蓮草直胸跳甲3個氣味結(jié)合蛋白基因的克隆與表達(dá)分析

摘 要：氣味結(jié)合蛋白昆蟲嗅覺通訊過程中的重要蛋白質(zhì)，參與昆蟲氣味識別的第一步反應(yīng)，在昆蟲覓食、聚集、 求偶和尋找產(chǎn)卵場所等活動中起重要作用。為明確蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）氣味結(jié)合蛋白基因 （OBP）表達(dá)特征，初步了解其功能，對 3 個 OBP 基因進(jìn)行了克隆與生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析了它們在不同組織中的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，AhygOBP27、AhygOBP32 與 AhygOBP44 的開放閱讀框分 別為 351、408、423 bp，其編碼的蛋白質(zhì)是分子量較小的酸性可溶性蛋白質(zhì)。其中，AhygOBP27 主要在雌雄蟲的 觸角、頭、足、翅中表達(dá)；AhygOBP32 主要在雌雄蟲的觸角、足、翅以及雄蟲的頭中表達(dá)；AhygOBP44 主要在雌雄 蟲的觸角、頭、足中表達(dá)。這 3 個基因在雌雄成蟲觸角中的表達(dá)水平均顯著高于其他組織，其中 AhygOBP27 與 AhygOBP44 在雌性觸角中的表達(dá)水平顯著高于雄性；AhygOBP32 在雄性觸角中的表達(dá)水平顯著高于雌性。推 測這 3 個基因在蓮草直胸跳甲嗅覺識別過程中起重要作用，AhygOBP27 和 AhygOBP44 可能與識別寄主植物揮 發(fā)物和尋找產(chǎn)卵地相關(guān)，AhygOBP32 可能參與雄蟲識別雌蟲釋放的性信息素。

關(guān) 鍵 詞 ：喜旱蓮子草；蓮草直胸跳甲；氣味結(jié)合蛋白；基因克隆；組織表達(dá)

中 圖 分 類 號 ：S476.2 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 碼 ：A 文 章 編 號 ：1002?2481（2024）02?0089?08

喜旱蓮子草（Alternanthera philoxeroides）是一 種全球范圍內(nèi)的惡性入侵雜草[1] ，其生長迅速，有極 強(qiáng)的繁殖力和生態(tài)適應(yīng)性，會對入侵地的生態(tài)環(huán)境 造成嚴(yán)重影響[2] 。19 世紀(jì)末，喜旱蓮子草侵入到我 國后迅速蔓延傳播，已成為我國分布最廣、危害最 為嚴(yán)重的雜草之一，且目前分布范圍仍在擴(kuò)大[3] 。為了有效遏制喜旱蓮子草，受其侵害的國家均采取 過各種措施，而利用其專食性天敵蓮草直胸跳甲是 目前最有效的防治方法[4] 。

蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）原產(chǎn)于南 美 洲 ，先 后 被 多 個 國 家 引 進(jìn) 用 于 防 治 喜 旱 蓮 子 草[5-6] 。我國于 1986 年首次引進(jìn)后，對其進(jìn)行了一 系列的寄主專一性測定實(shí)驗(yàn)[7-8] ，認(rèn)為其安全可靠， 可在我國大量推廣用于防治喜旱蓮子草。研究表 明，蓮草直胸跳甲是利用喜旱蓮子草的主要揮發(fā)物 與非寄主植物揮發(fā)物的特異性比例來尋找定位寄 主植物[9] ，嗅覺在蓮草直胸跳甲識別喜旱蓮子草的 過程中起到了至關(guān)重要的作用。

氣味結(jié)合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs） 是一類存在于昆蟲嗅覺感受器淋巴液中的小分子 球狀蛋白[10] 。當(dāng)外界氣味分子進(jìn)入觸角感器后，首 先與淋巴液中的 OBPs 結(jié)合形成復(fù)合體，隨后到達(dá) 嗅覺神經(jīng)元，激活神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體，使 化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺⒋碳ど窠?jīng)，指導(dǎo)昆蟲作 出相應(yīng)反應(yīng)[11] 。因此，OBPs 與氣味分子結(jié)合是昆 蟲嗅覺識別的第一步反應(yīng)[12] 。

1981 年 ，首 個 OBP 家 族 成 員 在 多 音 天 蠶 Antheraea polyphemus 雄蛾的觸角中被鑒定出來， OBPs 也被認(rèn)為只在昆蟲的觸角中特異性表達(dá)[13] 。 后來發(fā)現(xiàn)，OBPs 不僅在觸角中表達(dá)，在除觸角以外 的其他組織中也有表達(dá)，這可能與其行使不同的功 能有關(guān)[14] 。如二化螟 Chilo suppressalis CsupOBP8 主要在成蟲觸角中表達(dá)，可識別 β-紫羅酮、橙花叔 醇、法尼醇和二己酮等多種寄主植物揮發(fā)物[15] ；麥 長管蚜（Sitobion avenae Save）的 OBP3 在足部高表 達(dá)，暗示著其具有某種特殊的嗅覺功能[16] ；中華蜜 蜂（Apis cerana cerana Acer）的 OBP19 在口器中表 達(dá)量較高，推測它們與味覺識別相關(guān)[17] 。近年來， 隨著分子生物技術(shù)不斷發(fā)展，越來越多的研究通過 對昆蟲的 OBP 基因進(jìn)行表達(dá)分析以探究其功能， 其 中 ，包 括 鞘 翅 目[18] 、鱗 翅 目[19] 、膜 翅 目[20] 、半 翅 目[21] 、直翅目[22] 、纓翅目[23] 等中的近 100 種昆蟲。

蓮草直胸跳甲作為防治惡性入侵雜草喜旱蓮 子草的專食性天敵昆蟲，嗅覺在其定位識別寄主植 物的過程中起到了關(guān)鍵性的作用。因此，本試驗(yàn)擬 探究連草直胸跳甲基于 OBPs 所介導(dǎo)的嗅覺識別 機(jī)制。課題組前期通過對蓮草直胸跳甲觸角轉(zhuǎn)錄 組 測 序 鑒 定 得 到 36 個 Minus-C OBPs 和 11 個 Classic OBPs[24] ，但這些基因在其嗅覺識別過程中 行使的具體功能還有待研究。基于此，本試驗(yàn)從鑒 定篩選出的 Classic OBPs 中選取了具有完整開放 閱讀框的 AhygOBP27、AhygOBP32與 AhygOBP44 進(jìn)行克隆和序列分析，并明確它們在雌雄成蟲不同 組織中的表達(dá)模式，為探究 OBP 基因在蓮草直胸 跳甲的嗅覺識別過程中的功能，進(jìn)一步防治喜旱蓮 子草奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蟲源來自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，后長期飼養(yǎng)于山 西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室人工氣候 箱，培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光周期 L∶D=14 h∶ 10 h，相對濕度 85%±5%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蓮草直胸跳甲RNA的提取與cDNA合成 收 集蓮草直胸跳甲雌雄成蟲觸角、頭、胸、腹、足、翅 6 個組織，每個樣品設(shè)置 3 個重復(fù)。將切取的組織 在液氮中研磨成粉，利用 TRIzol 試劑（Takara，中 國）提取總 RNA；取 1 μg 總 RNA 作為模板，用 Re? verse Transcriptase M-MLV（RNase H-）反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑盒（Takara，中國）合成 cDNA 第 1 鏈，保存在 -20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白基因的克隆 利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)克隆引物（表 1），以 1.2.1 合成的蓮草直胸雌蟲觸角 cDNA 為模 板，利用 2×Taq PCR Master（Tiangen，中國）進(jìn)行 全 長 序 列 擴(kuò) 增 。 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 20 μL：2×Taq PCR Master 10 μL，cDNA 1 μL，上 下 游 引 物（10 μM）各 0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 25 s，50 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 2 min，32 個循環(huán)；72 ℃徹底延伸 6 min。 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（Biomed，中 國）進(jìn)行回收后連接到 pMDTM20-T 載體（Takara， 中國）上，轉(zhuǎn)入 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（Takara，中國）中 培養(yǎng)。挑選單菌落進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，將條帶正確的 菌液送至上海生工進(jìn)行測序。

1.2.3 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的生物信息學(xué) 分析 使用NCBI的ORF Finder（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/orffinder）預(yù) 測 目 的 基 因 的 開 放 閱 讀 框 。 利 用 ExPASy-ProtParam（http：//web. expasy. org/protparam/）對兩種氣味結(jié)合蛋白的理化性質(zhì) 進(jìn)行預(yù)測。采用 DNAMAN 9.0 對氣味結(jié)合蛋白的 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，MEGA 7.0 中的鄰接 法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 ，boot? strap 重復(fù) 1 000 次[25] 。

1.2.4 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白基因的組織表 達(dá) 分 析" 以 1.2.1 合 成 cDNA 為 模 板 ，通 過 Bea? conDesign 7.0 設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 引物（表 1）。核 糖體蛋白 L13 基因（Ribosomal Protein L13，RP，基 因登錄號：OQ187814.1）作為內(nèi)參基因，使用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix（東 洋 紡 生 物 科 技）對蓮草直胸跳甲雌雄成蟲各組織進(jìn)行熒光定量 PCR，熒光定量儀器為 ABI7500（美國賽默飛世爾 科技公司）。試驗(yàn)設(shè)置 3 次生物學(xué)重復(fù)與 3 次技術(shù) 重復(fù)。反應(yīng)體系為 20 μL：2×SYBR Mix 10 μL，上 下 游 引 物（10 μmol/L）各 0.8 μL，cDNA 1 μL， ddH2O 7.4 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min； 95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個 循環(huán)；72 ℃徹底延伸 10 min。60～95 ℃進(jìn)行熔解曲 線分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以 OBPs 在 雄 蟲 胸 部 的 表 達(dá) 量 為 基 準(zhǔn) ，采 用 2-??Ct 法計(jì)算 OBP 基因在其它組織中的相對表達(dá) 量。利用 SPSS 22.0 對 OBP 基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)分析，采用 Tukey 法對雌、雄蟲在不同組織的 相對表達(dá)量差異進(jìn)行顯著性分析，采用 t 檢驗(yàn)對同 一組織在雌、雄蟲中的相對表達(dá)量差異進(jìn)行顯著性 分析（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的克隆

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與 目的片段大小一致的條帶（圖 1）。隨后進(jìn)行克隆測 序，測序結(jié)果顯示，AhygOBP27 ORF 長 351 bp，編 碼 116 個 氨 基 酸 ；AhygOBP32 ORF 長 408 bp，編 碼 135 個 氨 基 酸 ；AhygOBP44 ORF 長 423 bp，編 碼 140 個 氨 基 酸 ，登 錄 號 分 別 為 ON260784.1、 ON260785.1 和 OQ606235.1。

2.2 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的理化性質(zhì)分析

理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示（表 2），3 個 OBP 基因 所編碼的蛋白分子量較小，等電點(diǎn)（pI）小于 7，酸性 氨基酸數(shù)目多于堿性氨基酸，屬于酸性蛋白質(zhì)；疏 水/親水性數(shù)值小于零，表現(xiàn)為親水性。因此，3 個 OBP 都屬于分子量較小的酸性可溶性蛋白，與昆 蟲氣味結(jié)合蛋白的特征相符合。

2.3 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的序列分析

序列比對結(jié)果顯示（圖 2），3 個 OBP 的氨基酸 序列中均含有 6 個半胱氨酸殘基，且第 2、3 個半胱 氨酸殘基之間有 3 個其他氨基酸，第 5、6 個半胱氨 酸 殘 基 之 間 有 8 個 其 他 氨 基 酸 ，具 有 Classical OBPs 亞家族蛋白的典型特征。其中 AhygOBP27 與沙蔥螢葉甲 Galeruca daurica GdauOBP 的氨基 酸序列一致性最高，達(dá) 66.7%，與榆藍(lán)葉甲 Pyrrhalta aenescens PaenOBP18 的氨基酸序列一致性次之， 為 55.8%；AhygOBP32 與 大 猿 葉 甲 Colaphellus bowringi CbowOBP17 的 氨 基 酸 序 列 一 致 性 高 達(dá) 74.6%，其 次 就 是 與 榆 藍(lán) 葉 甲 Pyrrhalta aenescens PaenOBP15 序列一致性達(dá) 68.6%；AhygOBP44 與 大猿葉甲 Colaphellus bowringi CbowOBP8 和赤擬 谷 盜 Tribolium castaneum TcasOBP4 的 氨 基 酸 序 列一致性分別為 30.23% 和 27.78%。

2.4 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的進(jìn)化分析

通過對蓮草直胸跳甲 3 個 OBP 與其他 24 種昆 蟲 OBP 相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果 顯 示（圖 3），AhygOBP27 與 沙 蔥 螢 葉 甲 Galeruca daurica、榆藍(lán)葉甲 Pyrrhalta aenescens、黑肩毛胸榆 葉甲 Pyrrhalta maculicollis 的 OBP 遺傳距離較近； AhygOBP32 與桑天牛 Apriona germarii AgerOBP4 遺 傳 距 離 最 近 ；AhygOBP44 與 與 大 猿 葉 甲 Colaphellus bowringi CbowOBP8 遺 傳 距 離 最 近 。 系統(tǒng)發(fā)育樹主要聚類為兩大支，其中 AhygOBP27 與 AhygOBP44 聚類為同一大支，而 AhygOBP32 單 獨(dú)成支。因此推測，AhygOBP32可能與AhygOBP27 和 AhygOBP44 行使的功能不同。

2.5 蓮草直胸跳甲氣味結(jié)合蛋白的組織表達(dá)分析

AhygOBP27 在 雌 雄 成 蟲 的 各 組 織 中 均 有 表 達(dá)，從高到低依次為觸角、足、頭、翅、胸和腹（圖 4- A）。其中 AhygOBP27 在雄蟲觸角中的相對表達(dá) 量 分 別 是 頭 、胸 、腹 、足 、翅 的 6.63 倍 、105.49 倍 、 66.35 倍、2.86 倍和 13.66 倍，在雌蟲觸角中的相對 表達(dá)量分別是頭、胸、腹、足、翅的 13.35倍、202.89倍、 795.32 倍、8.23 倍和 26.80 倍。此外，AhygOBP27 在雌蟲觸角中的相對表達(dá)量極顯著高于雄蟲觸角 （Plt;0.01），約為雄蟲觸角的 1.65 倍。

AhygOBP32 主要是在雌雄成蟲的觸角、足、翅 以及雄蟲的頭中表達(dá)，其他組織中幾乎不表達(dá)（圖 4-B）。在雄蟲中，AhygOBP32 的相對表達(dá)量從高 到低依次為觸角、頭、足、翅、腹和胸，其中AhygOBP32 在 觸 角 的 相 對 表 達(dá) 量 顯 著 高 于 其 他 組 織（Plt; 0.05），分別是頭、足和翅的 231.41 倍、3 752.61 倍和 4 384.72倍。在雌蟲中，AhygOBP32的相對表達(dá)量從 高到低依次為觸角、足、翅、頭、胸和腹，AhygOBP32在 觸 角 中 的 相 對 表 達(dá) 量 也 顯 著 高 于 足 和 翅（Plt; 0.05）。此外，AhygOBP32 在雄蟲觸角中的相對表 達(dá)量極顯著高于雌蟲（Plt;0.01）。

AhygOBP44 在雌雄成蟲各組織中表達(dá)規(guī)律一 致，從高到低依次為觸角、足、頭、腹、翅、胸（圖 4-C）。 在雌蟲中，AhygOBP44 在觸角中的表達(dá)量分別是 頭、胸、腹、足、翅的 19.14 倍、3 987.23 倍、957.17 倍、 5.91 倍和 1 338.24 倍；在雄蟲中，AhygOBP44 在觸 角中的表達(dá)量分別是頭、胸、腹、足、翅的 3.24 倍、 2 002.32倍、296.17倍、2.38倍和 3 492.53倍。此外， AhygOBP44 在雌蟲觸角中的相對表達(dá)量極顯著高 于雄蟲觸角（Plt;0.01），約為雄蟲觸角的 3.83 倍。 因此，蓮草直胸跳甲這 3 個 OBP 基因均在雌雄 成蟲的觸角中高表達(dá)，且AhygOBP27與AhygOBP44 更偏向于在雌蟲中表達(dá)，AhygOBP32 更偏向于在 雄蟲中表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

在昆蟲嗅覺感知過程中，OBPs 作為最先發(fā)揮 功能的關(guān)鍵組分，與環(huán)境中的脂溶性氣味分子相互 作用，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至化學(xué)受體神經(jīng)元，激活樹突膜 表面分布的嗅覺受體，是嗅覺系統(tǒng)正常運(yùn)行的必 須蛋白[26] 。根據(jù)昆蟲 OBPs 序列中保守氨基酸的數(shù) 量 可 分 為 Classical OBPs、Minus-C OBPs、Dimer OBPs 和 Plus-C OBPs[27] 。研究表明，昆蟲 OBPs 會 朝著產(chǎn)生更多二硫鍵，空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的方向進(jìn) 化，以適應(yīng)感受特殊氣味物質(zhì)的嗅覺需求[28] ，因此， 與 Minus-C OBPs 相比 Classic OBPs 更多地存在于 較為進(jìn)化的物種中[29] 。本試驗(yàn)基于蓮草直胸跳甲 觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中選取了 3 個具有完整開放讀框的 Classic OBPs 進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分 析。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，這 3 個 OBP 都與葉甲科的 昆蟲 OBP 序列一致性較高，在進(jìn)化關(guān)系上更加同 源，可能行使相似功能。葉甲科中與 AhygOBP27 和 AhygOBP44 聚 為 同 一 大 支 的 沙 蔥 螢 葉 甲 GdauOBP15 在 雌 性 尋 找 寄 主 植 物 中 發(fā) 揮 更 重 要 的作用[30] ，花絨寄甲 DhelOBP21 參與了識別植物 揮 發(fā) 物 β -蒎 烯[31] ；與 AhygOBP32 聚 為 同 一 支 的 GdauOBP20 被證實(shí)參與定位寄主植物[32] 。因此， 推測 AhygOBP27 與 AhygOBP44 可能起識別寄主 揮發(fā)物的作用，AhygOBP32 與定位寄主植物相關(guān)。 觸角是昆蟲重要的化學(xué)感受器官之一，在嗅覺 感受中行使重要功能。在觸角中特異性或高表達(dá) 的氣味結(jié)合蛋白一般都與嗅覺識別相關(guān)，如苜蓿盲 蝽（Adelphocoris lineolatus）幾 乎 只 在 觸 角 中 表 達(dá) 的 AlinOBP1 參與了感知性信息素的過程[33] ；薇甘 菊頸盲蝽（Pachypeltis micranthus PmicOBP4）在觸 角中高表達(dá)，其在嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[34] 。

本研究中，蓮草直胸跳甲 3 個 OBP 基因在雌雄成蟲 觸角中的表達(dá)量顯著高于其他組織，推測它們在蓮 草直胸跳甲的嗅覺識別過程中發(fā)揮重要作用。此 外，在頭、胸、腹、足和翅等其他部位中表達(dá)的 OBP 可能參與感知味覺配體或其他代謝過程，如黑腹果 蠅（Drosophila melanogaster DmelOBP49）在 成 蟲 頭部高度表達(dá)，參與了對苦味劑的識別[35] ；綠盲蝽 （Apolygus lucorμm）在 足 中 高 表 達(dá) 的 AlucOBP38 參與了對寄主次級代謝產(chǎn)物的識別[36] 。這 3 個 OBP 基因在頭、足和翅中也有表達(dá)，因此，推測它們可能 具有上述功能。

當(dāng)然，OBP 在雌雄成蟲中也存在差異表達(dá)，這 與其在生命活動中行使不同的功能密切相關(guān)。例 如，黃脛小車蝗（Oedaleus infernalis Saussure）在雄 蟲頭部高表達(dá)的 OinfOBP2 與發(fā)覺和辨別性信息 素 有 關(guān)[35] ；梨 小 食 心 蟲（Grapholita molesta）在 雌 蟲 觸 角 中 高 表 達(dá) 的 GmolOBP3 與 尋 找 寄 主 植 物 和 雌 蟲產(chǎn)卵地相關(guān)[36] 。本研究中，AhygOBP27 與 AhygOBP44 在雌蟲觸角中的表達(dá)水平顯著高于 雄 蟲 ，AhygOBP32 在 雄 蟲 觸 角 和 頭 部 中 的 表 達(dá) 水 平 顯 著 高 于 雌 蟲 。 因 此 ，推 測 AhygOBP27 與 AhygOBP44 可能與識別寄主植物揮發(fā)物和尋找產(chǎn) 卵點(diǎn)相關(guān)，AhygOBP32 可能參與感受雌蟲信息素、 尋找配偶等生命活動。本試驗(yàn)通過對蓮草直胸跳 甲 3 個 OBP 基因進(jìn)行克隆、系統(tǒng)進(jìn)化和組織表達(dá)分 析，初步了解它們在蓮草直胸跳甲嗅覺識別過程中 發(fā)揮的作用，為提高喜旱蓮子草的防治效率提供了 新思路。后續(xù)還會利用 RNA 干擾、熒光競爭試驗(yàn) 等技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證它們的功能。

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