青少年特發性脊柱側凸進展風險的表觀遺傳學因素研究進展*

劉小梅,王艷洋,劉 敏,王 謙

(四川大學華西醫院康復醫學中心,成都 610041)

青少年特發性脊柱側凸(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)是一種復雜的脊柱三維結構改變,多見于10歲至骨骼發育成熟的兒童,發病率為0.47%～5.20%[1]。AIS的病因尚不明確,但目前普遍認為它是一種由遺傳因素和環境因素共同作用的多基因疾病[2-3],治療目標主要以控制側凸進展,避免后期手術為主[4]。雖然支具治療的有效性已得到證實[5-6],但治療效果存在很大異質性,部分患者即使經過嚴格的支具治療,側凸仍然進展并達到手術閾值[7-8]。準確預測側凸進展風險將有助于醫生及治療師對AIS患者進行風險分級,評估患者預后,提供更加個性化的治療方案[9]。臨床上常用的進展風險因素主要包括剩余生長潛能、側凸大小、側凸類型等[10-11],并基于此開發了多種預測模型,但靈敏度和特異度有限[12-14]。近年全基因組關聯研究(genome-wide association studies,GWAS)促進了AIS候選基因的鑒定,并確定了多組與AIS進展相關的基因[15-17],但在后續的多種族復制研究中并不成功[18-19],這也使得它的預測價值十分有限。同卵雙胞胎AIS患者側凸進展的差異性表明環境因素可能通過表觀遺傳變化導致AIS的進展,這在后續的研究中得到證實[20-21]。表觀遺傳學標志物在預測AIS進展風險方面的價值開始受到越來越多的關注。

表觀遺傳學標志物主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA(如 miRNA)[22],這些標志物通過引起局部染色質重塑,改變調控元件對基因的可及性,進而在染色質水平動態調控基因的表達,但并不改變基因序列[23]。表觀遺傳學因素可穩定地反映遺傳因素及環境暴露之間的相互作用,在預測側凸進展方面顯示出更多優勢[24-25],同時它可以識別患者對干預治療的反應[26],在精準醫療、個性化醫療方面擁有巨大潛力。本文將對AIS進展風險的表觀遺傳學因素的研究進展進行綜述,以期為后續AIS的治療及研究提供思路。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是最常見的表觀遺傳機制,其通過招募參與基因抑制的蛋白質或抑制轉錄因子與DNA結合來調節基因表達[27]。甲基與CpG二核苷酸共價結合,在常規DNA提取過程中不會丟失,因此是非常適合用于大規模流行病學研究的表觀遺傳標志,這為利用現有DNA生物標志物來發現復雜疾病的表觀遺傳風險因素開辟了更多可能性[28]。目前的研究表明一些DNA區域的低甲基化及部分基因啟動子的高甲基化都與AIS進展有關。

1.1 DNA區域的低甲基化

側凸角度的增加與一些DNA區域的甲基化減少有關,特定基因的甲基化可以作為疾病診斷篩查和預后預測的生物標志物。2018年,MENG等[29]首次使用全基因組方法確定了DNA甲基化在預測AIS進展方面的潛力。MENG等首先對兩對側凸進展不同的同卵雙胞胎AIS患者進行了表觀遺傳學基因組分析,發現他們的DNA甲基化水平存在明顯差異,進展組的血液樣本中cg01374129的甲基化水平明顯低于非進展組。然后,MENG等分析了其他進展不同的AIS患者,得到了相同的結果。DNA甲基化差異與側凸進展呈現明顯的相關性,并且不受遺傳差異的影響,因此MENG等認為位點cg01374129的低甲基化水平是側凸進展高風險的獨立預測因素。另一項研究分析了8對同卵雙胞胎AIS患者(其中6對側凸進展不同,2對側凸進展相同)的全基因組甲基化水平,確定了4個與側凸嚴重程度相關的CpG位點(cg02477677、cg12922161、cg08826461、cg16382077),側凸嚴重程度的增加往往與這些位點甲基化水平降低有關,同時側凸嚴重程度的差異與雙胞胎之間的甲基化差異呈正相關或負相關[20]。后續研究還報道了AIS患者兩側深層椎旁肌和背部淺層肌肉中雌激素受體1基因(estrogen receptor 1 gene,ESR1)的組織依賴區域和差異甲基化區域(tissue dependent and differentially methylated regions,T-DMRs)的甲基化水平,發現在大多數T-DMR2 CpG中甲基化水平與側凸凹側的ESR1表達水平相關,在Cobb角≤70°患者的4個CpG位點上,側凸凹側深部椎旁肌的T-DMR2甲基化水平明顯降低,這提示T-DMR2甲基化的差異可能與AIS的嚴重程度有關[30]。這些研究結果表明,一些DNA區域的甲基化差異與側凸的嚴重程度及進展相關,DNA區域的低甲基化水平是側凸進展風險的有效預測因素。

1.2 基因啟動子的高甲基化

基因啟動子甲基化與基因表達密切相關,在基因表達中起重要作用,基因啟動子可通過調節其甲基化水平來調控基因的表達[31]。近年來的研究發現基因啟動子的高甲基化與AIS的進展及其嚴重程度密切相關。MAO等[32]研究發現AIS患者血清中的軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)基因表達明顯降低,而COMP的啟動子甲基化與基因表達密切相關。他們評估了50例AIS患者和50例健康對照者COMP啟動子的甲基化水平,發現AIS患者的COMP啟動子甲基化水平明顯升高,且與Cobb角和實際年齡明顯相關。COMP啟動子的甲基化水平越高,則患者的主彎Cobb角越大、發病年齡越早、側凸進展的風險也更高。COMP是一種細胞外基質(extracellular matrix,ECM)糖蛋白,影響膠原蛋白的組裝和ECM的穩定性。COMP突變會引起內質網應激和軟骨細胞凋亡,導致罕見的骨骼疾病[33-34]。這也提示COMP通過調節其啟動子的甲基化水平,調控基因表達,進而參與脊柱側凸的進展。另一項研究發現AIS患者的PITX1啟動子甲基化水平與側凸進展和側凸嚴重程度明顯相關,在Cobb角>30°的AIS患者中,PITX1啟動子甲基化水平明顯升高,而PITX1基因表達降低[28]。作者在后續的研究中還發現AIS患者PCDH10啟動子甲基化的平均水平高于健康對照組,而基因表達水平明顯低于健康對照組,兩者呈明顯負相關。同時,PCDH10啟動子甲基化水平與主彎Cobb角呈正相關,PCDH10甲基化水平越高,主彎Cobb角越大,這提示PCDH10啟動子甲基化異常與AIS的進展有關[35]。

LBX1是一個在發育過程中起著重要作用的同源盒基因。既往研究表明,LBX1在骨骼肌組織中高表達,并在出生后的中樞神經系統和骨骼肌發育期間具有特定的調控表達模式[36-37]。最近的表觀遺傳學研究,為LBX1在AIS進展中的作用提供了新的證據。JANUSZ等[38]對57例AIS患者和20例非AIS患者的深層椎旁肌中LBX1啟動子區甲基化水平進行了檢測,以分析其與AIS發生及嚴重程度的相關性。結果顯示,除一個CpG位點外,AIS患者與非AIS患者之間的椎旁肌LBX1甲基化水平無明顯差異,而對比主彎Cobb角≤70°及Cobb角>70°的患者椎旁肌的LBX1啟動子區甲基化水平顯示,主彎Cobb角>70°的患者側凸凸側的反向鏈啟動子區的23個CpG序列中,有17個CpG位點甲基化水平明顯升高。因此JANUSZ等認為LBX1啟動子甲基化水平與AIS的發生無相關性,但與AIS的嚴重程度之間存在關聯。在嚴重的AIS患者中,凸側深層椎旁肌LBX1啟動子區域甲基化水平的不對稱性表達揭示了局部作用因素在AIS進展中的作用。

2 miRNA過表達

miRNA是微小非編碼RNA,廣泛存在于生物液體中,易于提取且其圖譜在長期臨床研究中相對穩定,是研究AIS的潛在生物標志物。miRNA參與了許多可以在表觀遺傳學上調節細胞發育和分化的生物過程。研究表明miRNA與骨骼代謝、成骨細胞、破骨細胞的分化密切相關,成骨細胞和破骨細胞的穩態失衡將影響骨細胞的形成、吸收及骨化,改變骨骼的機械強度[39]。因此,在脊柱成熟過程中保持骨代謝的最佳分子調控狀態十分重要。在AIS患者的成骨細胞和破骨細胞分化過程中,miRNA介導的信號傳導失衡,將改變骨形成和吸收的正確穩態,從而影響AIS患者的脊柱機械內環境,改變側凸的進程[40]。ZHANG等[41]通過分析AIS患者和對照組的骨活檢組織及來自這些樣本的原代成骨細胞,發現miR-145是一個潛在的干擾成骨細胞和骨細胞功能的上游調控因子,miR-145和β-catenin mRNA(CTNNB1)在AIS骨組織和原代成骨細胞中過表達,且兩者表達呈正相關。同時miR-145與血清硬化素、骨橋蛋白和骨保護素之間呈明顯負相關,通過敲除miR-145可下調β-catenin的表達及轉錄活性從而恢復受損的骨細胞活性。ZHANG等指出AIS患者miRNA異常表達及其對骨細胞功能的影響,可能導致AIS患者的骨量減少,而骨密度低被認為是AIS進展風險的獨立預測因素[42],因此建議將miR-145作為AIS預后評估的生物標志物。另一些研究對重度和輕度AIS患者及健康對照組的血漿樣本進行了miRNA表達譜分析,發現miR-151a-3p在重度AIS患者中過表達,而在患者原代成骨細胞中GREM1的表達降低,研究者認為miR-151a-3p過表達可能通過抑制成骨細胞中GREM1的表達來中斷骨穩態,從而促進脊柱側凸的進展,建議將其作為AIS預后的生物標志物[43]。

AIS椎旁肌凹凸側的運動單位電位振幅差異、凹凸側Ⅰ型纖維的比例失衡、肌肉體積和脂肪浸潤失衡、AIS兩側椎旁肌中褪黑素受體和轉化生長因子信號通路的不對稱表達等都表明椎旁肌可能在AIS的發生和進展中發揮重要作用[44]。有研究發現遺傳及環境因素通過影響表觀遺傳學基因組和椎旁肌的轉錄變化破壞脊柱的穩定性,影響側凸的進展。JIANG等[44]對5例AIS患者的5對椎旁肌進行RNA測序發現,ADIPOQ和H19在椎旁肌兩側存在明顯表達差異,凹側肌中H19表達水平相對較低、ADIPOQ表達水平較高、較大的側凸角度與發病年齡較小有關。JIANG等鑒定了由H19編碼的miR-675-5p是AIS中ADIPOQ表達的調控因子,miR-675-5p在AIS患者的凸側肌肉組織中高表達,其表達水平與H19呈正相關,與ADIPOQ呈負相關。miR-675-5p高表達可下調ADIPOQ的表達水平,而凸側肌肉中較低的ADIPOQ水平可能會導致凸側的椎旁肌無力,進而加速側凸的進展。

ZHANG等[25]在傳統預測模型的基礎上,引入表觀遺傳風險因素建立了一個新型復合邏輯回歸模型,以預測AIS進展高風險患者。在首次就診時收集患者最大Cobb角、初潮狀態、體重、Risser征并測量外周血中miR-145和P1NP的水平,再通過復合模型計算風險評分,當風險評分臨界值設置為0.2分時,其預測的靈敏度為91.7%,特異度為79.8%,靈敏度和特異度都遠高于傳統預測模型[45]。另外ZHANG等還計算了基礎危險比,初次就診時風險評分≥0.2分的患者與<0.2分的患者相比,進展為Cobb角>40°的風險高出27.9倍。這種新型預測模型在為醫生及治療師提供臨床決策參考,幫助進展高風險患者及時進行支具治療,同時避免進展低風險患者的過度醫療方面顯示出巨大潛力。

3 小 結

表觀遺傳學的發展為AIS進展風險因素的研究提供了新的方向。正如AIS一樣,遺傳及環境因素共同作用影響著脊柱側凸的進展,同卵雙胞胎脊柱側凸進展差異性的研究使人們更加確信表觀遺傳學因素在AIS進展中發揮重要作用。目前的研究結果顯示:一些DNA區域的低甲基化、基因啟動子的高甲基化和miRNA的過表達都與AIS的進展有關,這些研究結果有望為AIS的診療及預后提供更多參考。但目前的相關研究仍然較少,雖然組蛋白修飾也是經典的表觀遺傳學機制之一,但作者檢索文獻后并未找到組蛋白修飾在AIS進展方面的研究,因此未對這部分內容進行綜述。與此同時關于非編碼RNA的研究也較少,主要集中miRNA上,研究涉及樣本量均較少并且研究主要集中在外周血和側凸兩側椎旁肌的分析上。外周血雖然易于提取,但是特異度較差;而椎旁肌雖然擁有了較高的特異度,但是很難尋找健康對照,這些局限性將限制表觀遺傳因素在預測AIS進展中的可信度及實用價值。因此,對于AIS進展風險的評估仍然需要結合多種因素綜合考慮,同時未來還需要更多高質量的研究探討表觀遺傳學因素在AIS診療及預后中的應用價值。