口腔鱗狀細胞癌耐藥的表觀遺傳學調控研究進展△

嚴心悅，王雅梅

首都醫科大學12022 級口腔醫學“5+3”一體化專業，2 基礎醫學院生化與分子生物學系，北京 100069

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是發生于口腔中舌、口底、頰、唇以及牙齦等部位黏膜層，以鱗狀上皮細胞為主的惡性腫瘤，發生例數占口腔癌的90%以上。依據國家癌癥中心發布的2016 年全國統計數據，中國OSCC 新增患者約21.1 萬，是中國第二十大腫瘤[1]。雖然口腔腫瘤臨床診斷較容易，由于患者就診時大多已處于晚期且治療效果受獲得性耐藥的嚴重制約，OSCC 患者的5 年生存率僅為50%～60%，其療效的提升一直是臨床難點之一。目前，以手術為主的綜合治療是臨床OSCC 的主要治療方式。分子靶向藥物的出現使得藥物治療的有效性得到明顯提高，藥物治療在腫瘤治療策略中占比隨之增大，耐藥對藥物治療效果的影響也更為關鍵[2]。化療藥物通過DNA 損傷、促進細胞凋亡等方式殺滅腫瘤細胞，而表觀遺傳修飾可通過影響靶向通路中相關基因的表達削弱或增強藥物對腫瘤細胞的殺傷力，即影響腫瘤對藥物的敏感性。由于表觀遺傳學的易受干擾性與可逆性，人為干預可改變表觀遺傳學修飾從而實現腫瘤耐藥的逆轉。因此，了解OSCC 耐藥的表觀遺傳學調控分子機制，可以為尋找潛在的診斷標志物和有效的治療靶點提供新策略，對提高OSCC 患者臨床治愈率和總生存率有重要的意義。本文綜述DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）、染色質重塑對OSCC 耐藥的表觀遺傳學調控機制研究進展，以期為OSCC 耐藥抵抗研究提供參考。

1 DNA 甲基化異常與OSCC 耐藥

DNA 甲基化是在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，甲基共價加成到CpG 島的胞嘧啶環，阻止轉錄從而抑制基因的表達，而DNA 去甲基化則可恢復基因表達。OSCC 耐藥是由于藥物作用通路中關鍵基因的異常甲基化導致表達異常，從而減弱通路對腫瘤細胞的殺傷力。較為常見的有DNA 損傷修復基因與促凋亡基因的高度甲基化，可使凋亡通路難以激活，藥物轉運基因與腫瘤干細胞標志基因的低甲基化可降低細胞內藥物濃度和敏感性。全基因組甲基化水平改變也能影響腫瘤細胞的耐藥性，但機制至今尚未清楚[3]。

DNA 甲基化引起的OSCC 耐藥中，細胞凋亡通路是抗耐藥治療的一大靶點，抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡的脆性組氨酸三聯體二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，FHIT）高甲基化后，OSCC 細胞對化療失去敏感性[4]。促細胞凋亡調控因子B 細胞淋巴瘤/白血病-2 相關X 蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2-associated X protein，BAX）也在OSCC 的發展及耐藥過程中表達下調，其基因的改變、超甲基化及通過對p53/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路的調控，均對疾病進展和耐藥過程起重要作用[5]。Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）同樣也能夠通過抑制細胞凋亡促進腫瘤細胞耐藥，耐順鉑的OSCC 細胞系在YAP基因敲除后重新顯示對順鉑的敏感性[6]，可以推測YAP基因的轉錄與表觀遺傳調控因子表達可能作為逆轉耐藥的靶點[7]。靶向藥物轉運體的耐藥調控基因，如ATP 結合盒亞家族A 成員2（ATP binding cassette subfamily A member 2，ABCA2）及其單核苷酸多態性（single nucletide polymorphism，SNP），與將藥物隔離于溶酶體從而降低細胞內藥物濃度過程相關，但具體機制尚不清楚[8]。脂載蛋白2（lipocalin 2，LCN2）過表達同樣在耐藥機制中產生促進作用，而維生素D可以通過增強LCN2甲基化從而抑制其表達，增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性[9]。不僅是核DNA，作為順鉑主要靶點的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）甲基化改變也可能影響OSCC對順鉑的反應性。細胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome c oxidaseⅠ，COX1）和細胞色素b（cytochrome b，CYTB）基因已經在順鉑耐藥細胞系mtDNA 中被檢測到高甲基化，但甲基化改變致使耐藥的機制尚需進一步的研究證實[10]。

2 ncRNA 與OSCC 耐藥

在ncRNA 對OSCC 耐藥性的影響中，微小RNA（microRNA，miRNA）最為主要，其通過兩個途徑調節腫瘤耐藥：直接參與生物蛋白與大分子的代謝和通過與目標信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）互補結合來下調基因表達[11-12]，從而干涉跨膜轉運蛋白、上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、DNA 損傷修復、自噬等藥物治療中的關鍵步驟。而長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）大多通過海綿化或直接調控miRNA 的表達及作用參與OSCC 的耐藥，此外還能通過直接識別藥物轉運蛋白和調控自噬基因表達途徑調節腫瘤耐藥[13]。環狀RNA（circular RNA，circRNA）在OSCC 發展過程中起重要作用，但其對耐藥的調控機制還需要深入研究[14]。

miRNA 可以通過影響信號通路來影響OSCC耐藥性，如miRNA-365-3p 通過抑制ETS 同源因子（ETS homologous factor，EHF）/角蛋白16（keratin 16，KRT16）/β5-整合素/細胞間充質-上皮轉換因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）信號轉導調節5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐藥性[15]；miRNA-654-5p 通過生長因子受體結合蛋白2 相關銜接蛋白（growth factor receptor bound protein 2 related adaptor protein，GRAP）介導的RAS/促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路促進OSCC 對順鉑和5-FU 的耐藥性[16]。miRNA 還可以通過直接干預基因的表達影響OSCC 耐藥性：OSCC 細胞外泌體中的miRNA-21通過調節磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因和程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）基因的表達誘導順鉑耐藥[17]；miRNA-22直接通過下調賴氨酸乙酰轉移酶6B（lysine acetyltransferase 6B，KAT6B）基因的mRNA抑制其表達進而增加舌癌細胞對平陽霉素的敏感性；miRNA-24、miRNA-23a、miRNA-181a、miRNA-15b、miRNA-21 等miRNA 也都與舌癌順鉑耐藥機制相關[18-22]。在細胞凋亡受阻引起的耐藥中，piwi-交互RNA（piwi-interacting RNA，piR）-1037 可通過抑制OSCC 細胞凋亡而增強其對順鉑的耐藥性；相反，piR-39980 誘導細胞內多柔比星積累、DNA 損傷和細胞凋亡，從而增加纖維肉瘤對多柔比星的敏感性[23]。而在內質網應激引起的耐藥中，miRNA-340-5p 靶向內質網應激轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和PRKR 樣內質網激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）影響OSCC 細胞的增殖和耐藥[24]。腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）在化療耐藥、復發、轉移中發揮著關鍵作用，因此CSC 的存在是OSCC 轉移、復發和治療失敗的主要原因。研究表明，lncRNA 同形盒A10 反義RNA（homeobox A10 antisense RNA，HOXA10-AS）可以通過miRNA-29a/髓細胞白血病序列1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）/磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT 軸增強OSCC 中CSC 的干細胞特性[25]。EMT 導致耐藥的機制已有報道，lncRNA 可以通過直接或間接改變EMT 程序來促進腫瘤的發生、發展以及耐藥[26]。針對lncRNA 對OSCC 耐藥的影響，CRISPR-Cas9技術作為一種新興的可靶向lncRNA 進行精準編輯的基因編輯技術，在OSCC 耐藥中的作用正在被研究[27]。

3 組蛋白修飾與OSCC 耐藥

參與OSCC 耐藥的組蛋白修飾主要包括由組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HAT）與組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）介導的乙酰化，組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase，HMT）、組蛋白去甲基化酶（lysine-specific demethylase，LSD）和包含jumonji 結構域（jumonji domain containing，JMJD）家族介導的甲基化。乙酰化與甲基化通過調控相關基因表達、自噬、EMT 和分子代謝等過程調節耐藥。值得注意的是，HAT 大多促進腫瘤耐藥，但其作為靶點的抑制劑還沒有應用到臨床治療中[28]。

HDAC 的積累被證明與腫瘤相關，其抑制劑對耐藥抵抗有很大的開發潛能，臨床上也已經有較多研究應用。Tavares 等[29]對HDAC6 在口腔癌CSC 介導的化療耐藥研究中發現，在順鉑耐藥細胞系和CSC 細胞系中都出現了HDAC6 的積累、DNA 損傷和過氧化物還原酶2（peroxiredoxin 2，PRDX2）表達升高，而HDAC6 抑制劑tubastatin A可增加氧化效應、修復DNA 損傷并下調PRDX2 的表達，誘導細胞凋亡。Liang 等[30]研究發現，4SC-202（一種新的選擇性Ⅰ類HDAC 抑制劑）通過干涉miRNA-429/miRNA-1181 介導的mRNA 降解來抑制轉錄因子性別決定區Y-盒轉錄因子2（sex determining region Y-box transcription factor 2，SOX2）的表達，從而降低OSCC 的耐藥性，且聯合治療效果顯著。抑制腫瘤DNA 修復過程的藥物如多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]家族抑制劑也是研究焦點，然而OSCC 對PARP 抑制劑耐藥性的機制至今未被完全解釋清楚。現有的耐藥機制提出，可能是組蛋白乙酰轉移酶p300/CBP 相關因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）缺失導致復制叉穩定阻礙了細胞死亡，組蛋白的多聚ADP-核糖基化修飾等也通過染色質重塑對腫瘤耐藥產生了影響[31]。針對PARP抑制劑的耐藥情況，聯合使用對染色質修飾蛋白有影響的強效選擇性小分子抑制劑如溴化結構域蛋白抑制劑JQ1、PARP 抑制劑奧拉帕尼，能夠增強細胞對PARP抑制劑的敏感性，提高治療效果[32]。除單獨作用影響外，組蛋白修飾還可以通過與DNA甲基化共同影響染色質狀態來干預人乳頭瘤病毒相關口咽鱗狀細胞癌轉錄后剪接，同時HAT 如Spt-Ada-Gcn5 乙酰轉移酶（Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase，SAGA）可招募并與剪接機制相互作用，影響了耐藥的產生[33]。對于影響組蛋白修飾的病理因素，腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的酸中毒和缺氧可能影響組蛋白的甲基化和乙酰化，間接促進OSCC 耐藥的發生[34]。

4 染色質重塑與OSCC 耐藥

染色質重塑是指酵母交配型轉換（mating type switching，SWI）/蔗糖不發酵（sucrose non-fermenting，SNF）、模仿開關復合物（imitation switch，ISWI）、染色體結構域解旋酶DNA 結合蛋白（chromodomain helicase DNA binding protein，CHD）和肌醇營養缺陷型80 復合體等染色質重塑復合物調控染色質結構發生變化。重塑復合物各亞基、重塑因子的相關編碼基因的異常通過影響染色質結構而使轉錄、DNA 復制、DNA 損傷修復等基礎細胞生理過程混亂，從而影響腫瘤的發展與耐藥[35]。除直接干涉DNA 的信息傳遞外，染色質重塑還能夠通過影響DNA 甲基化和組蛋白修飾間接調控耐藥的發生與抵抗過程。

染色質重塑物編碼基因的狀態與表達可以作為腫瘤治療以及耐藥的靶點。有研究發現，編碼SWI/SNF 染色質重塑物BRG-/BRM 相關因子（BRG-/BRM-associated factor，BAF）亞基的肌動蛋白樣6A 基因（actin like 6A，ACTL6A）在許多鱗狀細胞癌的發展中被擴增，ACTL6A的過度擴增增加了其在BAF 復合物中的正常不飽和占用，增加了多梳對抗，激活鱗狀細胞癌基因。這說明改變染色質調節復合體內的亞基化學劑量可以致癌，提示可以適當減少ACTL6A 的表達作為治療手段。而ACTL6A中編碼兩個相鄰疏水氨基酸序列的突變使得TEA 結構域轉錄因子（TEA domain transcription factor，TEAD）/YAP 復合物之間結合增強，使得多梳再分配，促進了鱗狀細胞癌的生長，這為OSCC 的治療發現了一個新靶點[36]。相比于正常組織，染色質重塑因子1（remodeling and spacing factor 1，RSF1）蛋白在OSCC 中表達升高，且其表達與組織病理學分級、臨床分期與淋巴結轉移有關，提示RSF1 的表達與OSCC 的發展與轉歸可能有密切聯系[37]。其他染色質重塑物編碼基因如賴氨酸甲基轉移酶（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）和核受體結合SET 結構域蛋白1（nuclear receptor binding SET domain protein 1，NSD1）表達的改變也分別與頭頸部鱗狀細胞癌對極光激酶抑制劑的敏感性和廣泛的基因組低甲基化密切相關[38-39]。除重塑物編碼基因外，核心調控因子如ΔNp63α也能夠通過與酶或其他調節因子的相互作用間接改變染色質狀態，從而影響耐藥發展過程。ΔNp63α因子協調染色質重塑酶、組織特異性增強子景觀和染色質的三維高階結構，并通過與表觀遺傳調節劑的相互作用來影響染色質可及性[40]，增強或抑制轉錄；還能與Snf2 相關CREBBP激活蛋白（Snf2 related CREBBP activator protein，SRCAP）、DNA 甲基轉移酶1 相關蛋白1（DNA methyltransferase 1 associated protein 1，DMAP1）、RuvB 樣蛋白1（RuvB like AAA ATPase 1，RUVBL1）、RuvB 樣蛋白2（RuvB like AAA ATPase 2，RUVBL2）和ACTL6A 發生物理性相互作用并募集[41]，成為SCC 治療的一個潛在靶點。

5 小結與展望

比較而言，DNA 甲基化對OSCC 耐藥的影響大多是通過凋亡通路與藥物轉運途徑來實現，在CSC 標志表達上也有影響；ncRNA 影響范圍則更廣，涉及凋亡、內質網應激、CSC、EMT 等；組蛋白修飾中HDAC 靶點在臨床應用較多，凋亡及DNA損傷修復過程為主要調控對象；染色質重塑在OSCC 耐藥方面的機制尚未完全清晰，主要通過重塑復合物及調控因子的表達狀態影響染色質可及性來促進耐藥。此外，RNA 修飾在OSCC 耐藥中作用的研究近年來不斷深入，其中針對m6A RNA 在耐藥相關信號通路中的作用以及對其甲基化與去甲基化的調控也是研究熱點[42-43]。

表觀遺傳學機制對腫瘤耐藥的影響并不是單一的，各個機制間相互影響，有著錯綜復雜的聯系。由于機制的復雜性，聯合治療效果更為顯著，例如研究較多的JQ1 與PI3K 抑制劑——帕博利珠單抗（Pembrolizumab）和HDAC 抑制劑伏立諾他（Vorinostat）等[44]。相對傳統以手術為主，放療、化療為輔的OSCC 治療方式，聯合治療可能達到協同效應并延長耐藥反應時間，大大提高療效。除此之外，繪制患者基因組和表觀基因組圖譜并給予針對性的表觀遺傳治療也更能滿足腫瘤治療量身訂制的需求，但對表觀遺傳因子研究的缺少和外源性藥物的脫靶使表觀遺傳藥物的應用仍具挑戰性[45]。