煙草葉斑病菌Cumuliphoma indica的生物學特性及室內藥劑篩選

安宣鮮　桑維鈞　張得平　李昊熙　楊江敏　雷雪梅　王五權　楊茂發

關鍵詞：煙草；葉斑病；Cumuliphoma indica；生物學特性；藥劑篩選

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A

煙草（Nicotiana tabacum L.）隸屬于茄科煙草屬，原產于美洲，是一年生的草本植物，其葉是煙草產品生產中最主要的材料，是世界上種植十分普遍的一種重要經濟作物[1-2]。近年來，隨著煙草種植制度的改變，氣候條件變化，品種單一以及煙草連作障礙等問題的加重，煙草病害流行范圍變廣，危害程度愈發嚴重，經濟損失也越來越大[3-6]。其中，煙草葉斑類病害是煙草生產上威脅最大的病害之一，在煙草的整個生育期都有發生，可直接導致煙草產量下降，品質降低[7-8]。

2021 年，課題組在廣西壯族自治區賀州市發現一種發生在煙草生育中后期，病斑為白色，外周有黃色暈圈的葉斑病，對病原進行了分離鑒定，明確該病原菌為Cumuliphoma indica，此為國內該病原菌在煙草上的首次報道[9]。C. indica 隸屬于子囊菌門（ Ascomycota ）、腔菌綱（ Loculoascomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、亞隔孢殼科（Didymellaceae）、Cumuliphoma 屬[10]。Cumuliphoma是2018 年VALENZUELA-LOPEZ 等建立的新屬，其模式種為C. omnivirens，該模式種由基物異名Phoma omnivirens 新組合而來[10]。早在2009 年AVESKAMP 等[11]報道了P. omnivirens 可引起菊科、豆科和白花丹科多種植物病害。2018年，江艷等[12]將在貴州發生的煙草莖點病的病原鑒定為P. omnivirens，其后，商勝華等[13]的研究明確了P. omnivirens 菌絲生長的最適培養基為牛肉膏蛋白胨培養基、燕麥培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，最適溫度為30 ℃，最適pH 為10，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣，致死溫度為58 ℃，以及發現3%中生菌素對該病原菌菌絲生長的抑制效果最好。

2021 和2022 年對廣西壯族自治區主要植煙區煙草真菌性葉斑病害種類的調查發現，該病害在鐘山縣公安鎮、燕塘鎮以及富川瑤族自治縣朝東鎮、石家鄉、福利鎮、新華鄉、柳家鄉等鄉鎮均有發生，田間發病率在30%左右，該病對煙葉生產具有潛在的危害性。目前，關于C. indica生物學特性以及防治方面的研究基本處于空白，亟待進一步研究。本研究通過測定分離菌株的致死溫度以及不同培養基、溫度、pH、碳氮源、光照周期對菌絲生長的影響，以明確C. indica 的生物學特性，同時探究9 種化學藥劑對病原菌生長的抑制作用，旨在為該病害的有效防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2021 年，采用常規組織分離法[14]從15 份廣西壯族自治區賀州市鐘山縣煙草（品種：K326）病葉樣品中分離得到2 株C. indica 菌株（編號分別為HZGA75、HZGA79），保存于貴州大學煙草學院植物病理實驗室， 選用菌株HZGA75 用于后續試驗研究。

1.1.2 供試培養基供試培養基分別為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA，青島高科技工業園海博生物技術有限公司）、玉米粉瓊脂培養基（CMA，北京索萊寶科技有限公司）、察氏培養基（CDA，北京索萊寶科技有限公司）、燕麥培養基（OA，北京索萊寶科技有限公司）和自配番茄汁瓊脂培養基（TomA，自配）、山藥汁瓊脂培養基（YA，自配）、煙葉汁瓊脂培養基（TobA，自配）和水瓊脂培養基（WA，自配）。自配培養基配方參照方中達[14]的方法等量配比。

1.1.3 供試藥劑本試驗所用的殺菌劑種類、廠家及處理濃度詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物學特性研究（1）不同類型培養基對病原菌菌絲生長的影響。將菌株HZGA75接在PDA 平板上于28 ℃全黑暗培養3 d。采用內徑為5 mm 的無菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，菌絲面朝下（下同）接種至上述8 種培養基上，每個培養基3 個重復，置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養。培養7 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑[15]。下同。

（2）溫度對病原菌菌絲生長的影響。將5 mm的菌餅接種在新的PDA 培養基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃的恒溫培養箱中黑暗培養7 d，每個處理3 次重復[16]。

（3）pH 對病原菌菌絲生長的影響。以PDA為基礎培養基，用1% HCl 和1% NaOH 溶液調配培養基的pH 為8 個不同梯度（4、5、6、7、8、9、10、11），將5 mm 菌餅接在培養皿中央，置于恒溫培養箱中黑暗培養7 d，每個處理重復3次[17]。

（4）碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響。以察氏培養基（CDA）為基礎培養基，以不加碳源的察氏培養基為對照，將培養基中的蔗糖用相同含量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、肌醇、山梨糖醇和可溶性淀粉替代；同理，以不加氮源的查氏培養基為對照，以等量的蛋白胨、硝酸銨、牛肉浸粉、氯化銨，尿素、甘氨酸、丙氨酸代替培養基中的硝酸鈉，將5 mm 菌餅分別接在含不同碳氮源的培養皿上，置于恒溫培養箱中黑暗培養7 d，每個處理重復3 次[18]。

（5）光照周期對病原菌菌絲生長的影響。將5 mm 的菌餅接在PDA 培養基中央，分別置于28 ℃恒溫培養箱中進行24 h 持續光照、L/D=12 h/12 h 光暗交替和24 h 持續黑暗培養7 d，每個處理重復3 次[19]。

（6）菌絲致死溫度測定。將5 mm 的菌餅接入裝有1 mL 無菌水的離心管中，分別于40、45、50、55、60、65 ℃的恒溫水浴鍋中持續處理10 min（提前預熱1 min），計時結束后立即置于常溫水中冷卻至室溫，隨后將處理的菌餅接種于無菌PDA 培養基中央，于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養7 d，每個處理3 次重復[20]。

1.2.2 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用采用菌絲生長速率法測定9 種藥劑對菌株HZGA75菌絲生長的抑制效果。經初篩得出各藥劑的試驗終濃度（表1）。將不同濃度的藥劑溶液加入PDA培養基中充分混勻，制作表1 濃度的含藥平板，以添加相同體積無菌水的PDA 平板作為對照，每個處理設3 次重復。接菌后將平板置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，7 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑不同劑量處理對病原菌菌絲生長的抑制率，并求出各藥劑對病原菌的抑制中濃度（EC₅₀）[21]。

抑制率=（對照菌落直徑–處理菌落直徑）/（對照菌落直徑–菌餅直徑）×100%。

1.3 數據處理

試驗數據使用 Excel 2010 和SPSS Statistics 26軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌的生物學特性

2.1.1 不同類型培養基對病原菌菌絲生長的影響菌株 HZGA75 在8 種供試培養基上均可生長，在CMA、CDA 兩種培養基上生長最快，二者間無顯著差異，但顯著優于其他6 種培養基；在CDA 培養基上培養7 d 后菌落直徑達到60.50 mm；在WA培養基上生長最慢，其次是TomA 培養基（圖1）。

2.1.2 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響菌株HZGA75 在10～30 ℃范圍內均可生長且差異顯著；在5 ℃和35 ℃下菌株菌絲均不生長；在溫度為28 ℃時菌絲生長最快，顯著高于其他溫度處理，培養7 d 后菌落直徑分別達到43.83 mm（圖2）。因此28 ℃為該病原菌菌絲生長的最適溫度。

2.1.3 不同pH 對病原菌菌絲生長的影響。菌株HZGA75 對酸堿度的適應范圍廣，在pH為4～11范圍內均可生長（圖3）。在pH 為5 時的菌落直徑顯著大于其他處理， 培養7 d 后分別達到38.33 mm。在pH 為4 時菌落直徑與其他處理有顯著差異，培養7 d 后僅達到18.50 mm。

2.1.4 不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響菌株 HZGA75 在8 種不同的碳、氮源培養基上均可生長。在供試碳源中，菌株HZGA75 對可溶性淀粉的利用效果最佳，培養7 d 后菌落直徑達66.33 mm；在以甘露醇為碳源的培養基上菌落直徑均明顯小于對照，但是對照的菌落菌絲生長極為稀疏（圖4）。

在供試氮源中，菌株HZGA75 對蛋白胨的利用效果最佳，其生長速度顯著高于其他氮源處理，培養7 d 后菌落直徑分別為64.83 mm（圖5）。

2.1.5 不同光照周期對病原菌菌絲生長的影響光照處理對病原菌菌絲生長有顯著性影響。菌株HZGA75 在持續光照培養條件下生長最快，培養7 d 后菌落直徑可達47.16 mm，其次是在光暗交替的條件下；在連續黑暗處理下最慢，培養7 d后菌落直徑分別為35.00 mm（圖6）。

2.1.6 致死溫度測定菌株 HZGA75 在45 ℃處理后菌絲均能生長，在50 ℃處理下則未生長。再以45 ℃為起始溫度，1 ℃為梯度進行逐漸升溫水浴處理，結果顯示經≥49 ℃的溫度水浴10 min處理后菌絲在培養基上不再生長，因此推斷病原菌菌絲的致死溫度為49 ℃水浴10 min。

2.2 殺菌劑對病原菌菌絲生長的抑制作用

由表 2 可知，9 種殺菌劑對菌株HZGA75 菌絲生長表現出不同的抑制作用，其中50%啶酰菌胺WG 的抑制效果最好，EC₅₀為0.025 mg/L；其余依次為50%咯菌腈FS、500 g/L 異菌脲SC、450 g/L 咪鮮胺EW、80%代森錳鋅WP、10%苯醚甲環唑ME、25%吡唑醚菌酯SC和40%腈菌唑SC，EC₅₀分別為0.084 mg/L、0.217 mg/L、1.354 mg/L、6.565 mg/L、9.576 mg/L、34.237 mg/L 和38.804 mg/L；430 g/L 戊唑醇SC 的抑制效果較差，EC50 為42.574 mg/L。

3 討論

Cumuliphoma 是VALENZUELA-LOPEZ 等[10]通過系統發育分析新建立的屬，該屬真菌可存在于土壤、植物以及人類呼吸道中。目前，有關C. indica引起植物病害方面的報道除本課題組報道的煙草葉部病害外[9]，關于其生物學特性和防治方面的研究未見報道。本研究對已分離鑒定的病原菌菌株HZGA75 進行了生物學特性測定及有效殺菌劑的篩選。其生物學特性研究結果表明，病原菌可在10～30 ℃的溫度范圍內生長，28 ℃時病原菌菌絲生長最快，菌絲最低致死溫度為49 ℃水浴10 min，此結果與VALENZUELA-LOPEZ 等的研究結果存在差異，同時與同屬真菌C. omnivirens的生物學特性存在較大差異，導致該差異的原因可能與不同寄主、地域以及物種進化有關。供試菌株對酸堿度的適應性較廣，在pH 為4～11 的范圍內菌絲均可生長，pH 為5 時病原菌菌絲生長最快，其次是pH 為6，說明弱酸性的環境更適于該菌菌絲生長。供試菌株可利用多種碳、氮源，在供試的8 種碳源和8 種氮源的培養基上均可生長，病原菌最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源均為蛋白胨。由于本研究的供試菌株HZGA75 分離自廣西壯族自治區賀州市，該地區屬于中亞熱帶季風氣候區，具有雨熱同季、高溫高濕的氣候條件[22]，適宜該病原菌的生長。同時賀州市大部分地區土壤偏酸性[23]，且前人研究分離的C. indica 菌株可來自于土壤[11]，推測土壤可作為該病原菌生存的重要場所，在條件適宜的情況下可對煙草葉片進行侵染，該病原菌引起的煙草葉斑病在賀州市煙區存在一定的潛在危害。針對該病原菌引起的病害，在生產上應加強田間管理以及水肥合理管控來預防病害的暴發流行。

現階段化學防治仍是煙草葉部病害防治中最有效的方法。鑒于C. indica 較難培養產孢，本研究采用菌絲生長速率法測定了9 種化學藥劑對病原菌菌絲生長的影響，結果表明50%啶酰菌胺WG 對病原菌菌絲生長的抑制效果最佳，EC₅₀為0.025 mg/L， 其次為50%咯菌腈FS，EC₅₀為0.084 mg/L。已有研究表明啶酰菌胺對煙草生產中出現的赤星病、灰霉病、Didymella segeticola葉斑病、煙葉霉爛病等葉部病害的病原菌均有較好的抑制效果和病害防效[24-27]。為此，在生產上可選用50%啶酰菌胺WG 對C. indica 葉斑病進行防治。