低溫脅迫下不同甘蔗品種的生理響應及耐寒性評價

饒席兵　錢禛鋒　曾丹　張蓉瓊　呂紹芝　沈慶慶　吳華英　何麗蓮　李富生

關鍵詞：甘蔗；耐寒性；生理響應；主成分分析；聚類分析；綜合評價

中圖分類號：S566.1 文獻標志碼：A

甘蔗（Saccharum officinarum L.）原產于熱帶亞熱帶地區，種植面積近2700 萬hm2，分布在全球120 多個國家，貢獻了全球糖總產量的80%以上[1]。除了傳統的糖生產，甘蔗因其巨大的生物產量和大規模的糖蜜乙醇生產而被公認為重要的能源和生物燃料作物，它還是生產生物丁醇和柴油最有效的原料， 占世界生物燃料總產量的40%[2]。此外，在甘蔗生產過程中還能獲得其他有價值的副產品，包括紙、醋酸、膠合板和工業酶等[3]。甘蔗是一種喜溫作物，然而云南的氣候存在“兩頭低溫”的特點；在早春時節，西北地區吹來的冷空氣與南方暖濕空氣相持形成持續性低溫陰雨天氣——“倒春寒”，而這時甘蔗正處于幼苗期，嚴重阻礙了甘蔗幼苗的生長發育。并且，在甘蔗生長后期又容易面臨霜凍的侵襲，進而影響甘蔗糖分的積累。因此，培育出抗逆性強的甘蔗品種成為現階段甘蔗育種的主要方向之一。

植物受到低溫脅迫后一方面可以根據植株的外部表型受害情況，另一方面能通過生理生化數據的改變所呈現，故均可用于植物的耐寒性評價。李楊瑞等[4]研究了寒害對甘蔗外部形態的影響，發現低溫使得甘蔗蔗葉、蔗莖都有不同程度的損傷。周會等[5]發現甘蔗節間生長點比節間組織更容易受到低溫傷害。據報道，丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）含量以及抗氧化酶活性與植物的耐寒能力密切相關。包昌艷等[6]研究表明，強耐寒性西藏箭竹和錯那箭竹能保持較高水平的SP、Pro 含量和較低水平的MDA 含量。丘立杭[7]研究表明，低溫脅迫后強耐寒性的甘蔗品種SS 含量最高且增幅最大。陸思思等[8]發現低溫處理后，強耐寒性甘蔗品種的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性均高于不耐寒品種。植物耐寒分子機制研究表明，植物體內碳水化合物代謝及其相關基因的表達與植物的耐寒能力有關[9]。牛俊奇等[10]發現蔗糖代謝相關酶基因的表達可以平衡蔗糖代謝過程，從而使植物更好適應低溫環境。CHEN 等[11]發現耐寒相關響應基因DREB、COR413、CSD 參與菊花的低溫應答反應。

研究表明，甘蔗耐寒性屬中偏低遺傳力性狀[12]，雜交后代的耐寒性與其親本的耐寒能力密切相關[13-14]。因此，合理評價甘蔗耐寒種質資源，對種質創新和改良甘蔗耐寒性有重大意義。主成分分析能夠確定合理概括整體的主要因子，被研究人員廣泛用于植物的抗旱、耐寒性評價[15]。隸屬函數法彌補單一指標帶來的偏差，使評定的結果與實際結果較為接近，是近年來植物抗逆性評價方法中最常用的方法，已在含笑[16]、野生苔草[17]、蘋果[18]、水稻[19]等作物耐寒性評價中應用，聚類分析可以對不同的材料直觀地分類[20-21]。本研究以8 份不同品種甘蔗及1 份甘蔗近緣野生種蔗茅無性系為試驗材料，研究其低溫脅迫下的生理響應特點，并通過主成分分析、模糊隸屬函數法以及聚類分析進行耐寒性綜合評價，為研究甘蔗低溫脅迫應答調控機理，選育強耐寒性甘蔗新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的甘蔗材料包括新臺糖22 號（ROC22）、新臺糖20 號（ROC20）、新臺糖10號（ROC10）、新臺糖16 號（ROC16）、滇蔗01-58、崖城89-9、黃加利、粵糖93-159，為進一步清晰地評價各甘蔗品種的耐寒特性，故加入一個具有較強耐寒能力的甘蔗近緣野生種（蔗茅99-1）。所有供試材料均由云南農業大學甘蔗研究所資源圃種植保存。

首先將供試材料盆栽于溫室大棚內，待生長至3～4 葉期，將處理組（3 ℃，3 d）置于光量子通量密度為300 μmol/（m²s），光周期為13 h/d，相對濕度為60%～70%的低溫光照培養箱中進行脅迫處理；對照組（30 ℃，3 d）置于溫室大棚中正常生長。到達脅迫處理時間點后分別將樣品（+1葉）取回，用液氮保存，進行耐寒相關生理指標測定。

1.2 方法

1.2.1 指標測定 利用格銳思生物公司的試劑盒，采用硫代巴比妥酸法進行MDA 含量測定，采用可見分光光度法進行Chl 含量測定，采用蒽酮比色法進行SS 含量測定， 采用BCA 法進行SP 含量測定，采用酸性茚三酮法進行Pro 含量測定，采用WST-8 法進行SOD 活性測定，采用愈創木酚法進行POD 活性測定，采用顯色法法進行CAT 指標測定。

1.2.2 耐寒性綜合評價 通過主成分分析法轉化待評價指標，用模糊數學隸屬函數法計算對應的隸屬函數值，最后以D 值綜合評價各材料的耐寒性。

1.3 數據處理

分別使用Excel 2009、DPS（7.05）軟件進行繪圖和數據差異顯著性分析，使用SPSS 26 軟件進行主成分分析及聚類分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對甘蔗葉片生理指標的影響

2.1.1 低溫脅迫對甘蔗葉片MDA、Chl 含量的影響 低溫脅迫處理3 d 后，除了崖城89-9 以外，其余供試材料的MDA含量均升高。其中，ROC16、ROC22 和滇蔗01-58 的MDA 含量較CK 差異達極顯著（圖1A）；以滇蔗01-58 的相對值最大，為190%，崖城89-9 的相對值最小，為87%（表1）。Chl 含量方面，低溫脅迫3 d 后，ROC22、滇蔗01-58 及粵糖93-159 三份材料的Chl 含量降低，其余6 份材料的Chl 含量均升高；其中，ROC20、ROC10、崖城89-9、黃加利及蔗茅99-1 較CK差異顯著（圖1B）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為172%，粵糖93-159 的相對值最小，為64%（表1）。

2.1.2 低溫脅迫對甘蔗葉片SS、SP、Pro 含量的影響 結果表明，低溫處理3 d 后，不同材料間SS 含量變化存在差異，ROC20、滇蔗01-58、黃加利、粵糖93-159 的SS 含量較CK 極顯著降低，其余5 份材料的SS 含量較CK 極顯著升高（圖1C）；其中，崖城89-9 的相對值最大，為227%；黃加利的相對值最小，為33%（表1）。SP 含量方面，ROC20、滇蔗01-58、粵糖93-159 處理前后變化不明顯；ROC22、黃加利低溫脅迫后降低，ROC16、崖城89-9、蔗茅99-1 較CK 極顯著升高（圖1D）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為164%；ROC22 的相對值最小，為58%（表1）。所有材料的Pro 含量經低溫脅迫后均升高，其中，ROC22、ROC10、崖城89-9，粵糖93-159 及蔗茅99-1 較CK 差異極顯著（圖2A）；以蔗茅99-1 的相對值最大，為172%（表1）。

2.1.3 低溫脅迫對甘蔗葉片SOD、POD、CAT 活性的影響 低溫脅迫3 d 后，所有材料的SOD 活性均下降。其中，ROC20、ROC22、崖城89-9 的SOD 活性較CK 顯著降低，ROC10、黃加利、粵糖93-159 和蔗茅99-1 較CK 極顯著降低（圖2B）；以ROC20 相對值最大，為92%，崖城89-9 的相對值最小，為58%（表1）。ROC22、黃加利和滇蔗01-58 的POD 活性經低溫處理后變化不明顯，其他材料的POD 活性均顯著高于CK（圖2C）；相對值最大的是崖城89-9，為162%。CAT 活性方面，低溫脅迫前后崖城89-9 變化不大，ROC22極顯著低于CK，其他材料均極顯著高于CK（圖2D）；相對值最高的是滇蔗01-58，達到331%，最低的是ROC22，僅有67%。

2.2 各生理指標之間的相關性分析

相關性分析結果顯示，SOD 與Pro 呈顯著負相關、與MDA 呈顯著正相關；POD 與SS、SP 呈顯著正相關，與MDA 呈極顯著負相關。SS 與SP 呈顯著正相關；其中，POD 與可溶性蛋白的相關系數最大，R²=0.799，其他指標間相關性不顯著（表2）。

2.3 主成分分析

將8 個耐寒性指標的相對值進行主成分分析，由表3 可知，共得到3 個主因子，其中，主因子1 的特征值為3.940，具有49.247%的貢獻率；主因子2 的特征值為1.613，具有20.164%的貢獻率；主因子3 的特征值為1.005，具有12.559%的貢獻率。3 個主因子的特征值均大于1，累計貢獻率為81.970%（表2）。將8 個耐寒生理指標轉化為3 個獨立的綜合指標，對甘蔗耐寒性指標進行評價。主因子1 中，系數較大的有POD（0.940）、MDA（-0.882）、SP（0.784）、SOD（-0.709），絕對值均大于0.700。主因子2 中，系數最大的是葉綠素（0.662），最小的是POD（0.143）。主因子3 中，系數最大的是CAT（0.698），最小的是POD（0.391）（表2）。

2.4 耐寒性綜合評價

結合生理指標的相對值和主因子系數得到主因子得分PC 值，由表4 可知，崖城89-9 在主因子1 中的數值最大，粵糖93-159 在主因子2 中的數值最大，黃加利在主因子3 中的數值最大。通過模糊隸屬函數法計算出各主因子的隸屬函數值。在主因子1、主因子2、主因子3 中，隸屬函數值中的最大（1.00）的分別是蔗茅99-1、崖城89-9、滇蔗01-58，表明各自在不同主因子中耐寒性最強，隸屬函數值最?。?.00）的分別是滇蔗01-58、粵糖93-159、黃加利，表明各自在不同主因子中耐寒性最弱。根據主成分分析得到的主因子貢獻率計算出3 份主因子的權重。主因子1 的權重為0.60，主因子2 的權重為0.25，主因子3的權重為0.15。再根據隸屬函數值和權重計算得到綜合評價值（D），D 值越大則耐寒性越強。其中，D 值較大的是蔗茅99-1（0.84）、崖城89-9（0.83）、ROC10（0.74），D 值較小的是ROC22（0.23）、滇蔗01-58（0.24）、黃加利（0.41）；9份材料的耐寒性排序為： 蔗茅99-1> 崖城89-9>ROC10> ROC16>粵糖93-159>ROC20>黃加利>滇蔗01-58>ROC22。

2.5 聚類分析

將綜合評價值（D）利用組間聯接法和平方歐氏距離進行聚類分析，在歐氏距離5 處將9 份材料分為3 個類群，對應耐寒性為強、中、弱3個等級。第Ⅰ類群包括蔗茅99-1、崖城89-9、ROC10，耐寒性強；第Ⅱ類群包括ROC20、粵糖93-159、黃加利、ROC16，耐寒性中；第Ⅲ類群包括滇蔗01-58、ROC22，耐寒性弱（圖3）。

3 討論

低溫是影響甘蔗生長發育、產量以及分布的主要環境因子之一。探究甘蔗在低溫逆境下的生理反應特性，篩選強耐寒性甘蔗親本材料，對指導甘蔗育種及推動甘蔗產業發展有重要的意義。研究表明，葉片在植物光合作用、生理生化反應過程中發揮重要的作用，對外界溫度的變化也較為敏感，可以作為植物耐寒性生理響應研究的重要器官[22]。故本研究以9 份低溫脅迫的甘蔗葉片進行耐寒生理響應分析，從而綜合評價其耐寒性。

當植物暴露于低溫逆境時，體內會產生大量的ROS，隨著脅迫程度的不斷加深，打破了自由基產生與清除的動態平衡，導致細胞膜脂發生過氧化作用，膜內物質外滲并產生大量MDA，從而影響一系列生理生化反應的正常進行，故可通過MDA 含量的變化，分析膜系統受損程度以及植物的耐寒能力。黃麗芳等[23]研究表明，經低溫脅迫后不同咖啡品種的MDA 含量呈上升趨勢。彭云玲等[24]發現，玉米經低溫脅迫后其MDA 含量均較CK 升高。本研究結果與前人的研究結果基本一致；經低溫脅迫后，耐寒性相對較弱的ROC22、滇蔗01-58 中積累了較多的MDA，而在耐寒性相對較強的蔗茅99-1、崖城89-9 以及ROC10 中，MDA 的累積量并不多，說明MDA 含量是衡量植物低溫耐受性的重要因素，可作為植物耐寒性評價的關鍵指標之一。低溫脅迫下，葉綠體的超微結構被破壞，Chl 合成酶的活性顯著降低，導致Chl 含量下降，進一步影響植物的光合作用與代謝。張保青等[25]、王振波等[26]研究發現，耐寒性較強的材料經低溫脅迫后，其體內的Chl 含量仍能保持一個較高的水平；本研究結果與之一致。

經過漫長的選擇與進化，植物形成了其特有的調控機制來適應逆境帶來的不利影響，滲透調節便是其中的一種。SS、SP 和Pro 是重要的滲透調節物質，其積累能增加細胞內束縛水與自由水的比值、原生質的保水能力和細胞液濃度等，從而平衡在低溫條件下的細胞代謝，對生物膜系統起到很好的保護作用，以抵御環境脅迫帶來的不利影響[27]。何子華等[28]進行不同禾本科牧草的耐寒性評價，發現經低溫脅迫后不同禾本科牧草的SS 含量和Pro 含量均呈不同程度的增加趨勢。陳明輝等[29]發現6 個不同品種果蔗的SS、SP 和Pro含量隨著低溫脅迫時間的延長而持續升高。本研究中，經低溫脅迫后，強耐寒性材料蔗茅99-1、崖城89-9 的SS、SP 以及Pro 含量較CK 極顯著升高，說明滲透調節物質含量的增加，是植物對低溫脅迫的一種應對策略；而在弱耐寒性材料中，SS 及SP 的含量反而低于CK，可能是由于超出其低溫耐受范圍，導致細胞內滲透失衡。

SOD、POD、CAT、APX、GR 等是植物體內重要的抗氧化酶，在植物逆境應答，活性氧清除過程中發揮著重要的作用。SOD 是植物抗氧化酶系統的第一道防線，它能特異性地將超氧陰離子（O₂^?）歧化為對植物毒害較小的H₂O₂；POD 可以催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應：RH₂+H₂O₂→2H₂O+R， 清除由逆境產生的H₂O₂；CAT 在清除植物體內的氧自由基時也起著重要作用[30]。全怡吉等[31]研究了不同甘蔗品種對低溫的生理響應，發現低溫脅迫后，蔗莖CAT 活性上升，而SOD、POD 活性下降。曹哲群等[32]研究結果表明，經低溫（3 ℃）處理3 d 后，各甘蔗材料葉片的SOD 活性均有不同程度的下降。孫波等[33]發現低溫持續脅迫下，甘蔗根系的POD、SOD 活性呈現先升高后降低的趨勢，但耐寒性強的品種在處理后期也能保持一定的活性。本研究中，經低溫脅迫后，所有材料葉片的SOD 活性均較CK 降低，多數材料的POD、CAT 活性較CK升高。該結果與前人研究結果有差異，可能是由于甘蔗基因型、測定時期、測定部位等不同所導致。在各指標相關性分析中，發現POD 與SS、SP 呈顯著正相關，進一步說明POD 在植物甘蔗抵御低溫脅迫中發揮著重要的作用。

研究表明，植物耐寒性屬于多因素調控的數量性狀，用單一指標、單一的分析方法作為植物耐寒性評價較為片面，采用多種指標增大數據處理量的同時，各指標信息也存在交叉與重疊現象。主成分分析法可將多個單項指標轉化為互相獨立的綜合指標，不僅可以降低變量個數，同時又能保證不會對最終評價造成偏差。本研究利用主成分分析，共提取出3 個主因子，累計貢獻率為81.970%；相關研究表明，主子因累計貢獻率達80%以上得到的結果相對可靠。楊小英等[34]通過聚類分析，將不同品種玉米分為高度抗旱、中度抗旱、抗旱、敏感、高度敏感5 個亞群。金明等[35]將不同水稻種質材料分為耐寒性極強、耐寒性強、耐寒性中等、耐寒性弱和耐寒性極弱5 個等級。本研究通過聚類分析，將9 份甘蔗材料劃分為強耐寒類型、中度耐寒類型和弱耐寒類型。

本研究通過分析不同甘蔗品種苗期葉片的生理響應，利用主成分分析、隸屬函數等方法對其耐寒性進行綜合評價。結果表明，耐寒能力最強的甘蔗品種為崖城89-9，最弱的為ROC22，強耐寒性甘蔗品種能夠更好地提高滲透調節物質含量及抗氧化酶活性，進一步清除ROS，平衡細胞代謝過程，從而更好地適應低溫環境。