晝夜溫差對茶鮮葉揮發性及非揮發性品質成分及相關生理指標的影響

陳林怡　郭豪　陳紅梅　張哿燁　廖露露　周婉婷　張夢雪　易志剛

關鍵詞：茶樹；晝夜溫差；茶葉香氣；茶葉滋味；生理指標

中圖分類號：S31 文獻標志碼：A

茶樹起源于我國云貴高原的深山密林之中[1]，是極具中國特色的經濟作物，在21 世紀初期，茶類飲品的消費量已成為世界上第二大無酒精飲料。隨著人們生活水平的提高，高品質茶越來越受到消費者的青睞。茶葉品質通常指茶葉的色、香、味、形[2]。茶葉的色澤、香氣和滋味均與茶樹新陳代謝所產生的生物化學物質息息相關。其中茶葉揮發性香氣化合物、氨基酸類次生代謝物、黃酮類次生代謝物質以及生物堿類次生代謝物質為茶樹主要的次級代謝產物，其含量決定著茶葉品質，其中，揮發性香氣化合物影響茶葉香氣，氨基酸類次生代謝物、黃酮類次生代謝物質以及生物堿類次生代謝物質則影響茶湯滋味[3-4]。茶樹次生代謝是其長期進化過程中與環境相互作用的結果，茶樹所處的生態環境影響茶樹的生長與茶葉品質[5]。

在影響茶樹生長及品質的眾多因子中，溫度是影響茶樹生長和光合作用的主要因素之一。溫度影響茶樹的酶促反應，決定茶樹中的酶活性，從而影響茶樹代謝，進而影響茶葉化學物質的形成、轉化和積累。有大量研究指出，晝夜溫差（differencebetween day and night temperature， DIF）對作物品質有顯著影響[6-8]，白天溫度較高有利于植物進行光合作用，促進光合產物形成；夜晚溫度較低，植物進行呼吸作用，有利于干物質積累[9-10]。研究指出，高山茶香氣高與高山茶園夜晚溫度較低有關，短期的低溫可誘導茶葉中脂肪氧化酶基因表達，促進茶葉芳香物質醇和醛的合成與釋放[11-12]。

許曉青[13]在葡萄果實發育過程中綠葉氣味物質的研究中發現青葉醛和青葉醇與晝夜溫差有顯著正相關關系。李莉等[14]研究發現在番茄花果期適當增大晝夜溫差可提高果實品質。李永菊等[15]指出在合適的晝夜溫差下，有利于增加茶葉的蛋白質、氨基酸、維生素等含量。BOO 等[16]通過研究指出，萵苣的總酚和花青素含量在較低晝夜溫度（13 ℃/10 ℃?20 ℃/13 ℃）下有所提高。鄭衛杰等[17]研究表明，最有利于文心蘭干物質積累和葉綠素合成的晝夜溫差是15 ℃。也有研究發現，晝夜溫差較大會刺激脫落酸產生，從而提高莖的伸長，有助于植物應對環境條件的變化[18-19]。

目前，人們對茶葉的需求量逐漸增加，對茶葉品質的要求也越來越高。福云六號是福建省特色茶樹，在全國主要產茶區均有分布，在生態和經濟方面具有極高價值。本研究以福云六號茶樹為研究對象，通過模擬溫差變化對茶樹光合作用、茶鮮葉揮發性香氣物質以及茶葉非揮發性品質成分含量的影響進行研究，從而初步明確晝夜溫差、光合作用與茶葉品質之間的聯系，為茶葉品質提升提供一定的科學理論依據，并且為茶園選址提供一定的參考，有利于茶產業更好地發展。

1 材料與方法

1.1 材料

選用2 年生福建省特色茶樹福云六號為研究對象。將茶樹種植于外口徑29.6 cm，內口徑25.4 cm，高19.7 cm，底部直徑17.8 cm 的花盆中，每個花盆中栽培3 株茶樹。茶樹盆栽緩苗3 個月后，選取3 盆長勢一致的植株，利用人工氣候箱進行控溫處理。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗設置4 個晝夜溫差（DIF）處理，分別為0 ℃（15 ℃/15 ℃）?5 ℃（20 ℃/15 ℃）?10 ℃（25 ℃/15 ℃）?15 ℃（30 ℃/15 ℃），4 個處理均每天光照12 h（6：00—18：00），光合有效輻射為200 μmol/（m²·s）（距離LED 燈板20 cm 處），空氣相對濕度為70%±5%。在人工氣候箱培養60 d 后進行樣品采集與分析。

1.2.2 光合參數測定 培養結束后， 利用LI-CORLI-6400 光合儀（ LI-COR Biosciences，USA）測定福云六號茶樹冠層處新展開葉片的凈光合速率（P_n）、氣孔導度（G_s）、胞間CO₂濃度（C_i）及蒸騰速率（T_r）等光合參數。具體測量方法參照文獻[20]。

1.2.3 葉片采集 光合參數測定結束后，摘取一芽四葉放干冰中暫存，隨后置于–80 ℃冰箱中保存，一部分用于茶鮮葉葉綠素含量和茶鮮葉揮發性香氣相關酶活性的分析，另一部分用冷凍干燥機進行凍干磨粉保存。

1.2.4 茶鮮葉揮發性物質分析 氣體樣品使用吹掃捕集儀（CDS7000E+7400， USA）-氣質聯用儀（7890B-5977A， Agilent Technologies， USA）分析。稱取經冷凍干燥粉碎后的茶樣0.5 g 于40 mL吹掃瓶中，加入5 mL 沸純水，迅速封口，放入自動進樣器（CDS7000E）進樣分析。吹掃捕集條件：吹掃流量為40 mL/min；吹掃時間為11 min；脫附溫度為200 ℃；脫附時間為5 min；烘烤溫度為230 ℃；烘烤時間為5 min。GC 條件：選用DB-624 色譜柱（60 m×250 μm×1.4 μm）；氦氣為載氣；柱流量為1.5 mL/min；設置初始溫度為40 ℃，保持2.5 min，然后以3 ℃/min 升溫到180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持3 min；離子源為電子轟擊源（EI）；電壓為70 eV。數據采集使用全掃描模式（Scan），采用標準的質譜圖庫（NIST14）進行檢索，香氣物質的定性和定量方法具體參照文獻[21]。

1.2.5 茶鮮葉非揮發性品質成分指標測定 茶多酚的測定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；游離氨基酸的測定參照GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量的測定》；咖啡堿的測定參照GB/T 8312—2013《茶咖啡堿測定》； 水浸出物的測定參照GB/T8305—2013《茶水浸出物測定》；總黃酮含量的測定采用分光光度法，具體方法參照文獻[22]；可溶性糖含量的測定采用蒽酮法。

1.2.6 茶鮮葉生理指標測定 葉綠素指標測定參照《植物生理學實驗教程》[23]；鮮葉的β-葡萄糖苷酶活性、β-櫻草糖苷酶活性和脂氧合酶活性測定均使用試劑盒（上海優選生物科技有限公司），試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

1.3 數據處理

使用SPSS 18 軟件單因素方差分析（one-wayANOVA）對茶葉品質指標、茶樹光合參數及茶鮮葉揮發性香氣相關酶活性進行顯著性分析，利用LSD 法比較組間差異，對茶樹光合作用參數及茶葉非揮發性品質成分含量進行Pearson 相關性分析；采用Origin 2022 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 晝夜溫差變化對茶鮮葉揮發性香氣化合物的影響

對不同溫差處理的茶鮮葉樣品的揮發物成分進行分析鑒定，經NIST 標準譜庫檢索，對各峰加以確認后用峰面積歸一法進行定量分析，以各組分的峰面積占總峰面積的百分比表示組分的相對含量。將各物質進行分類，茶鮮葉樣品的揮發物成分分為醇類、酯類、醛類、烯烴類、酸類、酮類、雜氧化合物、碳氫化合物和其他。在不同溫差處理下，檢測出的揮發性香氣種類及相對含量有所差異（表1，圖1）。其中，在晝夜溫差為0 ℃時，醇類物質占比最高（39.56%），其次為醛類（35.41%）；而在其他溫差處理下，醛類物質占比最高，其次為醇類。香氣成分方面，正己醛、青葉醛、青葉醇、2-乙基己醇的相對含量在各溫差處理下較高，最高相對含量分別為39.94%（15 ℃）、47.21%（5 ℃）、7.26%（0 ℃）、25.60%（0 ℃）。

2.2 晝夜溫差變化對茶鮮葉非揮發性品質成分的影響

在晝夜溫差為15 ℃時，顯著增加了茶鮮葉的游離氨基酸和咖啡堿含量，并且顯著降低了總黃酮含量與酚氨比（P<0.05）（表2）。在晝夜溫差為0 ℃處理下，茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿含量最低，分別為9.81%、1.39%、1.43%，水浸出物、總黃酮、可溶性糖含量與酚氨比最高。在晝夜溫差為15 ℃時，茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿含量最高，分別為11.00%、3.39%、3.65%。與晝夜溫差為0 ℃處理相比，隨著晝夜溫差的增大，茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿含量也隨之增大，其中晝夜溫差為15 ℃處理下的游離氨基酸含量與咖啡堿含量顯著高于其他處理（P<0.05），而水浸出物、總黃酮、可溶性糖含量和酚氨比隨晝夜溫差的增大而降低，其中晝夜溫差為15 ℃處理下的總黃酮含量與酚氨比顯著低于其他處理（P<0.05）。

2.3 晝夜溫差變化對茶樹光合參數的影響

茶樹生長離不開光合作用，光合作用是綠色植物的基本功能，而其中溫度是影響光合速率的重要因素之一。由圖2 可知，晝夜溫差變化影響茶樹的光合參數。凈光合速率（P_n）隨晝夜溫差的增大而增加，表現為晝夜溫差15 ℃>10 ℃>5 ℃>0 ℃，且10 ℃與15 ℃晝夜溫差處理下的Pn 顯著大于其他處理（P<0.05）。在不同晝夜溫差處理下，晝夜溫差增大使福云六號葉片氣孔導度（G_s）增加，在晝夜溫差為15 ℃時最高，達到顯著水平（P<0.05）。胞間二氧化碳濃度（C_i）在晝夜溫差為10 ℃時最低，其他處理間無顯著差異（P>0.05）。蒸騰速率（T_r）則隨晝夜溫差的增大而增加，在晝夜溫差為15 ℃時達到顯著水平（P<0.05）。

由表3 可知，葉綠素a 與葉綠素b 隨晝夜溫差的增大而出現先增加后下降的趨勢，在晝夜溫差為10 ℃時葉綠素含量最高，與晝夜溫差為0 ℃處理相比，10 ℃晝夜溫差處理的葉綠素a 與葉綠素b 含量分別增加了57.0%和54.3%，且效果顯著（P<0.05）。類胡蘿卜素則在晝夜溫差為10 ℃時含量最高，在晝夜溫差為15 ℃時含量最低，與0 ℃晝夜溫差處理相比晝夜溫差為15 ℃時類胡蘿卜素含量顯著降低44.4%（P<0.05），其他處理均無顯著差異（P>0.05）。

2.4 晝夜溫差變化對茶鮮葉揮發性香氣相關酶活性的影響

如圖3 所示，溫度顯著影響β-葡萄糖苷酶、β-櫻草糖苷酶和脂氧合酶活性（P<0.05）。β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶活性隨晝夜溫差的增大呈現先增后降的趨勢，并在晝夜溫差為5 ℃時該酶活性最高。而脂氧合酶活性則隨晝夜溫差的增大呈現先降后增的趨勢，與晝夜溫差為0 ℃時相比，晝夜溫差為5 ℃時，脂氧合酶活性下降35.08%，差異達顯著水平（P<0.05）。

2.5 茶樹生理指標與茶鮮葉非揮發性品質成分的相關性分析

將不同溫差處理下福云六號茶樹光合參數與茶鮮葉非揮發性品質成分含量進行相關性分析。結果表明，茶樹光合參數與茶鮮葉非揮發性品質成分含量具有一定的相關性。其中，P_n與游離氨基酸（FAA）含量呈極顯著正相關，與咖啡堿（Caf）含量呈顯著正相關，相關性系數（r）分別為0.848和0.679，與可溶性糖（SS）含量呈顯著負相關，與酚氨比（P/A）呈極顯著負相關（r=–0.724）。Gs 與FAA 含量呈顯著正相關，T_r 與FAA、Caf含量呈極顯著正相關，與總黃酮（TF）含量呈顯著負相關，與P/A 呈極顯著負相關（r=–0.718）。Chl （a/b）與FAA、Caf 含量呈極顯著負相關，r 分別為–0.728 和–0.816，而與TF 含量呈顯著正相關。Car 與FAA 含量呈顯著負相關，與Caf 含量呈極顯著負相關（r=–0.724），而與可溶性糖（SS）呈顯著正相關（圖4）。

3 討論

3.1 茶鮮葉揮發性香氣成分對晝夜溫差的響應

茶葉香氣是由茶葉中的揮發性香氣化合物所形成，是茶葉重要的感官品質之一，也是決定茶葉品質的重要因子之一。茶葉的香型與香氣很大程度上取決于茶樹體內合成的不同香氣化合物及香氣化合物含量。目前在茶葉中發現700 多種芳香物質，將其分為醇類、醛類、酮類、酯類、碳氫化合物、雜環化合物等，其中醇類、醛類、酯類和碳水化合物含量相對較高[24-25]，本研究也證實了這一觀點。本研究發現茶鮮葉揮發性成分中的醇類和醛類相對含量最大，其中2-乙基己醇、青葉醛、青葉醇和正己醛的相對含量較高，2-乙基己醇、青葉醛和青葉醇呈現青草氣，正己醛則具有果香。茶鮮葉的揮發性成分種類與主要香氣成分的相對含量隨溫差變化有所差異，本研究中的青葉醇相對含量隨晝夜溫差的增大而降低，這與WANG 等[26]的研究結果類似。香氣化合物的合成與釋放離不開酶活性，溫度變化是影響酶活性的因素之一。β-葡萄糖苷酶、β-櫻草糖苷酶和脂氧合酶是產生茶鮮葉揮發性香氣成分的重要酶。在茶鮮葉中許多香氣成分以糖苷形式存在，主要以葡萄糖苷和櫻草糖苷為主，分別被β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶水解釋放，而脂氧合酶則是產生醇、醛、酯類等小分子物質的關鍵酶。在本研究中，β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶活性隨晝夜溫差的增大呈先增后降的趨勢，并在晝夜溫度為20 ℃/15 ℃時酶活性最高，這與趙芹等[27]的研究結果類似。趙芹等[27] 研究發現溫度在15～20 ℃時茶葉酶活性最高，酶活性隨溫度的升高而降低。本研究發現溫度變化顯著影響β-葡萄糖苷酶、β-櫻草糖苷酶和脂氧合酶活性，這可能是茶鮮葉揮發性香氣成分的相對含量與氣味存在差異的原因。茶鮮葉香氣成分的相關性酶與其基因的表達在茶樹次生代謝過程中發揮著重要作用，晝夜溫差變化如何影響茶鮮葉揮發性品質相關代謝物有待深入研究。

3.2 茶鮮葉非揮發性品質成分對晝夜溫差的響應

溫度變化對茶葉非揮發性品質成分產生了顯著影響。茶多酚是茶葉品質成分中重要的化學成分，是決定茶湯濃度的重要物質，茶多酚含量適量增加有利于茶葉品質的提升。在本研究中，晝夜溫差增大，茶多酚含量增加，這可能是溫度升高促進茶樹進行光合碳代謝，使多酚類物質合成積累較多。XIANG 等[28]在兒茶素相關基因表達調控兒茶素生物合成對溫度變化的響應研究中發現，溫度升高使茶樹新梢生長加快，總兒茶素、總酯化兒茶素等含量增加，與本研究結果類似。游離氨基酸含量不僅作為茶樹氮庫的數量表征還直接影響茶湯鮮爽度[29-30]。本研究發現，晝夜溫差增大，游離氨基酸含量顯著增加，并在晝夜溫差為15 ℃時其含量達到最大，這可能是晝溫升高加快了蛋白質和多肽在酶的催化下水解[31]，使茶樹葉片中的氨基酸含量增加，同時說明晝夜溫差的增大能提高茶湯的鮮爽度。酚氨比則反映了茶葉的適制性，也是衡量茶湯鮮爽度的重要指標之一，酚氨比越小，滋味越醇，越鮮爽，茶葉品質越好[32]。本研究發現晝夜溫差增大，酚氨比顯著降低，并在晝夜溫差為15 ℃時酚氨比達到最低，這說明晝夜溫差增大有利于低品質茶葉原料改良，有利于提高茶葉品質。并且本研究相關性分析發現，游離氨基酸、咖啡堿、可溶性糖含量和酚氨比與茶樹光合參數之間有一定相關性，說明晝夜溫差的變化可能影響茶樹的光合作用，進而對茶葉次生代謝產物產生一定影響，茶葉次生代謝產物對光合作用的響應機制是值得深入研究的科學問題。

3.3 茶樹凈光合速率對晝夜溫差的響應

溫度是影響茶園生態的重要環境因子之一，溫度變化對茶樹光合作用有重要影響[33-34]。白天溫度高可促進光合作用，而夜晚溫度低可以減少呼吸作用的消耗[35]。本研究中，晝溫升高，晝夜溫差增大，凈光合速率顯著升高，這與袁小康[36]、BUNCE[37]、毛麗萍等[38]的研究結果一致，這可能是因為晝夜溫差增大使光合作用關鍵酶rubisco的活性被激化，提高了葉肉細胞的光合活性，從而促進光合速率的增加。植物光合作用不僅受溫度、光照等環境因子的影響，還與植物自身的生理生態息息相關，其中葉綠素含量對植物光合速率的影響更為直接。楊再強等[39]研究表明增加葉綠素含量可以有效提高植物對光能的捕獲能力，促進光能傳遞，從而促進光合速率的提高。在本研究中，葉綠素含量隨溫差增大而升高，并且在晝夜溫差為10 ℃（25 ℃/15 ℃）時葉綠素與類胡蘿卜素含量達到最大，這與楊再強等[39]的研究結果一致，說明在晝夜溫差為10 ℃（25 ℃/ 15 ℃）處理下有利于光合色素的合成，光合活性更好，促進了光合速率的提高。而在晝夜溫差為0 ℃（15 ℃/15 ℃）與15 ℃（30 ℃/15 ℃）處理下的葉綠素與類胡蘿卜素含量較低，這可能是茶樹處于低溫或高溫的狀態下使葉綠體結構遭到破壞，影響了光合色素的合成[40-41]。由此發現溫度的高低均會對茶樹葉綠素含量產生影響，進而影響茶樹凈光合速率。茶樹光合作用是重要且復雜的化學過程，是茶樹生產的物質基礎，其中溫度對茶樹光合作用的影響需要進一步探究。

4 結論

晝夜溫差變化影響茶樹光合作用，進而對茶鮮葉揮發性與非揮發性品質成分產生一定影響。晝夜溫差增大，醛類物質相對含量提高，其中正己醛的相對含量隨晝夜溫差的增大而增大，并在晝夜溫差為15 ℃時達到最大，但青葉醇的相對含量則隨晝夜溫差的增大而降低。晝夜溫差的變化顯著影響茶鮮葉揮發性香氣化合物相關酶活性，其中β-葡萄糖苷酶與β-櫻草糖苷酶活性在晝夜溫差為5 ℃時最大，脂氧合酶活性則相反。就非揮發性品質而言，晝夜溫差的增大顯著增加游離氨基酸含量，顯著降低酚氨比，使茶湯更加鮮爽。茶樹凈光合速率與游離氨基酸含量呈極顯著正相關關系，而與酚氨比呈極顯著負相關關系。開展晝夜溫差等環境因子對茶鮮葉揮發性及非揮發性品質成分影響的研究，不僅能為高山出好茶提供理論依據，還可為茶園選擇和茶樹種植提供實際參考。