五指毛桃不同部位補骨脂素合成酶基因的表達及其代謝產物含量

楊琳　楊 帆　張杭穎　黃勃誠　邱清華　張君誠

關鍵詞：五指毛桃；補骨脂素；補骨脂素合成酶；基因表達；工藝優化；含量

中圖分類號：S567.19 文獻標志碼：A

五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是桑科榕屬植物，異形葉，葉互生，長橢圓狀葉（全緣葉）或有著3～5 深裂 （缺刻葉），表面覆粗硬絨毛，形似毛桃而得名[1]。因五指毛桃的根有椰奶的清香，又稱五指牛奶[1-2]。五指毛桃主要分布于廣西、廣東、海南等道地產區，在福建、云南、貴州等非道地產區也有分布[3]。五指毛桃性平味辛，可用于治療脾胃不適、肺癆咳嗽、風濕盜汗等常見疾病，民間常用于煲湯、泡酒，香氣濃郁[2-5]。國家衛生健康委員會將五指毛桃作為有傳統食用習慣的普通食品管理。

五指毛桃的提取物已被鑒定出了百余種成分[5-9]，包括香豆素類[7]、黃酮類[7]、酚類[8]、萜類[9]等，具有抗神經炎癥[5]、抑菌保鮮[10]以及抗癌[11-12]等作用。采用超高效液相色譜–光電二極管陣列–質譜聯用技術（UPLC-PAD-MS）檢測五指毛桃中的活性成分，其中香豆素類成分補骨脂素是最主要的活性成分，是判定藥用價值的一項重要指標[13]。從五指毛桃根中分離的補骨脂素能有效抑制斷尾誘導的斑馬魚仔魚產生活性氧（ROS）和NO，可能是炎癥治療的潛在候選藥物[14]。

補骨脂素的合成途徑是苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成肉桂酸，然后在肉桂酸羥化酶、4-香豆酸輔酶A 連接酶的作用下形成4-香豆酰輔酶A，再形成二羥基肉桂酰輔酶A，通過自發內酯化生成傘形花內酯，然后在傘形酮6-戊烯基轉移酶的作用下形成去甲基軟木花椒素，在異紫花前胡內酯合成酶的作用下形成異紫花前胡內酯，最后在補骨脂素合成酶的作用下形成補骨脂素[15-18]。因此，補骨脂素合成酶是補骨脂素合成的最后一個關鍵限速酶（圖1）。

為了進一步豐富五指毛桃研究資料，本研究采用qPCR 和HPLC 技術測定不同五指毛桃種質不同部位（主根、側根、缺刻葉、全緣葉、莖、果實）中補骨脂素合成酶基因（psoralen synthetase，PS）的相對表達量與補骨脂素含量，比較不同種質和部位對五指毛桃補骨脂素含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

五指毛桃種子分別來自廣西和福建（以下簡稱廣西五指毛桃和福建五指毛桃）。在福建省三明市莘口鎮（117°14?E，26°10?N，海拔300～400 m，向陽或半陽坡地）種植1 年。選取條件一致、長勢良好的五指毛桃主根、側根、缺刻葉、全緣葉、莖和果實，洗凈后，一部分置于液氮速凍，并于–70 ℃保存；另一部分置于烘干箱55 ℃烘干至恒重，打磨成粉狀，過60 目篩備用。分別設置至少3 個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取和cDNA 合成 參照全能型植物RNA 提取試劑盒（康為世紀，北京）和cDNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書提取獲得五指毛桃根、莖、葉和果實的cDNA，備用。

1.2.2 引物設計 基于五指毛桃RNA-seq 結果，采用以Primer 5.0 設計五指毛桃PS 基因qPCR 引物5'-GGGACGGACACAACCTTCAT-3'/5'-TCTAGGGACCAAGACCGGAG-3'，擴增片段為213 bp。

以Actin3 基因（引物分別為5'-TTAGACGTTGTGTAGCCAGCA-3'/5'-CTACTTGCGTTGTGATCCGG-3'）作內參[19]，擴增長度為174 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 熒光定量PCR 五指毛桃主根、側根、莖、全緣葉、缺刻葉、果實的cDNA 樣品稀釋至濃度一致，每個樣品3 個技術重復。qPCR 反應體系為10 μL，反應程序為95 ℃預變性10 s，然后按94 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，延伸結束收集熒光，46 個循環；之后從50 ℃開始，以每步0.5 ℃的速度升溫至95 ℃，每個溫度保持5 s。最后用2^–ΔΔC_T法計算各樣品中PS 基因的相對表達量，并進行顯著性分析。

1.2.4 補骨脂素的提取 取五指毛桃樣品粉末，以料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為變量超聲波提取，15 000 r/min，在4 ℃下離心15 min 后，用0.45 μm 針孔式過濾器過濾，取上清液。以高效液相色譜檢測的補骨脂素含量為判斷指標，按表1 設計水平梯度，獲得五指毛桃最佳提取工藝后，以廣西和福建五指毛桃主根、側根、缺刻葉、全緣葉、莖和果實為材料，提取補骨脂素，獲得提取液，備用。

1.2.5 補骨脂素含量測定 根據王曉平等[20]的方法，采用Eclipse XDB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動相為乙腈–水（35∶65， V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃；進樣量為20 μL，檢測波長為245 nm。

在10 mL 容量瓶中加入5.40 mg 補骨脂素標準品粉末，并用甲醇進行定容，得到補骨脂素標準品溶液母液。再取6 個相同的10 mL 容量瓶，準確吸取補骨脂素標準品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL）定容。于0.45 μm 針孔濾器過濾后，按上述色譜條件測定峰值，制作標準曲線。

按上述色譜條件，吸取20 μm 補骨脂素標準品溶液進行高效液相色譜實驗。連續進樣6 次，用峰面積計算相對標準偏差（RSD，%），用于評價檢測儀器的精密度及可靠性。

取3 份五指毛桃樣品，分別按照其最佳提取條件加入樣品與甲醇的最佳料液比，然后用超聲提取進行檢測。計算峰面積及其RSD，對檢測儀器的可靠性進行判定。

精密吸取同一樣品溶液，按上述色譜條件，分別于1、2、4、8、12 h 用液相色譜儀測定含量，測得補骨脂素峰面積的RSD，用來驗證12 h 內樣品溶液的穩定性。

精密稱取五指毛桃根部粉末，按照最佳提取條件料液比例加入甲醇，經超聲波提取，按上述色譜條件進行樣品中補骨脂素含量的測定，再由補骨脂素標準品標準曲線回歸方程求出樣品中的含量。在3 份1 mL 樣品溶液中分別加入0.02、0.33、0.45 mg/mL 補骨脂素對照品各1 mL，利用超聲波儀器使2 種溶液按1∶1（V/V）混合均勻制成供試樣品溶液，用高效液相色譜儀測定其含量，并計算其回收率（%），回收率=（終測得含量-樣品中含量）/加入標準品的量×100%。

1.3 數據處理

每組試驗均重復3 次，所得數據采用Excel2010 軟件進行分析處理并制圖。使用SPSS v.18.0統計學分析軟件對五指毛桃PS 基因表達和補骨脂素含量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 PS 基因相對表達量

通過qRT-PCR 檢測廣西和福建五指毛桃PS基因的相對表達量，結果顯示，PS 基因在2 個產地的五指毛桃根、莖、葉和果實中均有表達。將PS 基因在廣西五指毛桃主根的表達量設定為1，計算PS 基因的相對表達量。結果表明，廣西五指毛桃PS 基因在側根中的相對表達量最高，分別是主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實的20.20、39.92、57.87、64.74、66.44 倍，差異均為極顯著（P<0.01，圖2A）。福建五指毛桃PS 基因在側根中的相對表達量最高，但僅為廣西五指毛桃側根表達量的0.167，分別是主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實的5.50、8.37、10.78、11.48、11.68 倍，差異均為極顯著（P<0.01，圖2B）。2 種五指毛桃主根和側根中的SP 基因相對表達量差距較大，廣西五指毛桃分別是福建五指毛桃的1.63 、6.00 倍（P<0.01），全緣葉、缺刻葉、莖和果實的SP 基因相對表達量相近，分別為1.26、1.12、1.07、1.06倍， 除全緣葉中的相對表達量差異極顯著（P<0.01）外，其余均無顯著性差異。

2.2 補骨脂素提取工藝優化

2.2.1 試驗水平與結果 對五指毛桃補骨脂素提取的料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）進行三因素三水平的試驗分析（表2）。根據極差值得出：C>B>A，即影響程度的主次順序依次為：提取時間＞提取溫度＞料液比。從因素A 的k 值比較顯示：k₃>k₂>k_l，因此推斷出最優料液比為A₃。同理確定最優提取溫度為B₃，最優提取時間為C₁。綜上篩選得出最優組合為A₃B₃C₁，即液料比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為15 min。

2.2.2 方差分析 進一步對正交試驗提取結果和方差分析兩方面進行分析（表3），結果表明，除因素C 以外其余二者的均方均小于誤差的均方，說明其余兩因素對結果無較大影響。3 個因素的P值分別為0.717、0.647、0.284，P>0.05，因此認為料液比、提取溫度、提取時間三者均對五指毛桃補骨脂素提取量無顯著影響。可直接依據正交試驗結果的極差值判斷其最優提取條件。

結合正交試驗結果和方差分析得到最優提取工藝為A₃B₃C₁，按照最優提取條件驗證，補骨脂素含量為2.6913 mg/g。

2.2.3 最優提取工藝確認與驗證 結合正交試驗結果和方差分析結果進行綜合考慮，確定最佳提取工藝的料液比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為15 min。表明優化五指毛桃補骨脂素提取工藝參數的方法有效可行。

2.3 補骨脂素含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 在流動相乙腈–水35∶65（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL，檢測波長為245 nm 的條件下，測得補骨脂素標準品的色譜圖，出峰時間在6～7 min之間。標準曲線的線性回歸方程為y=42 790x+35.397（r=0.9999）。五指毛桃樣品在6～7 min 內也出現單一峰，與補骨脂素標準品出現峰值的時間一致，峰面積可用于計算五指毛桃補骨脂素含量。

2.3.2 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率試驗 使用補骨脂素標準品溶液6 次進樣，相對標準偏差（RSD）為0.05%，說明使用的儀器具有較好的精密度。同一批次3 份樣品的高效液相色譜峰面積值的RSD 為0.26%，表明此方法具有較好的重復性。通過12 h 內5 個時間的樣品溶液測定發現，補骨脂素峰面積的RSD 小于2%，這說明在這12 h 內，提取溶液中的補骨脂素具有良好的穩定性。補骨脂素的加樣回收率的RSD 為1.78%，表明具有良好的回收率。

2.3.3 不同五指毛桃種質補骨脂素含量的差異利用高效液相色譜法檢測不同五指毛桃種質不同部位的補骨脂素含量，廣西五指毛桃補骨脂素含量高于福建五指毛桃， 含量范圍分別為0.002～3.206 mg/g 和0.001～2.947 mg/g。按補骨脂素含量排序為：側根>主根>全緣葉>缺刻葉>莖>果實。廣西五指毛桃中側根、主根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實的補骨脂素含量占比分別為58.96%、39.28%、1.27%、0.40%、0.06%和0.04%。福建五指毛桃側根的補骨脂素含量占比高于廣西五指毛桃，為85.83%，但主根與側根含量的占比和（98.04%）與廣西五指毛桃（98.24%）相當（圖3 ）。廣西五指毛桃側根補骨脂素含量最高為3.206 mg/g，比福建五指毛桃（2.947 mg/g）高0.259 mg/g（圖4A）。主根的補骨脂素含量僅次于側根，廣西和福建五指毛桃主根的補骨脂素含量分別為2.136、0.419 mg/g（圖4B）。全緣葉的補骨脂素含量高于缺刻葉，廣西和福建五指毛桃全緣葉的補骨脂素含量分別為0.069、0.035 mg/g（圖4C）， 缺刻葉的補骨脂素含量分別為0.022、0.028 mg/g（圖4D）。2 個五指毛桃種質莖的補骨脂素含量相似，均為0.003 mg/g（圖4E）。果實中的補骨脂素含量最低，廣西五指毛桃的補骨脂素含量含量為0.002 mg/g，福建五指毛桃的為0.001 mg/g（圖4F）。

2.4 相關性分析

通過對不同五指毛桃種質不同部位中補骨脂素含量與PS 基因表達量進行相關性分析，結果表明，五指毛桃補骨脂素含量與SP 基因表達量呈正相關（r=0.722）。其中，主根、側根、全緣葉、缺刻葉、莖和果實的補骨脂素含量與PS 基因表達量的r 分別為0.988、0.822、0.909、0.713、0.171、0.344，說明五指毛桃根和葉的補骨脂素含量與PS基因表達量的相關性較高，莖和果實的補骨脂素含量與PS 基因表達量相關性較低。廣西五指毛桃和福建五指毛桃的補骨脂素含量與PS 基因表達量均呈正相關，r 分別為0.819 和0.998。

3 討論

3.1 五指毛桃補骨脂素提取工藝優化

五指毛桃是嶺南地區常用的藥食同源的藥材，其香味與藥效均與補骨脂素含量相關[7， 10]。補骨脂素為脂溶性成分，極性較低的溶劑易提取出油狀物，使用高濃度乙醇或甲醇溶劑提取，補骨脂素含量較高[3， 21]。本研究以甲醇超聲提取，從料液比、提取時間和提取溫度3 個因素水平優化提取工藝，具有提取效率高、操作簡單、節約時間等優點，可為五指毛桃提取工藝的應用提供方法學支持。

3.2 五指毛桃不同部位補骨脂素合成特征

五指毛桃因具有獨特藥效而被廣泛使用，常用于入藥的部分是其根部[1]。補骨脂素作為五指毛桃藥用價值質量鑒定的一項有效指標[10]，五指毛桃根部SP 基因的相對表達量和補骨脂素含量在各部位中具有顯著優勢，且具有相關性。與傳統上以其根入藥相符。該結果與馬雅靜等[22]在五指毛桃的質量標準研究中藥用部位根部顯著高于非藥用部位莖部的結果一致。五指毛桃葉的異性是由全緣葉向缺刻葉發展，有研究表明五指毛桃植物的葉裂數越多，其根部的補骨脂素含量越高[20， 23-24]，推測由全緣葉向缺刻葉發展，補骨脂素由葉向根部轉移。五指毛桃果實中的補骨脂素含量雖然較低，但有研究表明，果實分離出生物堿、倍半萜、黃酮等物質具有良好的抗真菌活性，可抑制大部分柑橘果實的腐爛[14， 25]。

3.3 不同五指毛桃種質的補骨脂素合成特征

五指毛桃在廣西、廣東等道地產區備受青睞，在福建、云南等非道地產區也多有應用。不同五指毛桃種質藥用部位根中的補骨脂素含量存在一定差異（0.419～3.206 mg/g）。廣西五指毛桃SP 基因的相對表達量（0.022～1.445）也高于福建五指毛桃（0.241～0.021）。說明道地產區廣西的五指毛桃中補骨脂素含量較高，質量較好，該結果與梁梓悠等[3]的研究結果基本一致，且PS 基因表達量與產物含量的相關性均較高。

4 結論

五指毛桃中補骨脂素最佳提取工藝的料液比為l∶20（g/mL），提取溫度為50 ℃，提取時間為15 min。HPLC 檢測五指毛桃的補骨脂素具有良好的重現性，結果精確可靠。測得廣西五指毛桃的補骨脂素含量高于福建五指毛桃，其中側根含量最高，主根次之，全緣葉和缺刻葉含量低于根，但高于莖和果實。PS 基因在五指毛桃的各部位中均有表達，且表達具有特異性。PS 基因表達量與五指毛桃補骨脂素含量呈正相關。研究結果為解析PS 基因在五指毛桃補骨脂素合成中的作用提供參考。