基于單細(xì)胞測(cè)序的草酸鈣腎結(jié)石大鼠髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征分析

［摘要］ 目的： 探討草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征。方法： 應(yīng)用乙二醇氯化銨誘導(dǎo)法構(gòu)建草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型，通過Von Kossa′s組織染色驗(yàn)證模型構(gòu)建成功。單細(xì)胞測(cè)序方法鑒定髓袢細(xì)胞，對(duì)比分析草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征，應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO、KEGG以及GSEA富集分析。結(jié)果： 相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中發(fā)現(xiàn)鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色或棕黑色，表明草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型構(gòu)建成功。單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)組髓袢細(xì)胞亞群共有差異表達(dá)基因3 510個(gè)，其中880個(gè)表達(dá)上調(diào)，2 630個(gè)表達(dá)下調(diào)；其中LOC499584，白介素7（interleukin 7，Il7），雙特異性磷酸酶1（dual specificity phosphatase 1，Dusp1）以及基質(zhì)Gla蛋白（matrix Gla protein，Mgp）表達(dá)上調(diào)最為顯著；HORMA結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)2（HORMA domain containing 2，Hormad2），LOC361914，JUN二聚體蛋白2（Jun dimerization protein 2，Jdp2）以及生長抑素-B和血小板反應(yīng)蛋白1型結(jié)構(gòu)域蛋白（somatomedin-B and thrombospondin type-1 domain-containing protein，Sbspon）表達(dá)下調(diào)最為顯著。KEGG分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組髓袢細(xì)胞亞群氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號(hào)通路發(fā)生顯著改變。結(jié)論： 本研究首次揭示了草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征，為腎結(jié)石的形成及其介導(dǎo)的腎損傷研究提供了一定的參考依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］ 腎結(jié)石；單細(xì)胞測(cè)序；表達(dá)譜；髓袢；生物信息學(xué)

［中圖分類號(hào)］ R692.4

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 1671-7783（2024）02-0104-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230278

［引用格式］許婷，張穎，鄧瓊，等. 基于單細(xì)胞測(cè)序的草酸鈣腎結(jié)石大鼠髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征分析［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2024， 34（2）： 104-110.

The gene expression profiles of Henle-loop cell subset in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model based on single-cell sequencing analysis

XU Ting1， ZHANG Ying1， DENG Qiong1，2， LIANG Hui1， WANG Zhu1，2

（1. Department of Urology， 2. Central Laboratory， the People′s Hospital of Longhua Shenzhen， Shenzhen Guangdong 518110， China）

［Abstract］ Objective： To explore the gene expression profiles of Henle-loop cell subset in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model. Methods： The rat model of calcium oxalate kidney stone was constructed by ethylene glycol and 1% ammonium chloride. The model was validated by Von Kossa′s staining. Henle-loop cells were identified using single-cell sequencing method. The gene expression profiles of Henle-loop cell subsets in renal tissue of calcium oxalate kidney stone rat model were performed via comparative analysis. The enrichment analysis of differential genes was performed through GO， KEGG， and GSEA bioinformatics tools. Results： Compared with the control group， black or brownish black staining of calcium salt deposition were observed in the kidney tissue of the experimental group rats， indicating the successful construction of the calcium oxalate kidney stone rat model. Single cell sequencing analysis revealed that there was a total of 3 510 differentially expressed genes in the Henle-loop cell subset of the experimental group， of which 880 were upregulated and 2 630 were downregulated. LOC499584， Il7， dual specificity phosphatase 1 （Dusp1）， and matrix Gla protein （Mgp） were upregulated most significantly， while HORMA domain containing 2 （Hormad2）， LOC361914， Jun dimerization protein 2 （Jdp2）， and somatomedin-B and thrombospondin type-1 domain-containing protein （Sbspon） were downregulated most significantly. KEGG analysis revealed significant changes in signaling pathways such as oxidative phosphorylation， metabolism pathways， propanoate metabolism， autophagy， lysosome and endocytosis in the experimental group of Henle-loop cells. Conclusion： This study reveals for the first time the gene expression profile characteristics of Henle-loop cell subsets in renal tissue of the calcium oxalate kidney stone rat model， providing a molecular basis for the investigation of kidney stone formation and related kidney injury.

［Key words］ kidney stones; single cell sequencing; expression profile; Henle-loop; bioinformatics

髓袢（Henle-loop）是腎單位的U形部分，位于近曲小管和遠(yuǎn)曲小管之間一個(gè)不均勻的節(jié)段，管徑細(xì)，管壁薄，起到吸收水分和鉀離子等的作用。早在1971年，研究人員就分別通過光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)在人體腎臟間質(zhì)中的鈣化均發(fā)生在髓袢的基底膜并延伸至髓質(zhì)間質(zhì)［1-4］。隨后Stoller等［5］對(duì)尸體腎臟進(jìn)行高分辨率放射照相研究，發(fā)現(xiàn)57%的腎臟有上皮Randall′s斑塊，證實(shí)了早期關(guān)于髓袢基底膜參與Randall′s斑塊發(fā)展的報(bào)道。

目前關(guān)于腎結(jié)石形成的機(jī)制主要有“自由粒子”和“固定粒子”兩種學(xué)說［6-7］。“自由粒子”機(jī)制學(xué)說認(rèn)為高草酸尿癥或高鈣尿癥導(dǎo)致尿液過飽和促進(jìn)了腎小管腔中草酸鈣或磷酸鈣晶體的形成，晶體滯留在尿流受阻的部位、近端小管與髓袢相連接部或腎小管彎曲的乳頭基底部。“固定粒子”機(jī)制學(xué)說則認(rèn)為，結(jié)石形成始于磷酸鈣晶體在腎間質(zhì)中髓袢基底膜形成的Randall′s斑塊，繼而大量特發(fā)性草酸鈣晶體進(jìn)一步附著在Randall′s斑塊上從而導(dǎo)致腎結(jié)石的形成［7］。由此可見髓袢結(jié)構(gòu)在腎結(jié)石形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但是具體機(jī)制尚不明確。

草酸鈣結(jié)石是五種腎結(jié)石里最為常見的一種，大量研究表明骨橋蛋白（osteopontin，Opn）、CC趨化因子配體2（Ccl2）、前列腺素E2（Pge2）、基質(zhì)Gla蛋白（matrix Gla protein，Mgp）、α-1微球蛋白（alpha-1-microglobulin，Ambp）、骨連蛋白（也稱為Sparc）和CD44等在草酸鈣誘導(dǎo)的腎結(jié)石大鼠的腎上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［8-10］，但是草酸鈣晶體對(duì)髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜的影響尚未清楚。本研究在單細(xì)胞測(cè)序基礎(chǔ)上，對(duì)比分析草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型中髓袢細(xì)胞亞群基因表達(dá)譜特征，為揭示髓袢中差異表達(dá)基因在腎結(jié)石形成過程中的分子機(jī)制研究提供一定的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乙二醇氯化銨誘導(dǎo)法建立草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型

Sprague-Dawley大鼠（6周齡雄性）20只在無特定病原體動(dòng)物設(shè)施中適應(yīng)1周，可自由獲取無菌水和標(biāo)準(zhǔn)食物，保持室溫25 ℃，12 h的黑暗和光照循環(huán)。所有大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)以保證相同的耗水量。動(dòng)物研究按照倫理程序進(jìn)行，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。對(duì)照組大鼠灌胃2 mL/kg無菌水；參考先前報(bào)道［11-12］，實(shí)驗(yàn)組大鼠每天額外補(bǔ)充1%（v/v）乙二醇的飲用水，加1%氯化銨1 mL灌胃。4周后，用過量麻醉法對(duì)大鼠實(shí)施安樂死。將一部分腎組織液氮速凍，一部分10%甲醛固定并包埋在石蠟中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Von Kossa′s染色檢測(cè)大鼠腎臟組織中的鈣鹽沉積

Von Kossa′s染色技術(shù)是利用金屬離子置換反應(yīng)檢測(cè)組織中鈣鹽沉積，方法參考先前文獻(xiàn)報(bào)道［11］。首先將石蠟切片脫蠟至水，滴加硝酸銀溶液，用紫外燈連續(xù)照射2～3 h，蒸餾水洗多遍。然后切片入蘇木素染液染3～5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗。用85%、95%的乙醇梯度脫水各5 min，入伊紅染液5 min。最后將切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min無水乙醇Ⅱ 5 min無水乙醇Ⅲ 5 min二甲苯Ⅰ 5 min二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色或棕黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景呈紅色。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序及髓袢細(xì)胞亞群鑒定

分別從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠模型腎臟組織中分離單個(gè)細(xì)胞，使用密度梯度離心分離上述樣品的細(xì)胞核，重懸于細(xì)胞核洗滌緩沖液中，通過40 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。使用10×Genomics Chromium平臺(tái)生成乳液中的單細(xì)胞凝膠珠（Gel Bead-in-Emulsion，GEM），用于逆轉(zhuǎn)錄過程以創(chuàng)建cDNA，然后對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增并用于測(cè)序［11］。按照制造商的說明，將每個(gè)樣品約10 000個(gè)細(xì)胞核加載到單細(xì)胞3′芯片（V3，10×Genomics）中。使用硅烷磁珠（10×Genomics，PN-2000048）從GEM后反應(yīng)混合物中去除剩余的生化試劑和引物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增后，使用SPRIselect試劑盒（Beckman-Colter B23318）清理cDNA。cDNA質(zhì)量控制和定量在安捷倫生物分析儀高靈敏度芯片上進(jìn)行。ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Life Technologies）用于定量分析和匯集。根據(jù)Novaseq 6000的PE150模式進(jìn)行測(cè)序。使用cell ranger（10×Genomics，3.0.2版）處理原始測(cè)序數(shù)據(jù)，并與大鼠參考基因組（Ensembl_release100。Rnor_6.0）比對(duì)。使用singleR對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行注釋，并通過髓袢特異性標(biāo)志物尿類黏蛋白（uromucoid，Umod）、溶質(zhì)載體蛋白12A1（solute carrier family 12 member 1，Slc12a1）和跨膜蛋白72（transmembrane protein 72，Tmem72）進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組髓袢細(xì)胞差異基因的統(tǒng)計(jì)分析

基于細(xì)胞所屬的亞群信息和樣本信息，使用Seurat軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行組間差異分析，設(shè)置log2（FC）≥0.36、任意一組中表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞比例≥0.1為閾值，使用MAST障礙模型檢驗(yàn)差異顯著性。通過Seurat的BH法對(duì)差異基因的顯著性P值進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正，篩選矯正后P值≤0.05的基因作為顯著差異基因，得到顯著差異基因結(jié)果表，用于后續(xù)分布情況和富集分析。根據(jù)每個(gè)細(xì)胞亞群得到的上調(diào)基因數(shù)和下調(diào)基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得差異基因統(tǒng)計(jì)表并依此繪制差異基因統(tǒng)計(jì)圖。

1.5 差異表達(dá)基因的GO及KEGG分析

將實(shí)驗(yàn)組大鼠模型腎臟髓袢細(xì)胞亞群差異表達(dá)基因向Gene Ontology（簡稱GO）數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org/）的各條目映射，并計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)，從而得到具有某個(gè)GO功能的基因列表及基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)。然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在基因中顯著富集的GO條目。KEGG顯著性富集分析以KEGG信號(hào)通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在基因中顯著性富集的信號(hào)通路。通過信號(hào)通路顯著性富集能確定基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.6 差異表達(dá)基因的GSEA分析

將草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟髓袢細(xì)胞亞群差異基因進(jìn)行GSEA（Gene Set Enrichment Analysis，https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）即基因集富集分析，分別計(jì)算富集分?jǐn)?shù)、估計(jì)富集分?jǐn)?shù)顯著性水平和矯正多重假設(shè)驗(yàn)證。通過富集得分（enrichment score，ES）的動(dòng)態(tài)曲線來描述和比較各個(gè)基因集的分析結(jié)果，ES最高（gt;0時(shí)）或最低（lt;0時(shí)）值為該基因集的ES值。P值是對(duì)ES值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用來表示富集結(jié)果的可信度。FDR（1 discovery rate）是錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，即歸一化的ES代表假陽性結(jié)果的估計(jì)概率；標(biāo)準(zhǔn)化ES的絕對(duì)值越大FDR越小，F(xiàn)DR越小說明富集越顯著。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本之間的差異比較采用t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群的分離鑒定

通過Von Kossa′s染色驗(yàn)證草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織中的鈣鹽沉積，結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中鈣鹽沉積區(qū)域呈黑色或棕黑色，而對(duì)照組則沒有明顯的褐色或黑色沉積，表明草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型構(gòu)建成功（圖1A）。單細(xì)胞核RNA測(cè)序，通過特異性標(biāo)志物Umod、Slc12a1和Tmem72鑒定了髓袢細(xì)胞亞群（圖1B-C）。

2.2 草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型髓袢細(xì)胞亞群差異基因的表達(dá)

對(duì)照組大鼠腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群比例為15.16%，而在實(shí)驗(yàn)組中占比10.63%（圖2A）。差異基因分析結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群差異基因共3 510個(gè)，其中880個(gè)上調(diào)表達(dá)，2 630個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖2B）。LOC499584，Il7，Dusp1以及Mgp上調(diào)表達(dá)最為顯著（表1），Hormad2，LOC361914，Jdp2以及Sbspon下調(diào)表達(dá)最為顯著（表2）。

2.3 草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型髓袢細(xì)胞亞群差異基因的GO及KEGG富集分析

GO分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集在代謝過程以及蛋白結(jié)合功能（圖3A）。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號(hào)通路（圖3B）。

2.4 草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型髓袢細(xì)胞亞群差異基因GSEA分析

GSEA分析發(fā)現(xiàn)移植物抗宿主病，核糖體，1型糖尿病以及異體移植物排斥反應(yīng)等通路顯著上調(diào)表達(dá)（圖4A）；氨酰基-tRNA生物合成，碳代謝，α-亞麻酸代謝，聚糖降解等通路顯著下調(diào)（圖4B）。

3 討論

髓袢細(xì)支的基底膜是磷酸鈣鈣鹽沉積介導(dǎo)Randall′s斑塊起源的部位，在腎結(jié)石形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］，但是其基因表達(dá)譜特征尚未清楚。本研究通過特異性標(biāo)志物Umod、Slc12a1和Tmem72［14-15］鑒定了草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織中的髓袢細(xì)胞亞群，并通過單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)了草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型腎臟組織髓袢細(xì)胞亞群差異基因表達(dá)譜特征，其中Il7在髓袢細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。先前研究表明，細(xì)胞因子IL7及其受體IL7R對(duì)T細(xì)胞和小鼠B細(xì)胞的發(fā)育、原始T細(xì)胞的分化和存活以及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持至關(guān)重要［16］，但其濃度升高與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病有關(guān)［17］。髓袢細(xì)胞中Il7的上調(diào)表達(dá)，可能是作為腎結(jié)石晶體介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)的重要組成部分，在腎結(jié)石形成以及腎損傷過程中發(fā)揮作用，但是其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。Dusp1在維持線粒體功能和結(jié)構(gòu)完整性方面起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)上調(diào)是腎臟缺血再灌注損傷的重要防御保護(hù)機(jī)制［18］，因此Dusp1在草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型髓袢細(xì)胞中的上調(diào)可能與腎損傷保護(hù)相關(guān)。

本研究結(jié)果還顯示Hormad2、LOC361914、Jdp2以及Sbspon在草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型髓袢細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。Hormad2與精子源性衰竭和自身免疫性腎小球腎炎有關(guān)［19］，但是其在髓袢以及腎結(jié)石形成中的功能和機(jī)制尚未有研究報(bào)道。Jdp2在體外和體內(nèi)抑制p300介導(dǎo)的核心組蛋白乙酰化，抑制Jun家族蛋白介導(dǎo)的反式激活［20］，通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)p16Ink4a和Arf表達(dá)，通過p16Ink4a-pRb和Arf-p53途徑導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯［21］，在調(diào)控細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮重要作用［22］。先前的研究大多關(guān)注近端腎小管細(xì)胞的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)通路改變、氧化損傷等因素在促進(jìn)腎結(jié)石形成中的作用［8-10，23］。本研究采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)聯(lián)合GO、KEGG以及GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型中髓袢細(xì)胞氧化磷酸化、代謝途徑、丙酸代謝、自噬、溶酶體以及胞吞作用等信號(hào)通路顯著改變，為髓袢細(xì)胞在草酸鈣腎結(jié)石形成及其介導(dǎo)腎臟損傷的機(jī)制研究提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究通過單細(xì)胞測(cè)序成功鑒定分離了草酸鈣腎結(jié)石大鼠模型中髓袢細(xì)胞亞群，闡明了其基因表達(dá)譜特征，發(fā)現(xiàn)了在腎結(jié)石形成及其介導(dǎo)的腎損傷過程中的關(guān)鍵因子Il7、Dusp1以及Jdp2，為揭示髓袢細(xì)胞中腎結(jié)石形成相關(guān)信號(hào)通路提供了一定的參考依據(jù)。但是本研究主要是基于高通量技術(shù)以及生物信息學(xué)分析，仍有待在后續(xù)研究中通過細(xì)胞以及分子水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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［收稿日期］ 2023-12-18" ［編輯］ 何承志

［基金項(xiàng)目］廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（省企聯(lián)合，2022A1515220106）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2023281）

［作者簡介］許婷（1983—），女，主管護(hù)師，主要從事泌尿系結(jié)石疾病研究；王鑄（通訊作者），副研究員，E-mail： wangzhu_1223@163.com