn)入血淋巴后被卵母細(xì)胞表面 的卵黃原蛋白受體（Vitellogenin receptor，VgR）捕 獲，通過胞吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過進(jìn)一步的加 工和修飾，最后以晶體的形式在卵內(nèi)沉積為卵黃 蛋白，為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng)，這一過程被稱為卵 黃發(fā)生[4] 。

自 1954 年 Telfer 在惜古比天蠶蛾（Halophora cecropia）中發(fā)現(xiàn)第 1 個 Vg 蛋白以來[5] ，人們對 Vg 的 研究逐漸增多，內(nèi)容涵蓋分子特性、生理功能與調(diào) 控通路等。Vg基因的序列全長一般為 6～7 kb，編碼 蛋白分子質(zhì)量約為 200 ku，屬于載脂蛋白超家族[6] ， 最顯著的特征是在 N 末端存在聚絲氨酸區(qū)，此區(qū)域 附近通常含有切割位點(diǎn) R/KXXK/R，是一些內(nèi)源 蛋白酶的識別位點(diǎn)[7] ，此外還有 CL/ICG 基序、數(shù)量 不等的半胱氨酸殘基等保守結(jié)構(gòu)域。Vg基因具有性 別、發(fā)育時期和組織表達(dá)特異性，大部分昆蟲的 Vg 在雌蟲脂肪體特異表達(dá)，少部分在昆蟲其余部位也 有表達(dá)，比如意大利蜜蜂（Apis mellifera）的卵巢及 雄峰和工蜂的脂肪體[8-9] 、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的表皮[10] 。Vg 的表達(dá)合成與卵黃發(fā)生 緊密相關(guān)，所以一般昆蟲的 Vg 在卵巢發(fā)育的透明 期和卵黃沉積期開始表達(dá)，成熟期達(dá)到高峰，到產(chǎn) 卵末期開始下降，區(qū)別在于達(dá)到峰值的時間不同。 目前，Vg 被證明除了為昆蟲卵巢和胚胎的發(fā)育提 供營養(yǎng)外，在一些社會性昆蟲中還有信息傳遞[11] 、 調(diào)節(jié)行為[12] 和介導(dǎo)免疫[13-14] 等功能。

Vg 的合成與沉積是昆蟲生殖活動中的關(guān)鍵環(huán) 節(jié)，直接影響到昆蟲的卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生[15-16] ，目 前，Vg 基因已成為害蟲控制的重要潛在靶標(biāo)，但梨 小食心蟲未見相關(guān)研究報道。本研究克隆鑒定了 梨小食心蟲 Vg 全長序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析， 利用 qRT-PCR 分析 Vg 基因在梨小食心蟲不同發(fā) 育階段、性別和組織中的表達(dá)模式，旨在為該基因 功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)嫘∈承南x來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù) 學(xué)院生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件為溫度 26 ℃ 、光 周 期 L∶D=16 h∶8 h、相 對 濕 度 60%～ 80%。幼蟲以人工飼料喂養(yǎng)，成蟲用 10% 的蜂蜜 水浸潤棉花球飼喂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 在液氮中，用電 動研磨棒快速研磨梨小食心蟲各個時期的樣品至 粉 末 ，采 用 Trizol（TaKaRa，Dalian，China）按 步 驟 提取總 RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和超微量蛋白 核 酸 分 析 儀（BioDrop，Cambridge，UK）檢 測 總 RNA 的 質(zhì) 量 和 濃 度 。 使 用 HiScript? Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Vazyme，Nanjing，China）按說明書步驟反轉(zhuǎn)錄 獲得 cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 梨小食心蟲 Vg 的克隆 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得 梨小轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以 NCBI 其他已報道昆蟲 Vg 蛋 白序列建立本地 BLAST 數(shù)據(jù)庫，比對篩出預(yù)測序 列，利用 Primer Premier 5軟件設(shè)計擴(kuò)增引物，分 3段 進(jìn)行擴(kuò)增（圖 1）。

利用 Beacon Designer 7 軟件設(shè)計特異性定量 引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合 成（表 1）。PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 5 min； 95 ℃變性 15 s，50 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸 5 min。用 1% 瓊脂糖凝膠電 泳分離，經(jīng)膠回收和連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，送 于上海生工生物工程有限公司測序，測序正確后拼 接序列。

1.2.3 梨 小 食 心 蟲 Vg 生 物 信 息 學(xué) 分 析" 利 用 NCBI 的 BLAST 功能將其與數(shù)據(jù)庫其他物種 Vg 序列進(jìn)行同源性序列比對。通過在線工具ProtParam （http：//web. expasy. org/protparam/）預(yù) 測 其 理 論 分 子 量 、等 電 點(diǎn) 、氨 基 酸 組 成 等 。 采 用 NCBI 的 CDD（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi）在線程序進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。采 用 SignalP 4.1 Server（http：//www. cbs. dtu. dk/ser? vices/SignalP/）對蛋白質(zhì)的信號肽進(jìn)行預(yù)測。使 用 MEGA 7.0 軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）對 4 個目（鱗翅目、鞘翅目、半翅目和雙翅目）16 個物 種的Vg蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000次[17] 。

1.2.4" 梨 小 食 心 蟲 Vg 的 時 空 表 達(dá) 分 析" 利 用 qRT-PCR 技術(shù)檢測梨小食心蟲 GmVg 在不同時期 （卵、幼 蟲、蛹 和 成 蟲）以 及 成 蟲 不 同 性 別 和 組 織 （頭、脂肪體和卵巢）的表達(dá)情況。具體取樣時期如 下：卵，1～3 d 混樣；幼蟲和蛹均為整個齡期的混 樣；成蟲，羽化后 24、48、72、120 h 的雌蟲。組織中 的頭部、脂肪體和卵巢均來自羽化一天內(nèi)未交配的 雌蟲；雄蟲樣品為同一批羽化的整頭雄成蟲。所有 樣品均設(shè)置 3 個生物學(xué)重復(fù)。

以 β-tubulin 為內(nèi)參，使用 ABI 7500 實(shí)時熒光 定量 PCR 儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA， USA）完成qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2?ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上 下 游 引物各 0.8 μL，10×cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至 20 μL。 反 應(yīng) 程 序 為 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40次循環(huán)；熔解曲線程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。設(shè)置 3個技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采 用 2-ΔΔCt 法 計 算 基 因 的 相 對 表 達(dá) 量 ，使 用 SPSS.26.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析， 應(yīng) 用 Tukey's HSD 法 進(jìn) 行 差 異 顯 著 性 檢 驗(yàn)（Plt; 0.05），通過 GraphPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmVg 基因克隆

以梨小食心蟲雌成蟲腹部 cDNA 模板，分 3 個 部分進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，3 個 部分均得到預(yù)期大小條帶（圖2），分別為2 291、1 904、 2 020 bp。測序正確后進(jìn)行拼接，命名為 GmVg。

2.2 GmVg 序列分析

克 隆 獲 得 GmVg 序 列 全 長 為 5 573 bp（Gen Bank 登錄號為 OQ545589），開放閱讀框（ORF）為 5 364 bp，編碼 1 787個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 為204.1 ku，預(yù)測等電點(diǎn)為8.79，信號肽長度為15個氨 基酸，具體序列為 MKLLVLATFVALVAS，分子式 為 C9041H14090N2544O2743S57，氨基酸組成中丙氨酸（Ala）、 谷 氨 酸（Gln）和 絲 氨 酸（Ser）占 比 最 大 ，分 別 為 8.2%、7.9% 和 7.8%。酸性殘基的數(shù)量（Asp+Glu） 為 187個，堿性殘基的數(shù)量（Arg+Lys）為 204個。

將 GmVg 與其他鱗翅目昆蟲，包括大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）、云 杉 卷 葉 蛾（Cho? ristoneura fumiferana）、旖鳳蝶（Iphiclides podalirius）、 月 形 天 蠶 蛾（Actias selene）、阿 波 羅 蝶 （Parnassius apollo）、玉帶鳳蝶（Papilio polytes）、柑橘鳳蝶（Pa? pilio xuthus）和 冬 尺 蠖 蛾 （Operophtera brumata）的 Vg 氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，梨小食心蟲與 大豆食心蟲的 Vg蛋白序列相似度最高，為 84.76%， 與其余昆蟲 Vg 蛋白序列相似度均在 55%～58% （圖 3）。此外，DGXR、半胱氨酸殘基和聚絲氨酸基 序在這些鱗翅目昆蟲中高度保守。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

GmVg 與其他物種 Vg 氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育 和保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖 4 所示。

通過 NCBI 的 CDD 在線工具分析發(fā)現(xiàn)，梨小食 心蟲 Vg 蛋白序列中存在 3 個相對保守的結(jié)構(gòu)域，N 末端存在 Vitellogenin-N（30—746 位氨基酸）結(jié)構(gòu) 域，DUF1943 結(jié)構(gòu)域（787—1 050 位氨基酸），C 末 端存在 VWD（Von Willebrand factor type D domain） 結(jié)構(gòu)域（1 455—1 625 位氨基酸）（圖 4）。16 種昆蟲 的 Vg 保守基序分析發(fā)現(xiàn)，Motif 1～Motif 5 最保守， Motif 6 在鱗翅目昆蟲中高度保守，Motif 10 在不同 物種中數(shù)目差異較大（圖 4）。

利用軟件 MEGA 7.0，采用 NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā) 育樹，結(jié)果表明（圖 4），梨小食心蟲 Vg 與其他鱗翅 目昆蟲聚為一支，其中與小卷蛾亞科（Olethreutinae） 的大豆食心蟲 Vg 親緣關(guān)系最近，與多序列比對結(jié) 果相同。所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹與傳統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果 一致，這在一定程度上反映了梨小食心蟲 Vg 在物 種中的進(jìn)化位置和親緣關(guān)系。

2.4 GmVg在梨小食心蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

GmVg 在成蟲期的表達(dá)量顯著高于卵期、幼蟲 期和蛹期的表達(dá)量，且卵期和幼蟲期的表達(dá)水平極 低。從蛹期開始，GmVg 表達(dá)量開始升高，羽化后 24 h GmVg 的表達(dá)量達(dá)到峰值，之后 4 d 內(nèi) GmVg 表達(dá)量與羽化后 24 h GmVg 的表達(dá)量相比顯著降 低，但依舊維持在較高的水平（圖 5）。

2.5 GmVg 在梨小食心蟲不同組織和性別中的表 達(dá)模式

GmVg 在梨小食心蟲雌蟲的頭部、卵巢和脂肪 體中表達(dá)具有組織特異性，GmVg 在雌蟲脂肪體顯 著高表達(dá)，其表達(dá)量分別是頭部和卵巢表達(dá)量的 21.49 倍和 16.4 倍（圖 6）。同時 GmVg 的表達(dá)具有 性別特異性，在雄成蟲中表達(dá)量極低（圖 6）。

3 結(jié)論與討論

卵黃原蛋白為大部分卵生生物胚胎的發(fā)育提 供營養(yǎng)，其正確合成與沉積是種群繁衍的基礎(chǔ)[18] 。 本 研究克隆鑒定了梨小食心蟲 GmVg 全長序列，序 列分析發(fā)現(xiàn)信號肽長度為 15，與草地貪夜蛾（Spodop? tera frugiperda）[10] 一 致 ，斜 紋 夜 蛾（Spodoptera li? tura）Vg信號肽長度為 17[19] ，煙粉虱（Bemisia tabaci） 為 28[20] 。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)所有昆蟲 Vg 均含有 Vitellogenin-N、DUF1943 和 VWD 共 3個保 守結(jié)構(gòu)域。不同目的昆蟲 Vg保守基序數(shù)目不同，其 中，Motif 6（YGHCHHRVDYHFGVPEGAEWTG TAHKPEEDQFIKRATVSRILAGKQGPIY）在 鱗 翅 目 中 高 度 保 守 ，在 其 他 目 昆 蟲 中 未 見 該 基 序 。

Motif 10（SSSSSSSSSSSSSES）為連續(xù)的絲氨酸， CHEN 等[21] 研究表明，此區(qū)域進(jìn)化速率較快。本研 究發(fā)現(xiàn)，梨小食心蟲和大豆食心蟲 Vg 中只含有 1 個 Motif 10，其他鱗翅目昆蟲均存在 2 個，半翅目與雙翅目昆蟲 Vg 序列 C 端也發(fā)現(xiàn)此基序，但是數(shù)量不 一，而鞘翅目中不存在 Motif 10。DGXR 和半胱氨 酸殘基對 Vg 蛋白寡聚化反應(yīng)是必需的[22] ，在鱗翅 目昆蟲中高度保守，與本研究結(jié)果一致。此外發(fā) 現(xiàn)，GICG 基序在梨小食心蟲中突變?yōu)?GVCG，與小 菜蛾突變情況一致[23] ，其原因和影響有待進(jìn)一步 探討。 GmVg 在梨小食心蟲成蟲期的表達(dá)量顯著高 于其他發(fā)育時期，亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）[24] 、 草 地 貪 夜 蛾[10] 和 大 眼 長 蝽（Geocoris pallidipen? nis）[25] 等昆蟲 Vg 基因的表達(dá)量也均在成蟲期最高， 區(qū)別在于表達(dá)高峰期不同，梨小食心蟲 Vg 表達(dá)高 峰為羽化后第 1 天；與亞洲玉米螟相同，草地貪夜 蛾為羽化后第 4 天；大眼長蝽在羽化后第 22 天達(dá)到 高峰，推測這可能與昆蟲卵黃發(fā)生的時期不同有 關(guān)。眾多研究表明，昆蟲的 Vg 在雌蟲脂肪體特異 性高表達(dá)[23-26] ，本研究結(jié)果為與上述結(jié)論一致。本 研究發(fā)現(xiàn)，GmVg 除在雌蟲中表達(dá)外，其在整頭雄 蟲中也可被檢測到，但相關(guān)研究報道較少，GmVg 在雄蟲中的功能還有待進(jìn)一步研究。卵黃發(fā)生是 昆蟲生殖活動中最重要的一環(huán)，而 Vg 是其中的關(guān) 鍵因子，可作為害蟲生殖調(diào)控的靶標(biāo)基因。向杏仁 蛾（Cadra cautella）注射 Vg-dsRNA 后，Vg 表達(dá)量 下調(diào)，產(chǎn)卵量顯著降低，且由于卵黃沉積受到影響， 大量的卵不能正常孵化[26] 。小菜蛾注射 Vg-dsRNA 后，羽化 5 d 內(nèi)的總產(chǎn)卵量也顯著下降[23] 。此外，它 還 是 一 個 多 效 性 蛋 白 ，將 工 蜂（Apis mellifera）的 Vg 干擾后，改變了其生命周期，使其提前進(jìn)行覓食 活動，并伴隨其他一些行為和生理變化[27] 。在梨小 食心蟲中 Vg 是否具有這些功能，還需進(jìn)一步利用 如 RNAi等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究克隆鑒定了梨小食心蟲 GmVg 基因，明 確了 GmVg 在梨小食心蟲不同發(fā)育時期、性別和不 同組織的表達(dá)模式，為梨小食心蟲 GmVg 功能的深 入研究及作為害蟲防治潛在靶點(diǎn)的開發(fā)奠定了一 定理論基礎(chǔ)。

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