基于轉錄組的莖用萵苣抽薹相關差異表達基因分析

武 一 孫雪梅 楊世鵬 譚龍 王麗慧

摘要：為探究影響莖用萵苣抽薹的相關關鍵基因，采用高通量轉錄組測序的方法，研究莖用萵苣產品器官收獲期和抽薹期的差異表達基因。結果表明，莖用萵苣種質資源1號在產品器官收獲期和抽薹期的差異表達基因數量為6 754個，莖用萵苣種質資源3號在產品器官收獲期和抽薹期的差異表達基因數量為5 444個。基因本體（GO）功能富集分析結果表明，差異表達基因主要富集在結合、催化活性、細胞過程、代謝過程、細胞解剖實體等GO條目中。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結果表明，莖用萵苣種質資源1號和莖用萵苣種質資源3號分別有133條和129條KEGG代謝通路，其中有128條代謝通路在2份種質資源中均被注釋；差異表達基因富集較多的KEGG代謝通路有次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉導、植物-病原體的相互作用等。轉錄因子分析結果表明，莖用萵苣產品器官收獲期和抽薹期的差異表達基因大多數屬于AP2/ERF、bHLH、bZIP、C2H2、MYB、NAC、WRKY等轉錄因子家族。對莖用萵苣產品器官收獲期和抽薹期差異表達基因的研究結果進行綜合分析，發現在AP2/ERF、WRKY、bHLH等轉錄因子家族以及次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉導等通路中存在較多的差異表達基因，推測這些轉錄因子家族和代謝通路可能參與莖用萵苣抽薹的調控網絡。本研究結果為解析莖用萵苣抽薹相關基因及其分子機制奠定了基礎。

關鍵詞：莖用萵苣；抽薹；轉錄組；差異表達基因

中圖分類號：S636.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0711-10

Analysis of differentially expressed genes related to bolting in stem lettuce based on transcriptome data

WU Yi，SUN Xue-mei，YANG Shi-peng，TAN Long，WANG Li-hui

（Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University， Qinghai Key Laboratory of Vegetable Genetics and Physiology， Xining 810016， China）

Abstract：To explore the key genes influencing bolting in stem lettuce， high-throughput transcriptome sequencing was employed to study the differentially expressed genes during the organ harvesting and bolting periods of stem lettuce. The results revealed that there were 6 754 differentially expressed genes in stem lettuce germplasm resource No.1 during the organ harvesting period and bolting period， while stem lettuce germplasm resource No.3 had 5 444 differentially expressed genes during these periods. Gene ontology （GO） functional enrichment analysis indicated that differentially expressed genes were mainly enriched in GO entries such as binding， catalytic activity， cellular processes， metabolic processes， and cellular anatomical entities. Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis showed that stem lettuce germplasm resource No.1 and stem lettuce germplasm resource No.3 had 133 and 129 KEGG metabolic pathways respectively， with 128 metabolic pathways annotated in both germplasm resources. KEGG metabolic pathways with a relatively higher enrichment of differentially expressed genes included biosynthesis of secondary metabolites， plant hormone signal transduction， and plant-pathogen interactions. Transcription factor analysis revealed that most of the differentially expressed genes during the organ harvesting and bolting periods of stem lettuce belonged to transcription factor families such as AP2/ERF， bHLH， bZIP， C2H2， MYB， NAC and WRKY. Comprehensive analysis results indicated that there were numerous differentially expressed genes in transcription factor families such as AP2/ERF， WRKY， bHLH， as well as pathways involving biosynthesis of secondary metabolites and plant hormone signal transduction. It was speculated that these transcription factor families and metabolic pathways could participate in the regulatory network of bolting in stem lettuce. These results can provide scientific basis for understanding the genes related to bolting in stem lettuce and their molecular mechanisms.

Key words：stem lettuce;bolting;transcriptome;differentially expressed genes

莖用萵苣（Lactuca sativa L.）屬于菊科萵苣屬，又稱萵筍、萵菜等，是一年或二年生草本植物[1]，在中國許多地區均有種植。莖用萵苣中含有豐富的礦物質，其中的鐵元素（莖用萵苣肉質莖中鐵元素的含量為20.00 mg/kg；白菜中鐵元素的含量為5.39 mg/kg；蘿卜中鐵元素的含量為5.00 mg/kg）可以被人體吸收利用，防治缺鐵性貧血；鉀元素（莖用萵苣肉質莖中鉀元素的含量為3 186.00 mg/kg；白菜中鉀元素的含量為1 593.00 mg/kg；蘿卜中鉀元素的含量為1 730.00 mg/kg）可用于降血壓和預防心律紊亂；胡蘿卜素（莖用萵苣肉質莖中胡蘿卜素的含量為0.30 mg/kg；白菜中胡蘿卜素的含量為0.60 mg/kg；蘿卜中胡蘿卜素的含量為0.20 g/kg）可用于防癌和抗衰老[2-5]。Hou等[6]對萵苣的化學成分進行研究，發現其主要包含三萜、黃酮和倍半萜內酯等。戴國輝等[7]研究發現，莖用萵苣的肉質莖和葉片中均含有山萵苣苦素、萵苣黃質等多種化合物。

莖用萵苣作為一種營養豐富、口感較好的蔬菜，深受各類人群的喜愛，市場需求量也越來越大。然而，由于受到外界生長環境和品種自身特點的影響，莖用萵苣在種植過程中容易出現早抽薹現象，導致儲存在肉質莖中的養分迅速轉移到花薹中[8]，使肉質莖無法正常生長發育，從而影響產量和質量，降低經濟效益[9]。莖用萵苣的食用部位主要是肉質莖，預防莖用萵苣早抽薹可以確保其產量和質量。

目前，與植物抽薹開花有關的研究大都集中在十字花科作物（如蘿卜[10]、白菜[11]、擬南芥[12]、甘藍型油菜[13]）上，對萵苣[14]抽薹開花的研究較少。LsFT是最早從葉用萵苣中鑒定出來的與開花相關的基因，在葉用萵苣中過表達LsFT基因則使萵苣開花時間提前，沉默LsFT基因則使萵苣開花時間延遲[15]。Ning等[16]對萵苣不同的花發育階段進行研究，發現了1個參與開花的基因LsMADS55。Han等[17]對不同溫度下生長的葉用萵苣進行轉錄組測序分析，挖掘出與抽薹有關的基因LsSOC1和LsFT，敲除這2個基因均會延遲抽薹。Chen等[15]研究發現，赤霉素參與葉用萵苣抽薹的調控，在熱誘導葉用萵苣抽薹期間，葉片中的赤霉3（GA3）、赤霉素4（GA4）水平以及莖中的生長素水平均顯著提高[18]。DELLA蛋白負調節赤霉素信號通路，Wang等[19]在萵苣中鑒定了4個DELLA蛋白編碼基因，包括LsRGL1，在萵苣中敲除該基因可促進抽薹，而該基因過表達可抑制抽薹以及赤霉素和生長素的生物合成。在某些植物中，生長素也可以誘導開花，生長素響應基因受生長素受體基因（TIR1）、生長素響應因子（ARF）家族以及AUX/IAA轉錄因子家族的影響[20]。有研究發現，蛋白質絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（STPK）以及熱激蛋白基因Hsp70-2711和Hsp70-3711可能參與葉用萵苣的抽薹[21-23]。本研究擬以莖用萵苣種質資源1號、3號為試驗材料，于產品器官收獲期和抽薹期分別進行取樣，利用Illumina Hiseq進行轉錄組測序分析，探究影響莖用萵苣抽薹的關鍵基因，以期為培育耐抽薹的莖用萵苣品種奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品為青海大學農林科學院園藝研究所收集的莖用萵苣種質資源1號（綠色莖用萵苣）和3號（紫色莖用萵苣）（表1），種植于青海大學園藝創新基地，常規栽培管理，在不同生育期（產品器官收獲期、抽薹期）選取長勢一致的植株，取葉片和肉質莖混勻，各3個生物學重復，樣品保存于-80 ℃冰箱中，用于總RNA提取。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA文庫的構建和測序使用TRIzol法[24]提取RNA，再參考胡小蓉等[24]的檢測方法對樣品RNA的質量進行檢測，保證后續使用的RNA可以滿足文庫構建和測序的需要。RNA質量達標后，mRNA先使用胸腺嘧啶組成的核苷酸鏈［Oligo（dT）］磁珠富集，再隨機打斷。以隨機打斷的mRNA和隨機寡核苷酸為材料，組成第1條、第2條cDNA，獲得cDNA文庫。文庫構建完成后，先使用Qubit2.0熒光定量儀進行初步定量，再使用Agilent 2100生物分析儀對文庫的插入片段大小進行檢測，插入片段大小符合預期后，使用Illumina HiSeq平臺進行測序。轉錄文庫構建和測序工作委托武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

1.2.2測序數據分析對Illumina HiSeq平臺測序獲得的原始數據進行質量分析并去除低質量序列和接頭序列后，得到高質量序列。使用HISAT軟件[25]將過濾后的高質量序列與參考基因組和基因注釋文件（基因登錄號：GCF_002870075.3）比對，進行基因注釋。

1.2.3差異表達基因分析使用DESeq2軟件[26]進行差異表達分析，得到Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組這2個比較組之間的差異表達基因，篩選標準：|log2Fold Change|≥1，且校正后的P值（FDR）＜0.05，Fold Change為2個組之間基因表達水平的比值。對于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫，以通路為單位進行超幾何分布檢驗；對于基因本體（GO），則基于GO條目進行分析，并利用iTAK軟件[27]進行轉錄因子分析。

2結果與分析

2.1RNA-Seq測序數據統計分析

本研究共完成12份樣品的測序分析，結果（表2）表明，高質量reads的堿基總數為83.22 Gb，每份樣品高質量reads的堿基總數均超過6.00 Gb。Q20（堿基質量值不低于20的堿基數占總堿基數的比例）和Q30（堿基質量值不低于30的堿基數占總堿基數的比例）均在90.00%以上，G+C含量為44.31%～45.55%，能夠比對到參考基因組的reads所占比例為88.46%～94.33%；莖用萵苣種質資源1號在產品器官收獲期和抽薹期具有唯一匹配的reads所占比例均值分別為89.42%和87.85%；莖用萵苣種質資源3號產品器官收獲期和抽薹期具有唯一匹配的reads比例分別為90.77%和83.99%。主成分分析結果（圖1）表明，每組的樣品都聚集在一起，表明重復樣品間具有較高的相似度及重復性[28]。上述研究結果表明測序數據質量合格、可靠性較高，可開展下一步研究。

2.2差異表達基因

篩選差異表達基因的標準為|log2Fold Change|≥1，且FDR＜0.05。Z1和Z3的比較組中差異表達基因為6 754個，上調表達基因有3 273個，占48.46%，下調表達基因3 481個，占51.54%；Z2和Z4的比較組中差異表達基因為5 444個，上調表達基因有2 879個，占52.88%，下調表達基因2 565個，占47.12%（表3）。

對篩選出的與抽薹相關的差異表達基因進行層次聚類分析，圖2顯示，每組的3個生物學重復均聚成一簇，表明樣品的生物學重復性良好，數據的可靠性高，聚類分析將與抽薹相關的差異表達基因大致分為5類。差異表達基因韋恩圖（圖3）顯示，有2 579個差異表達基因在Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中共同表達，其中上調表達的基因有1 217個，下調表達的基因有1 267個。

2.3GO功能富集分析

GO功能富集分析分為分子功能（Molecular function，MF）、生物學過程（Biological process，BP）和細胞組分（Cellular component，CC）3個類別[29]。Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中差異表達基因富集的GO條目分別有44個和46個，其中共同富集的GO條目有44個，本研究只列出差異表達基因顯著富集的32個條目（圖4）。BP差異表達基因富集較多的GO條目為細胞過程和代謝過程；MF差異表達基因富集較多的GO條目為結合和催化活性；CC差異表達基因富集較多的GO條目為細胞解剖實體和含蛋白質復合體。在細胞過程和代謝過程差異表達基因富集較多，這一結果與其他植物的轉錄組測序結果[30]一致，表明莖用萵苣在抽薹過程中細胞活動和代謝均較活躍。

2.4KEGG通路富集分析

在KEGG數據庫中，Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中的差異表達基因分別被注釋到133條、129條KEGG通路，2個組共同注釋到的KEGG通路為128條。利用KEGG數據庫富集出莖用萵苣抽薹過程中差異表達基因表現出顯著性差異的前20條通路。前20條通路差異表達基因數量見表4和表5，莖用萵苣抽薹過程中差異表達基因富集的通路主要有次生代謝物的生物合成（ko01110）、植物激素信號轉導（ko04075）、植物-病原體的相互作用（ko04626）等。通過對KEGG富集通路的研究結果進行分析發現，代謝途徑的差異表達基因只在Z2和Z4的比較組中顯著富集，在Z1和Z3的比較組中沒有顯著富集，其原因可能是紫色莖用萵苣較綠色莖用萵苣早熟，一些物質的調控作用需要被提前激活，提前啟動代謝途徑，但具體原因還需進一步探究。

2.5轉錄因子分析

轉錄因子在植物生長和發育中起著調節作用[31]。圖5顯示，Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組分別鑒定到74個和68個轉錄因子家族，分別包括501個和458個差異表達基因。Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中的差異表達基因大多數都屬于AP2/ERF（56個、43個）、bHLH（38個、34個）、MYB（37個、30個）、NAC（27個、19個）、WRKY（24個、21個）、C2H2（23個、13個）、bZIP（19個、14個）等轉錄因子家族，表明這些轉錄因子家族可能在莖用萵苣抽薹過程中起著一定作用；在TUB、NF-YB、HB-other、DBB、FAR1等轉錄因子家族中的差異表達基因數量最少，只有1個。

3討論

高通量轉錄組測序技術可以用于研究差異表達基因及其調控機理[32]。差異表達基因是發生應激效應時表達水平發生顯著性變化的基因，研究差異表達基因可以明晰基因的功能，也可以為研究相關分子機制提供豐富的參考數據[33]。莖用萵苣是一種具有較高營養價值的蔬菜，但其提早抽薹會影響食用口感及商品價值，目前，對莖用萵苣的研究主要集中于栽培技術[34]及產量[35]等方面，莖用萵苣抽薹的機理尚不清楚，有待進一步研究。

抽薹會長出花薹，使植株高度增加[36]，植株在花芽分化期間，如果遇到長日照高溫條件，體內生長素含量升高，就會出現抽薹現象，發生抽薹初期莖頂的亞頂端細胞伸長[37]。GO功能富集分析結果表明，Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中差異表達基因富集較多的GO條目包括細胞過程，表明抽薹過程中有一系列細胞的變化。本研究中，Z1和Z3的比較組、Z2和Z4的比較組中的差異表達基因在次生代謝物的生物合成通路和植物激素信號轉導通路中富集較多，且這2條通路中的差異表達基因數量均表現為上調表達基因數量大于下調表達基因數量，推測在莖用萵苣抽薹過程中這2條通路發揮著重要作用。

WRKY家族轉錄因子可以影響植物的次生代謝[38-43]，對次生代謝物的積累起調控作用[44]，并且已有研究結果證明WRKY家族轉錄因子可以參與其他激素介導的信號轉導，從而對植物體細胞的發育起到間接調控作用[45]。對轉錄組數據進行分析發現，莖用萵苣種質資源1號和3號均有較多的差異表達基因屬于WRKY家族。Ishida等[46]的研究結果表明，WRKY家族轉錄因子對植物的開花時間具有一定的調控作用，擬南芥在長日照條件下過量表達WRKY25，會導致其開花時間提前[47]。蘇蔚等[48]發現，轉錄因子BcWRKY22可以調控菜心提前開花，在擬南芥中異源表達棉花GbWRKY1基因，發現植株抽薹開花時間明顯提前，且GbWRKY1對植物開花時間的調節主要通過赤霉素途徑實現[49]，由此推測WRKY家族轉錄因子可能會通過影響一些次生代謝物的積累和植物信號轉導途徑進而影響莖用萵苣的抽薹過程。

有研究結果表明，bHLH家族轉錄因子參與植物信號轉導、次生代謝等多種生物學過程[50]，當bHLH家族轉錄因子TT8和WD40的功能被抑制時，甘藍的開花時間會提前[51]。擬南芥的AtbHLH113基因和SPL9基因在蛋白質水平上相互作用，進而影響開花時間[52]。bHLH轉錄因子家族富集的差異表達基因數量較多，因此其可能參與莖用萵苣抽薹的調控。謝德金等[53]研究發現MYB家族轉錄因子可以調節植物次生代謝物的生物合成。莖用萵苣抽薹后次生代謝物的生物合成通路中差異表達基因上調表達數量大于下調表達數量，且此通路中差異表達基因數量較多，可能與MYB轉錄因子對次生代謝的調控有關，目前關于MYB轉錄因子對抽薹影響的研究較少，不能推測其是否參與莖用萵苣的抽薹過程。

AP2/ERF轉錄因子家族的AP2亞家族基因會影響植物花的發育，在擬南芥中，AP2同源基因對花的生長有影響，包括花分生組織的形成和花器官的生長發育，對參與花發育相關基因的表達具有調控作用[54]。然而，擬南芥的AP2基因也參與抑制成花關鍵基因SOC1和AG的表達，并與miR172基因結合，對開花時間進行負調節[55]。有研究發現次生代謝物的生物合成通路中差異表達基因富集較多，而AP2/ERF轉錄因子家族在植物次生代謝調控中發揮著重要作用[56]。Feng等[57]利用高通量測序技術分析鴨茅在不同生育期的轉錄組變化，發現ERF2基因在抽薹前期顯著表達。本研究中差異表達基因屬于AP2/ERF轉錄因子家族的數量最多，推測AP2/ERF轉錄因子家族可能會通過影響植物的次生代謝進而調控莖用萵苣的抽薹。

4結論

本研究對莖用萵苣產品器官收獲期和抽薹期的葉片和肉質莖進行轉錄組測序分析，結果表明，在產品器官收獲期和抽薹期差異表達的基因大多數屬于AP2/ERF、WRKY、bHLH等轉錄因子家族，次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉導等KEGG通路富集的差異表達基因較多。因此，今后可在這些轉錄因子家族和代謝通路中開展挖掘莖用萵苣抽薹相關基因的研究。

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（責任編輯：王妮）

收稿日期：2023-03-21

基金項目：青海省科學技術廳基礎研究項目（2022-ZJ-745）；國家重點研發項目（2022YFD1602400）

作者簡介：武一（1998-），女，河南駐馬店人，碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。（E-mail）wuyi77abc@163.com

通訊作者：王麗慧，（E-mail）qhwlhwlh@126.com