半固體培養法制備非洲豬瘟病毒pA104R蛋白的單克隆抗體

劉蓓蓓 韋艷娜 陳蓉 謝星 倪博 郝飛 張珍珍 白昀 袁廳 馮志新

摘要：為了快速、高效制備非洲豬瘟病毒（ASFV）單克隆抗體，本研究通過大腸桿菌系統表達并純化了ASFV重組蛋白pA104R。以ASFV重組蛋白pA104R為抗原，分別比較了CpG ODN聯合氫氧化鋁佐劑和常規弗氏佐劑兩種免疫策略，并重點比較半固體培養法和常規有限稀釋法來制備ASFV pA104R單克隆抗體的效率。結果顯示，本研究獲得了相對分子質量為3.5×104的ASFV重組可溶性蛋白pA104R，通過其與CpG ODN聯合氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，在第21 d即可達到融合要求，本試驗方法（重組蛋白pA104R與CpG ODN聯合氫氧化鋁佐劑免疫）較重組蛋白pA104R與常規弗氏佐劑免疫節省14 d時間。通過半固體培養法篩選單克隆的試驗周期比有限稀釋法縮短28 d，并減少了亞克隆的工作量。半固體培養法獲得5株陽性雜交瘤細胞，挑選效價較高的3株（9A4、9H6、11F5）進行鑒定，重鏈均為IgG，輕鏈均為KAPPA。純化后的3株單克隆抗體針對pA104蛋白和全病毒蛋白質的效價分別達1∶160 000～1∶320 000和1∶200～1∶400。本研究優選了CpG ODN聯合氫氧化鋁佐劑結合半固體培養法篩選pA104R的單克隆抗體，為單克隆抗體制備提供了快速高效的新策略。

關鍵詞：非洲豬瘟病毒；pA104蛋白；單克隆抗體；半固體培養法

中圖分類號：S852.65+1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0682-08

Preparation of monoclonal antibody against pA104R protein of African swine fever virus by semi-solid culture method

LIU Bei-bei1，2，WEI Yan-na1，2，CHEN Rong1，2，XIE Xing1，2，NI Bo1，2，HAO Fei1，2，ZHANG Zhen-zhen1，2，BAI Yun1，2，YUAN Ting1，2，FENG Zhi-xin1，2

（1. Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Enginering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China；2.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China）

Abstract：In order to prepare the monoclonal antibodies against African swine fever virus （ASFV） rapidly and efficiently， the recombinant pA104R protein of ASFV was systematically expressed and purified by Escherichia coli in this study. The recombinant pA104R protein of ASFV was used as antigen to compare the two immune strategies of CpG ODN combined with aluminum hydroxide adjuvant and conventional Freunds adjuvant， respectively， and the efficiency of semi-solid culture method and conventional limited dilution method in the preparation of monoclonal antibody against ASFV pA104R was compared. The results showed that the recombinant pA104R soluble protein of ASFV with a relative molecular weight of 3.5×104 was obtained， and the fusion requirement was achieved on the 21st day after the mice were immunized with CpG ODN and aluminum hydroxide adjuvant. Compared with routine Freunds adjuvant immunization and recombinant pA104R protein， CpG ODN combined with aluminum hydroxide adjuvant and semi-solid culture method in this experiment saved 14 days. The semi-solid culture method shortened the test period of monoclonal screening by 28 days compared with the limited dilution method， and saved a lot of subclonal workload. Five positive hybridoma cell lines were obtained by semi-solid culture method， and three high titer hybridoma cell lines （9A4， 9H6， 11F5） were selected for identification. The heavy chain was IgG， and the light chain was KAPPA. The titers of three purified monoclonal antibodies against pA104 protein and whole virus protein were 1∶160 000-1∶320 000 and 1∶200-1∶400， respectively. In this study， monoclonal antibodies were screened by CpG combined with aluminum hydroxide adjuvant and semi-solid culture method， providing a new rapid and efficient strategy for monoclonal antibody preparation.

Key words：African swine fever virus；pA104 protein；monoclonal antibody；semi-solid medium method

非洲豬瘟（African swine fever， ASF）是一種由ASF病毒（ASFV）引起的一種急性烈性傳染病，是對養豬業具有威脅性的一種疾病，致死率近100%[1]。該病首次報道于1921年肯尼亞，隨后陸續在全球各地暴發，曾在非洲、歐洲和美洲等數十個國家流行。2018年傳入中國沈陽，短短數月席卷全國，對中國養豬業造成毀滅性打擊[2]。

ASF疫情快速蔓延，其中一個原因就是缺乏快速高效的現場診斷產品，因此針對ASFV的特異蛋白制備單克隆抗體對于開發ASFV檢測試劑盒至關重要。ASFV是一種線狀、二十面體帶囊膜的雙鏈DNA病毒，病毒結構復雜[3-4]。病毒基因組長170～190 kb，含有150～170個開放閱讀框[5]，其中ORFA104R編碼了一種類組蛋白（pA104R），高度保守，pA104R是唯一由病毒編碼的類組蛋白[6-8]。ASFV包括基因組和核蛋白，pA104R是發揮主要功能的核蛋白，主要出現在感染后期，有很好的免疫反應性，是IgM和IgG抗體反應性較好的靶標蛋白[9]。有研究結果顯示，無癥狀豬的抗體反應要高于慢性感染的豬，并且在細胞水平上敲低pA104R基因，ASFV的核酸拷貝量會顯著降低，由此，針對pA104R蛋白的抗體可能有效免疫ASFV[6，9]；二苯乙烯衍生物SD1和SD4可以劑量依賴性的方式阻斷pA104R蛋白與DNA結合，抑制ASFV在豬肺泡巨噬細胞（PAM）中復制，提示pA104R蛋白在ASFV復制過程中具有重要作用，pA104R蛋白可用于制備ASFV疫苗[10]。

免疫佐劑，又被稱為非特異性免疫增生劑，如氫氧化鋁、明礬、礦物油、脂多糖、CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide）等，其與抗原同時注射到機體可增強免疫原性或改變免疫反應類型。CpG ODN是在含鳥嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）的二核苷酸序列（CpG）的基礎上，經非甲基化修飾后的寡聚脫氧核苷酸鏈。20世紀80年代，Tokunaga[11]發現結核分枝桿菌的DNA具有抗腫瘤作用，可升高NK活性進而誘導Ⅰ型和Ⅱ型干擾素產生。之后1995年發現具有抗腫瘤作用DNA中所含的非甲基化CpG基序的結構和其免疫刺激特性密切相關[12]，上述研究結果表明CpG ODN能夠增強免疫細胞的增值，誘導其分泌多種細胞因子[13-14]，和鋁佐劑聯合應用可以延長其在體內的作用時間[15].

自1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體制備技術問世，單克隆抗體在人類和動物疾病的診斷、治療領域發揮了重要作用。目前很多實驗室制備單克隆抗體的方法仍然是傳統的有限稀釋法，耗時較長，工作量較大，且不分泌抗體的雜交瘤細胞，影響陽性雜交瘤細胞生長甚至死亡導致陽性克隆丟失，通過甲基纖維素半固體培養法篩選單個克隆，一步即可完成單克隆，無需進行多次亞克隆，相比較有限稀釋法，縮短試驗周期，可大量節約試驗成本[16-17]。

本研究對非洲豬瘟病毒核蛋白pA104R進行可溶性表達，以pA104R蛋白為抗原，弗氏佐劑和CpG ODN氫氧化鋁混合佐劑分別為佐劑免疫4～6周齡BALB/c小鼠，并利用有限稀釋法和半固體培養基法制備單克隆抗體，建立起較為快速高效的單克隆抗體制備方法。為后期針對ASFV抗原抗體的檢測提供重要生物材料。

1材料與方法

1.1主要試驗材料

小鼠骨髓瘤細胞（SP2/0）、PET-32a、 Escherichia coli（E.coli） strain BL21（DE3）-pLysS感受態均由本實驗室保存；4～6周齡雌性BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

CpG ODN1826（CpG oligodeoxynucleotide1826）、氫氧化鋁購自Invivo公司；弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant）、弗氏不完全佐劑（Freunds incomplete adjuvant）購自Merck公司；HAT、HT、聚乙二醇（PEG4000）選擇培養液添加劑購自Merck公司；半固體培養基購自Molecular Devices公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；Talon填料購自美國Cytiva公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG）購自武漢博士德生物工程公司；ELC顯色液購自Thermo Fisher Scientific公司；亞型鑒定試劑盒購自Thermo Scientific公司。滅活的ASFV全病毒抗原以及滅活的ASFV陽性血清由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。

1.2表達菌株的構建

從GenBank中獲得ASFV ChinaPig/HLJ/2018株pA104R基因序列（GenBank登錄號：MK333180.1），以該基因序列為模板，用優化軟件（http：/www.jcat.de/）對密碼子優化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pA104R全基因序列，基因長312 bp，編碼104個氨基酸，編碼的蛋白質相對分子質量為1.15×104。將該基因連接至pET-32a（+）載體，插入酶切位點Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ，構建成pET-32a（+）-pA104R重組表達質粒。將重組質粒pET-32a（+）-pA104R轉化至感受態細胞BL21（DE3），挑單菌落接種于添加60 μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑單菌落接種于LB培養基中，37 ℃振蕩培養10 h以上，即為重組pA104R的表達菌株pET-32a（+）-A104R E.coliBL21（DE3）。

1.3重組蛋白的表達和純化鑒定

按1∶100將重組pA104R的表達菌株pET-32a（+）-A104R E.coliBL21（DE3）接種至LB培養基中，當菌液OD600達到0.8時，加入IPTG溶液（終濃度0.4 mmol/L），18 ℃恒溫誘導過夜，第2 d收集菌體，超聲波裂解后10 000 g離心10 min，分別收集上清液和沉淀，上清液用0.45 μm濾器過濾。用基礎緩沖液洗Talon純化柱（緩沖液：30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0， 300 mmol/L NaCl，20 mmol/L的咪唑，2%甘油）。將過濾后的含有重組蛋白pA104R的上清液全部加入Talon柱進行充分掛柱，先用基礎緩沖液沖洗未掛柱的雜蛋白，再分別用含50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L和400 mmol/L咪唑的洗脫液梯度洗脫，收集洗脫液。測定收集到的洗脫液的蛋白質濃度，進行SDS-PAGE電泳。隨后用分子篩層析分離Talon柱上洗脫下來的蛋白質，進行下一步的純化，最后將重組蛋白pA104R超濾濃縮，使其質量濃度在2 mg/ml以上。參照實驗室前期關于P10蛋白的純化與鑒定方法[18]，對pA104R蛋白進行鑒定。重組蛋白pA104R經SDS-PAGE電泳，用PVDF膜進行轉印，37 ℃封閉2 h。一抗為1∶200的ASFV陽性血清，37 ℃孵育2 h，二抗為1∶10 000稀釋的羊抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育2 h。最后用ECL顯色液曝光檢測。

1.4動物免疫和血清效價檢測

將重組蛋白pA104R作為抗原，免疫佐劑分2組，CpG和氫氧化鋁混合佐劑（100 μl氫氧化鋁溶解10 μg CpG佐劑）組和弗氏佐劑組，免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠。CpG和氫氧化鋁混合佐劑采取腹腔免疫方式，采用100 μg抗原+100 μl混合佐劑，每7 d用混合佐劑免疫1次，共免疫4次，在第3次免疫后7 d（第1次免疫后21 d）眼眶采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測小鼠抗體水平。選取血清效價＞1×105的小鼠脾細胞和SP2/0細胞進行融合，在細胞融合開始前3 d用不加佐劑的pA104R重組蛋白加強免疫小鼠（每只50 μg）。弗氏佐劑組采用皮下注射免疫，第1次用弗氏完全佐劑和等量的pA104R蛋白進行皮下多點注射免疫，每隔14 d再用弗氏不完全佐劑和等量的pA104R蛋白加強免疫，第3次免疫后7 d（第1次免疫后35 d）眼眶采血，分離血清，間接ELISA方法檢測小鼠抗體分泌水平。具體方法如下：用包被液（pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）將純化后的pA104R蛋白和ASFV全病毒蛋白2.5 μg/ml包被ELISA酶標板，每孔100 μl，4 ℃過夜，封閉液37 ℃封閉2 h，加入連續10倍稀釋的待檢小鼠血清，同時以陽性豬血清作為陽性對照，未免疫的小鼠血清作為陰性對照，37 ℃孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（1∶10 000），每孔100 μl，37 ℃孵育0.5 h，TMB顯色液避光顯色10 min，用2 mol/L H2SO4終止反應，每孔50 μl，測定OD450值，Cut-off值為陰性血清平均值的2.1倍，設定OD450值＞Cut-off值為陽性，取待檢血清對應的最高稀釋度作為血清的效價。

1.5陽性雜交瘤細胞株的篩選和鑒定

融合前7 d，將SP2/0細胞復蘇并擴大培養，融合前3 d以不加佐劑的重組pA104R蛋白為抗原加強免疫1次。融合時，將小鼠腹腔打開，摘出脾臟研磨后過濾，收集脾細胞，將小鼠脾細胞和SP2/0細胞5∶1融合，利用PEG法制備雜交瘤細胞。半固體培養方法：將融合后的細胞接種至恢復培養基中，置于37 ℃溫箱中培養過夜。第2 d離心后接種至半固體培養基中，置于37 ℃溫箱中靜置培養。7～10 d形成肉眼可見的克隆團，將單個克隆團移至完全培養基中繼續培養擴增，在細胞長至孔底面積的1/4～1/2時即可篩選，篩選到的陽性雜交瘤細胞克隆純化1次，利用間接ELISA方法確認雜交瘤細胞株的陽性率為100%。有限稀釋培養方法：在融合的前1 d準備飼養細胞，將陰性小鼠處死且表面消毒后固定好，剪開并掀起腹部皮膚暴露腹膜，用注射器注射5 ml不完全培養基至腹腔內，輕柔按摩腹膜后將培養基吸出離心，將細胞調整至1 ml 2×105個1 000 μl/孔接入96孔板內，即為飼養細胞。將PEG融合后的細胞按每孔100 μl接入已接種過飼養細胞的培養板內置于37 ℃含5%二氧化碳的培養箱內培養。5 d后換出1/2的HAT培養基，7～10 d后全部換成HT培養基。當孔底的細胞長至孔底面積的1/4時即可吸出上清液進行檢測。對陽性細胞株進行2次檢測，去除假陽性和分泌不穩定的細胞，再對剩余的陽性細胞進行3次亞克隆，每次亞克隆前準備飼養細胞。將3次克隆純化后篩選的細胞進行擴大培養并凍存，收集細胞上清液，按單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書操作，取800 μl雜交瘤細胞上清液加入檢測孔中進行檢測。

1.6單克隆抗體的鑒定

利用Western blot方法分別將ASFV重組蛋白pET-32a（+）-pA104R和pET-32a空載體轉化大腸桿菌然后用IPTG誘導出的全菌蛋白經SDS-PAGE 電泳分離，用半干式轉印方法轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。小鼠腹水1∶5 000稀釋作為一抗分別孵育ASFV重組蛋白 pA104R和pET-32a空載體轉化大腸桿菌后誘導出的全菌蛋白質，37 ℃孵育2 h。以1∶10 000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG為二抗37 ℃孵育1 h。加入ECL避光顯色至條帶出現，拍照。

1.7單抗腹水的制備純化與效價測定

每只經產母鼠腹腔注射0.5 ml滅菌液體石蠟，7～10 d后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞。5～7 d后觀察到小鼠腹部開始隆起，收集腹水，5 000 r/min離心10 min，取上清液，56 ℃水浴滅活腹水中的蛋白質水解酶，待溫度降至室溫后保存于-20 ℃備用。

將收集的腹水按辛酸-硫酸銨方法提取腹水中的IgG抗體，并透析24 h以上保證除去其中的硫酸銨。ASFV全病毒蛋白和ASFV重組蛋白pA104R包被的酶標板用材料與方法1.4中的ELISA方法測定效價。

2結果與討論

2.1重組蛋白pA104R的表達

收集陽性菌液進行IPTG小量誘導表達（終濃度0.4 mmol/L），并設置未誘導菌液為陰性對照，18 ℃ 180 r/min誘導12 h后進行超聲波破碎，收集上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE鑒定。在表達菌裂解后的上清液和沉淀中均能檢測到重組蛋白pA104R，表明pA104R是可溶性蛋白（圖1A）。與未誘導菌液相比較，誘導后的菌株[pET-32a（+）-pA104R E.coli BL21（DE3）]可以成功表達出重組蛋白pA104R，相對分子質量為3.5×104。表明重組pA104R表達菌株pET-32a（+）-pA104R E.coli BL21（DE3）能表達pA104R，且上清液和沉淀中均可檢測到。

2.2pA104的原核表達、純化和鑒定

重組蛋白pA104R采用Talon親和層析柱進行純化，用20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L和400 mmol/L濃度咪唑洗脫pA104R蛋白，結果發現pA104R主要在50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑中被洗脫（圖1B），隨后用分子篩層析分離Talon柱上洗脫下來的蛋白質，進行下一步的純化，通過軟件Image J分析重組蛋白pA104R的純度，純度大約為85%（圖1C）。經免疫印跡Western blot分析，表明重組蛋白pA104R能與ASFV陽性血清發生反應（圖1D），說明表達的重組蛋白pA104R具有良好的免疫原性。

2.3融合前小鼠效價檢測

采用材料與方法1.4中的方法免疫小鼠，利用ELISA方法分別對弗氏佐劑組在第1次免疫后21 d（第2次免疫后7 d）、第1次免疫后35（第3次免疫后7 d）、第1次免疫后42 d（第3次免疫后14 d）和CpG聯合氫氧化鋁佐劑組第1次免疫后14 d（第2次免疫后7 d）、第1次免疫后21 d（第3次免疫后7 d）、第1次免疫后35 d（第4次免疫后14 d）檢測小鼠抗體水平，本研究將不同時間點采集的小鼠血清按1∶100 000倍稀釋后進行抗體檢測，結果顯示弗氏佐劑組需在第1次免疫后42 d小鼠抗體才達到1∶100 000以上（圖2A），而CpG聯合氫氧化鋁佐劑組小鼠抗體在第1次免疫后21 d即可達到1∶100 000以上（圖2B），比弗氏佐劑組早21 d。在總免疫程序上CpG聯合氫氧化鋁佐劑免疫組在第1次免疫后28 d小鼠脾細胞和SP2/0細胞開始融合，比弗氏佐劑免疫組（第1次免疫后42 d小鼠脾細胞和SP2/0細胞融合）縮短14 d。

2.4陽性雜交瘤細胞株的篩選及鑒定

在融合后7 d，半固體培養基法培養的克隆團大小肉眼可見（圖3）。吸取單個克隆接種于含有完全培養基的96孔板內，3 d后培養基顏色由橙紅色變成橘黃色或黃色吸取上清液進行ELISA檢測。有限稀釋法在7 d換成HT培養液，2 d后營養液由橙紅色變成橘黃色或黃色，此時吸取上清液進行ELISA檢測。通過間接ELISA方法共篩選到9株雜交瘤細胞株，其中有限稀釋法篩選到4株，半固體培養基法篩選到5株。共挑選效價較高的3株（均來自半固體培養法）進行亞型鑒定，結果顯示3株雜交瘤細胞株重鏈均為IgG，輕鏈均為KAPPA。對這3株雜交瘤細胞上清液進行Western blot檢測，結果顯示，從這3株雜交瘤細胞分別獲得的單克隆抗體9H6、9A4、11F5均能特異性地識別pA104R蛋白（圖4）。

2.5小鼠腹水制備及效價測定

將3株雜交瘤細胞分別注射至提前注射了液體石蠟的小鼠腹腔內，使小鼠產生腹水，收集腹水進行效價檢測。9A4細胞株針對pA104R效價為1∶320 000，針對ASFV全病毒蛋白質效價為1∶200，9H6和11F5細胞株針對pA104R效價為1∶160 000，針對ASFV全病毒蛋白質效價為1∶400。

2.6有限稀釋法和半固體培養法的比較

有限稀釋法和半固體培養法相比較，半固體培養法在節省時間上優勢明顯，整個試驗周期比有限稀釋法縮短28 d；有限稀釋法在亞克隆過程中需要飼養細胞，且需要3次亞克隆，步驟繁瑣，半固體法不需要飼養細胞，僅需要1次亞克隆（表1），其中半固體法的亞克隆方法同有限稀釋法，目的是鑒定克隆團的純度。

3討論

單克隆抗體在人類和動物的疾病診斷、治療領域發揮了重要作用。目前很多實驗室制備單克隆抗體使用的方法仍然是傳統的有限稀釋法，亞克隆工作量大，想得到很純的單克隆需要進行至少3次的亞克隆，而3次亞克隆至少需要20～30 d，使用5～10塊96孔板進行ELISA檢測，耗時較長，工作量較大。更為重要的是，生長較快的細胞一般是不分泌抗體的，它的快速生長影響陽性雜交瘤細胞的生長進而導致陽性克隆可能丟失。早在1991年國內就有報道，利用甲基纖維素制備半固體培養基，成功培養細胞集落而篩選出單抗細胞株[19]。采用半固體培養基篩選單個克隆團，相互不混雜，每個克隆團都是獨立生長于半固體培養基上，彼此之間不連接，在顯微鏡下挑選克隆團時同時吸取兩個克隆團的幾率很小，保證了每個克隆團的純度。每融合1只小鼠，則可以得到幾百上千個克隆團，大量的克隆團可增加篩選到高質量克隆團的概率，也可避免陽性克隆團因生長緩慢而被陰性克隆團覆蓋導致陽性克隆團丟失的可能，無需進行多次亞克隆，可縮短約一半試驗時間，節省培養基血清的消耗，可大量節約人力物力，降低試驗成本[16，20]。半固體培養基法也會出現假陽性，在將克隆團轉移至96孔板中培養后第1次檢測中可能會出現很多假陽性，在經過2～3次傳代后檢測得到的陽性克隆即為穩定的陽性雜交瘤細胞株，將得到的陽性雜交瘤細胞株連續培養10代仍然可以穩定分泌抗體，這一過程可淘汰掉抗體分泌不穩定的細胞株。本實驗室總結分析多次制備單克隆抗體的數據，在抗體效價方面，有限稀釋法和半固體培養法未見明顯區別，因半固體培養法試驗進程較快，遂本試驗鑒定所用的3株雜交瘤細胞株均來自半固體法。

免疫佐劑作為1種增強劑在疫苗的研發和生產中發揮了至關重要的作用。不同的佐劑在動物體內可以產生不同的影響，選擇合適的佐劑對提高免疫效果有促進作用。CpG ODN是人工合成的有免疫刺激活性的DNA序列，它有和細菌DNA類似的免疫刺激作用，具有促進Th1免疫應答的特點，已在動物臨床研究中被證明其具有免疫活性，能誘導宿主產生細胞免疫和體液免疫應答，增強機體的免疫應答[21]。CpG ODN佐劑與氫氧化鋁聯合使用，可明顯增強機體的免疫應答，產生高濃度的抗體[22]。而不同類型的CpG ODN佐劑效應也有一定的差異，例如GTCGTT對人淋巴細胞具有良好的刺激活性，是人敏感基序；GACGTT對鼠淋巴細胞有較好的刺激活性，是鼠敏感基序[23-24]，CpG ODN1826是小鼠的最佳免疫佐劑。CpG ODN可通過化學方法大量合成，以凍干粉形式保存，狀態穩定便于運輸，且具有易于質量控制，成本低等特點被廣泛關注和研究，其在腫瘤和傳染病等領域具有潛在的應用價值，在人藥和疫苗研發中被廣泛應用，例如乙肝疫苗等[25]。本研究以ASFV重組pA104R蛋白為抗原，CpG ODN聯合氫氧化鋁為佐劑免疫小鼠，全程免疫時間28 d即可結束，而使用傳統弗氏佐劑需要42 d的免疫時間，可節省14 d免疫時間。

本研究分別使用CpG ODN聯合氫氧化鋁免疫佐劑和ASFV pA104R蛋白、弗氏佐劑和ASFV pA104R蛋白免疫小鼠，通過半固體培養法和有限稀釋法共得到9株陽性雜交瘤細胞，對其中的3株進行鑒定，均能和ASFV全病毒蛋白以及pA104R蛋白發生特異性反應。雖已有研究制備了ASFV pA104R蛋白的單克隆抗體，但其使用的佐劑為傳統的弗氏佐劑，且使用傳統有限稀釋法制備單抗[26]。相比于先前的報道，本研究獲得的單克隆抗體9A4、11F5、9H6效價高，制備周期短，可節約大量的試驗成本。本研究結果為ASFV pA104R蛋白功能鑒定和ASFV血清學診斷方法的建立奠定了重要基礎，還為單克隆抗體制備提供了新的策略。

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（責任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-03-30

基金項目：國家重點研發計劃政府間國際科技創新合作重點專項（2019YFE0107300）；江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（22）2037]

作者簡介：劉蓓蓓（1989-），女，江蘇徐州人，本科，助理研究員，主要從事單抗制備研究。（E-mail）liubei2012203@163.com

通訊作者：馮志新，（E-mail）fzxjaas@163.com