金合歡素調節Hippo信號通路對糖尿病視網膜病變大鼠血管生成的影響

基金項目：四川省科技計劃項目（23ZDYF1942）

作者單位：四川省醫學科學院·四川省人民醫院眼科（郵編610000）

作者簡介：陳芋潔（1993），女，主要從事眼科方面研究。E-mail：zznijnmn@163.com

△通信作者 E-mail：hailunx60@163.com

摘要：目的 探究金合歡素（Aca）調節Hippo信號通路對糖尿病視網膜病變（DR）大鼠血管生成的影響。方法 將60只SD大鼠隨機分為對照組、DR組、Aca低劑量組（10 mg/kg）、Aca中劑量組（20 mg/kg）、Aca高劑量組（30 mg/kg）、Hippo-yes相關蛋白（YAP）通路抑制劑Verteporfin組（Aca高劑量30 mg/kg+Verteporfin 0.8 pmol/kg），每組10只。除對照組外，采用鏈脲佐菌素和高脂飼料喂養構建DR模型，檢測大鼠體質量和空腹血糖（FBG）水平，熒光素血管造影（FFA）觀察視網膜血管新生和熒光素滲漏，酶聯免疫吸附試驗檢測血清血管內皮生長因子（VEGF）、促血管生成素-2（Ang-2）水平，蘇木素伊紅染色觀察視網膜組織病理形態變化，Western blot法檢測VEGF、缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）及Hippo信號通路蛋白表達。結果 與對照組比較，DR組大鼠視網膜細胞排列混亂、松散，新生血管形成，大量熒光素滲漏，體質量、大腫瘤抑制激酶2（LATS2）、磷酸化YAP（p-YAP）表達降低，FBG、VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1、YAP、轉錄調節因子（TAZ）、TEA結構域家族成員1（TEAD1）表達增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組大鼠視網膜細胞排列整齊，新生血管形成和熒光素滲漏減少，體質量、LATS2、p-YAP表達增加，FBG、VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1、YAP、TAZ、TEAD1表達降低（P＜0.05），高劑量組效果更明顯，但Verteporfin組與Aca高劑量組對DR大鼠各指標的作用效果差異無統計學意義。結論 Aca能抑制DR大鼠血管生成，改善視網膜病理損傷，其作用機制可能與調節Hippo信號通路有關。

關鍵詞：糖尿病視網膜病變；視網膜新生血管化；金合歡素；Hippo信號通路

中圖分類號：R774.1 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230889

Effects of acacetin on angiogenesis in diabetes retinopathy rats by

regulating Hippo signaling pathway

CHEN Yujie， HUANG Xia， DENG Bolin， JIA Wenwen△

Department of Ophthalmology， Sichuan Academy of Medical Sciences， Sichuan Provincial People's Hospital，

Chengdu 610000， China

△Corresponding Author E-mail： hailunx60@163.com

Abstract： Objective To investigate the impact of acacetin （Aca） on angiogenesis in diabetes retinopathy （DR） rats by regulating Hippo signaling pathway. Methods Sixty SD rats were grouped into the control group， the DR group， the Aca low dose group （10 mg/kg）， the Aca medium dose group （20 mg/kg）， the Aca high dose group （30 mg/kg） and Hippo-YAP signaling pathway inhibitor Verteporfin group （Aca high dose 30 mg/kg+Verteporfin 0.8 pmol/kg）， with 10 rats in each group. Except the control group， streptozotocin and high-fat feed were used to construct the DR model. Body weight and fasting blood glucose （FBG） levels of rats were measured. Fluorescein angiography （FFA） was applied to observe retinal angiogenesis and fluorescein leakage. Enzyme linked immunosorbent assay was applied to detect serum levels of" vascular endothelial growth factor （VEGF） and angiopoietin-2 （Ang-2）. Pathological changes of retinal tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Western blot assay was applied to detect expression levels of VEGF， hypoxia-inducible factor 1 alpha （HIF-1α）， vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1） and Hippo signaling pathway proteins. Results Compared with the control group， retinal cells of rats in the DR group were arranged in a disordered and loose manner， with neovascularization and a large amount of fluorescein leakage， and body weight， the expression of large tumor suppressor homolog 2 （LATS2）， p-Yes-associated protein （YAP） were reduced. FBG and expression levels of VEGF， Ang-2， HIF-1α， VCAM-1， YAP， transcription activator with PDZ binding motif （TAZ）， TEA domain family member 1 （TEAD1） were increased （P＜0.05）. Compared with the DR group， retina cells of rats in the Aca low， medium and high-dose groups and the Verteporfin group were arranged neatly， with reduced neovascularization and fluorescence leakage， body weight and the expression levels of LATS2 and p-YAP were increased， and FBG， expression levels of VEGF， Ang-2， HIF-1α， VCAM-1， YAP， TAZ and TEAD1 were reduced （P＜0.05）. The effect was more obvious in the Aca high dose group. However， there was no significant difference in each indicator between the Verteporfin group and the Aca high dose group. Conclusion Aca can inhibit angiogenesis and improve retinal pathological damage in DR rats， and its mechanism of action may be related to regulating the Hippo signaling pathway.

Key words： diabetic retinopathy; retinal neovascularization; acacin; Hippo signaling pathway

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常見的微血管并發癥，可引發嚴重的視力障礙，病理特征是微動脈瘤形成、血管通透性增加、毛細血管閉塞以及新生血管生成［1］。DR病變早期無明顯癥狀，晚期病變對患者的視力影響較大。目前，DR治療方法包括激光手術和眼內注射血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）拮抗劑，但這些療法可能導致視網膜神經元破壞，造成不可逆的視網膜損傷，甚至導致視力喪失［2］。因此，迫切需要發現新的藥物以改善DR的治療效果。金合歡素（acacetin，Aca）是一種天然類黃酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗感染等作用，在癌癥和心血管疾病等方面具有治療潛力，能改善糖尿病引發的器官功能障礙［3］。已有研究發現，Aca作為明目地黃丸的主要活性成分，能有效治療DR［4］。因此，猜測Aca可能通過減少血管生成改善DR。Hippo信號通路是一個高度保守的信號級聯通路，可控制器官發育，主要通過調節yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）、TEA結構域家族成員1（TEA domain family member 1，TEAD1）等轉錄因子，從而調控下游靶基因的表達，控制細胞增殖，且與血管生成有關［5］。DR患者存在血管病變，新生血管伴隨著內皮細胞的增殖是DR的一個重要特征。因此，Hippo信號通路可能在DR中發揮重要作用。研究顯示，Hippo信號通路的下游效應分子YAP參與VEGF誘導的病理性血管生成，敲低或抑制YAP/TAZ可導致VEGF誘導的血管生成顯著減少，YAP可能是DR的潛在治療靶點［6-7］。目前，有關Aca通過調節Hippo信號通路影響DR血管生成的研究鮮見。本研究對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質量200～230 g，購自四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所，生產許可證號：SCXK（川）2020-0003。適應性喂養1周，飼養環境溫度22 ℃左右，濕度55%，12 h/12 h光暗循環，不禁水食。本研究通過本院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 Aca（純度≥98%）、維替泊芬（Verteporfin）購自上海源葉生物科技有限公司；復方托吡卡胺購自長春迪瑞制藥有限公司；熒光素鈉溶液購自廣州白云山明興制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色試劑盒購自北京索萊寶公司；VEGF、促血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢菲恩生物科技公司；兔源VEGF、缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、YAP、磷酸化YAP（p-YAP）、轉錄調節因子（transcription activator with PDZ binding motif，TAZ）、TEAD1、大腫瘤抑制激酶2（large tumor suppressor homolog 2，LATS2）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗和山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司。血糖儀購自瑞士羅氏公司；小動物視網膜顯微成像系統購自英國OPTOPROBE公司；全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司；光學顯微鏡購自德國Lecia公司。

1.3 研究方法

1.3.1 DR模型制作和分組 將60只大鼠隨機分為對照組（10只）和模型組（50只）。模型組參照文獻［8］制作DM模型，腹腔一次性注射60 mg/kg STZ，溶解在0.1 mL檸檬酸鹽緩沖液（pH=4.5）；對照組注射檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ后72 h，血糖儀監測大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），連續3次FBG≥16.7 mmol/L即造模成功。所有DM大鼠均造模成功。采用高脂飼料喂養DM大鼠，對照組大鼠用正常飼料喂養。造模12周后，熒光素血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）觀察大鼠眼底出現視網膜出血、血管迂曲、微血管瘤等，表明DR大鼠造模成功。將模型大鼠分為DR組、Aca低劑量組、Aca中劑量組、Aca高劑量組、Verteporfin組（Hippo-YAP信號通路抑制劑），每組10只。Aca低、中、高劑量組分別皮下注射10、20、30 mg/kg的Aca［9］，Verteporfin組皮下注射30 mg/kg Aca和0.8 pmol/kg Verteporfin［10］。對照組和DR組注射相同劑量生理鹽水，每日1次，連續4周。

1.3.2 體質量和FBG水平檢測 給藥結束后，測定各組大鼠體質量變化情況；FBG檢測前1 d大鼠禁食12 h以上，尾靜脈采血1 mL，血糖儀檢測各組大鼠的FBG。

1.3.3 FFA檢查視網膜血管新生 取各組10只大鼠后麻醉，滴注復方托吡卡胺滴眼液于大鼠右眼，每次1滴，間隔5 min后滴第2次，15～20 min后充分散瞳，將10%的（2 mL/kg）熒光素鈉溶液腹腔注射于大鼠體內，30 s后采用小動物視網膜顯微成像系統檢查各組大鼠視網膜血管新生和熒光素滲漏。

1.3.4 ELISA檢測血清VEGF、Ang-2水平 麻醉各組10只大鼠后腹主動脈采血2 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測VEGF、Ang-2水平。

1.3.5 HE染色觀察視網膜組織病理形態變化 取各組麻醉大鼠并處死，摘除眼球，4只左眼球固定于4%多聚甲醛中，另外6只左眼球-80 ℃保存備用。將4%多聚甲醛固定的4只左眼球去除角膜、虹膜等多余組織，分離出視網膜組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋制成3 μm切片，脫蠟至水、HE染色、脫水封片后在光學顯微鏡下觀察視網膜組織切片病理學變化并拍照。

1.3.6 Western blot檢測VEGF、HIF-1α及Hippo信號通路蛋白表達 取-80 ℃保存的6只大鼠左眼球，分離出視網膜組織，裂解、提取總蛋白，經電泳后轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下加入一抗VEGF、HIF-1α、VCAM-1、YAP、p-YAP、TAZ、TEAD1、LATS2（均1∶1 000）和GAPDH孵育過夜，清洗，在4 ℃下加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。用ECL發光顯影，觀察拍照，用Image J軟件處理分析各條帶灰度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 7統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據采用[x] ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組體質量和FBG水平比較 與對照組比較，DR組大鼠體質量降低、FBG水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組體質量增加、FBG水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠體質量、FBG水平差異無統計學意義，見表1。[Tab.1 Comparison of body weight and FBG of rats between the six groups

表1 各組大鼠體質量、FBG水平比較" " " " " " " " "][（n=10，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。][組別 體質量/g FBG/（mmol/L） 對照組 432.68±45.09 5.27±0.62 DR組 285.93±29.65a 23.59±2.61a Aca低劑量組 358.76±36.92b 15.62±1.61b Aca中劑量組 382.05±39.02bc 10.07±1.14bc Aca高劑量組 417.25±42.83bcd 6.37±0.72bcd Verteporfin組 403.86±41.09bcd 6.48±0.68bcd F 28.295＊＊ 253.633＊＊ ]

2.2 各組大鼠視網膜新生血管情況比較 對照組大鼠視網膜血管排列均勻，無熒光素滲漏；DR組大鼠可見新生血管形成，大量熒光素滲漏；相較于DR組，Aca低、中、高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏減少，且Aca高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏減少最為明顯；Verteporfin組與Aca高劑量組新生血管形成和熒光素滲漏效果相當，見圖1。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image3_13.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image4_14.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image5_12.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image6_9.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image7_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image8_10.jpeggt;[對照組][DR組][Aca低劑量組][Aca中劑量組][Aca高劑量組][Verteporfin組][Fig.1 Retinal neovascularization in rats of each group （×20）

圖1 各組大鼠視網膜新生血管情況（×20）]

2.3 各組大鼠VEGF、Ang-2水平比較 與對照組比較，DR組大鼠VEGF、Ang-2水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組VEGF、Ang-2水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠VEGF、Ang-2水平差異無統計學意義，見表2。[組別 VEGF/（ng/L） Ang-2/（μg/L） 對照組 105.32±10.38 6.38±0.66 DR組 163.58±17.14a 11.92±1.24a Aca低劑量組 139.74±13.18b 9.27±1.01b Aca中劑量組 125.07±12.49bc 8.04±0.91bc Aca高劑量組 109.31±11.26bcd 7.05±0.77bc Verteporfin組 110.83±11.75bcd 7.48±0.78bcd F 30.569＊＊ 47.819＊＊ ][Tab.2 Comparison of VEGF and Ang-2 levels between the six groups

表2 各組大鼠VEGF、Ang-2水平比較" " " " " " " " " " ][（n=10，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。]

2.4 各組大鼠視網膜組織病理變化情況 對照組大鼠視網膜結構清晰完整，視網膜細胞排列有序，分布均勻；DR組大鼠視網膜各層充血，內核層與外核層細胞減少，視網膜細胞排列混亂、松散；相較于DR組，Aca低、中、高劑量組視網膜結構趨于完整，視網膜細胞排列整齊，且Aca劑量升高視網膜改善更明顯；Verteporfin組與Aca高劑量組視網膜結構相似，均趨于完整。見圖2。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image9_11.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image10_10.jpeggt;[對照組][DR組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image11_9.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image12_6.jpeggt;[Aca低劑量組][Aca中劑量組]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image13_6.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image14_4.jpeggt;[Aca高劑量組][Verteporfin組][Fig.2 HE staining of retinal tissue in each group （×200）

圖2 各組大鼠視網膜組織HE染色圖（×200）]

2.5 各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達比較 與對照組比較，DR組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白相對表達水平增加（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達相對表達水平降低，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達差異無統計學意義，見圖3、表3。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image15_10.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image16_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image17_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image18_7.jpeggt;[VEGF][HIF-1α][VCAM-1][GAPDH][A][B][C][D][E][F][ A：對照組；B：DR組；C：Aca低劑量組；D：Aca中劑量組；E：Aca高劑量組；F：Verteporfin組。][Fig.3 The expression levels of VEGF， HIF-1α and VCAM-1

protein in each group of rats detected by Western blot assay

圖3 Western blot檢測各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白表達][組別 VEGF HIF-1α VCAM-1 對照組 0.42±0.09 0.58±0.06 0.38±0.04 DR組 1.43±0.15a 1.26±0.12a 1.36±0.18a Aca低劑量組 0.91±0.09b 0.95±0.09b 0.99±0.10b Aca中劑量組 0.73±0.07bc 0.73±0.08bc 0.61±0.07bc Aca高劑量組 0.52±0.06bcd 0.61±0.07bcd 0.45±0.05bcd Verteporfin組 0.59±0.06bcd 0.63±0.08bcd 0.43±0.04bcd F 95.456＊＊ 57.885＊＊ 103.997＊＊ ][Tab.3 Comparison of VEGF， HIF-1α and VCAM-1 protein expression between six groups of rats

表3 各組大鼠VEGF、HIF-1α、VCAM-1蛋白相對表達

水平比較][（n=6，[x] ±s） ][ ＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與DR組比較，c與Aca低劑量組比較，d與Aca中劑量組比較，P＜0.05。]

2.6 各組大鼠Hippo信號通路蛋白表達比較 與對照組比較，DR組大鼠YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達水平增加，LATS2、p-YAP降低（P＜0.05）；與DR組比較，Aca低、中、高劑量組和Verteporfin組YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達水平降低，LATS2、p-YAP增加，且Aca高劑量組效果更明顯（P＜0.05）；Verteporfin組與Aca高劑量組上述蛋白表達差異無統計學意義，見圖4、表4。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image19_8.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image20_7.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image21_7.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image22_5.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image23_5.jpeggt;lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責編＼2024年-6期＼Image＼image24_3.jpeggt;[A][B][C][D][E][F][ A：對照組；B：DR組；C：Aca低劑量組；D：Aca中劑量組；E：Aca高劑量組；F：Verteporfin組。][p-YAP][YAP][LATS2][TAZ][TEAD1][GAPDH][Fig.4 Hippo signaling pathway protein expression results of rats in each group detected by Western blot assay

圖4 Western blot檢測各組大鼠Hippo信號通路蛋白表達]

3 討論

DR由DM誘發，可引發視網膜毛細血管、小動脈和小靜脈病變以及小血管滲漏或閉塞［1］。高血糖是DR的主要驅動因素，會導致嚴重的代謝、生化異常［11］。VEGF是與DR發展有關的血管生長因子，在高血糖環境下的視網膜細胞中VEGF高水平表達，進而導致視網膜內皮通透性增加和增殖異常，促進視網膜血管滲漏和血管生成［12］。已有研究發現，抑制DR大鼠VEGF的表達可減少血管形成［11］。HIF-1α水平增加與視網膜血管生成密切相關，DR可誘導HIF-1α表達增加，從而促進VEGF的表達［14］。Ai等［15］發現，通過抑制HIF-1α/VEGF途徑可緩解DR血管生成。Ang-2參與血管生成和血管修復的血管生長因子，可與VEGF以協同方式促進血管通透性并刺激視網膜血管生成［16］。DR早期階段，在眼外和視網膜血管中VCAM-1表達水平增加，導致白細胞黏附增加，促進血管生成［17］。本研究結果顯示，DR大鼠VEGF、Ang-2、HIF-1α、VCAM-1表達水平較對照組顯著增加，表明DR大鼠模型構建成功，提示高血糖導致血管生成相關因子水平升高，促進DR大鼠血管生成。

Aca對糖尿病及其并發癥也具有一定的治療作用。已有研究發現，Aca通過抑制氧化應激和能量代謝可減輕DM引起的心肌病［9］；Aca還可能通過促進足細胞增殖改善糖尿病腎病的發展［18］。此外，Aca還能抑制肝癌細胞增殖、存活，并下調血管生成相關蛋白VEGF的表達［19］；Aca通過靶向抑制VEGF，對多種癌癥表現出治療作用［20］。本研究結果顯示，Aca干預后大鼠視網膜細胞排列整齊，新生血管形成和熒光素滲漏減少，體質量顯著增加，FBG、VEGF、Ang-2、HIF-1α表達顯著降低，且Aca高劑量改善效果優于低、中劑量，表明Aca可以降低DR大鼠視網膜血管通透性，降低血管生成因子的水平，進而減輕DR大鼠視網膜損傷，抑制血管生成，提示Aca可通過抑制血管生成來治療DR。

已知Hippo通路可通過控制YAP來調節細胞增殖和器官發育，LATS2是YAP的上游調節器，可通過激活Hippo通路來激活LATS2，進而磷酸化YAP、TAZ［21］。已有研究表明，Hippo通路通過增加VEGF表達參與細胞增殖和血管生成，YAP激活進入細胞核后與其配體TEAD結合，促進參與細胞遷移和血管生成的相關信號因子的生成［7］。Hippo信號通路中LATS2過表達會導致VEGF低表達，抑制YAP/TAZ可抑制VEGF表達，減少血管生成，因此Hippo信號通路對VEGF有調節作用［22］。Zhu等［23］研究發現，川芎嗪通過抑制VEGF/Hippo/YAP信號通路減少腹膜血管生成，改善腹膜纖維化。Feng等［24］研究顯示，抑制YAP可顯著抑制視網膜病變小鼠模型中的新生血管生長。本研究發現，DR組大鼠較對照組YAP、TAZ、TEAD1蛋白相對表達水平顯著增加，LATS2、p-YAP顯著降低，表明Hippo通路參與DR大鼠的血管生成；而Aca干預后YAP、TAZ、TEAD1蛋白表達顯著降低，LATS2、p-YAP表達增加，表明Aca可能通過調節Hippo信號通路來減少DR大鼠血管生成。為進一步驗證Aca對Hippo信號通路有無干預作用，選用Hippo信號通路抑制劑Verteporfin干預大鼠，發現Aca對DR大鼠血管生成的改善作用與Verteporfin結果相似，提示Aca對DR大鼠血管生成的改善作用可能是通過調節Hippo/YAP信號通路來實現。

綜上所述，Aca能抑制DR大鼠血管生成，改善視網膜病理損傷，有望成為治療DR的藥物，其作用機制可能與調節Hippo信號通路有關。本研究為改善DR大鼠血管生成提供了新思路，但Aca對DR血管生成的其他分子機制仍有待闡明。

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（2023-06-12收稿 2023-08-30修回）

（本文編輯 陸榮展）