內質網蛋白駐留受體2蛋白對胰腺癌惡性生長的影響及機制研究

［摘要］ 目的： 探討賴氨酸天冬氨酸谷氨酸亮氨酸（KDEL）內質網蛋白駐留受體2（endoplasmic reticulum protein retention receptor 2，KDELR2）對胰腺癌細胞惡性生長的影響，并初步探究相關作用分子機制。方法： 通過癌癥基因組學數據分析平臺（UCSC XENA）分析KDELR2 mRNA在泛癌和人胰腺癌組織中的表達水平；通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析其表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征及生存預后的關系；采用基因本體功能富集分析（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因組數據庫富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）探索KDELR2相關差異表達基因參與調節的信號通路；通過ssGSEA算法分析KDELR2免疫浸潤情況。應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質印跡實驗檢測不同胰腺癌細胞系（BXPC-3、MIA PaCa-2、PANC-1、PaTu 8988-T）以及正常人胰腺導管上皮細胞（HPNE）中KDELR2的mRNA和蛋白表達水平，并檢測人胰腺癌組織及對應癌旁組織中KDELR2的蛋白表達水平。通過慢病毒轉染構建KDELR2過表達和敲減的穩轉細胞株（PaTu 8988-T和PANC-1）及其對照空載體細胞株（“KDELR2-OE”和“Vec”、“shKDELR2-S1/S2”和“shNC”），利用CCK8、EdU、Transwell、細胞克隆形成實驗觀察KDELR2過表達及敲低后穩轉細胞株的生物學行為變化；使用JC-1、MitoSOX和DCFH-DA染色實驗以及檢測ATP水平觀察PaTu 8988-T和PANC-1細胞KDELR2敲低后的線粒體功能。通過構建裸鼠皮下荷瘤模型觀察KDELR2敲低對胰腺癌PANC-1細胞在體生長的影響。結果： KDELR2在人胰腺癌組織及細胞中顯著高表達，其高表達水平與胰腺癌患者的病理特征及不良預后密切相關。GO功能和KEGG富集分析表明，KDELR2可能通過調控細胞能量代謝調節胰腺癌細胞生長。敲低KDELR2顯著抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移能力，過表達KDELR2顯著促進胰腺癌細胞的增殖和遷移能力；KDELR2敲低后，胰腺癌細胞線粒體膜電位明顯下降，活性氧水平明顯升高，ATP水平明顯降低（P均lt;0.05）。裸鼠皮下荷瘤模型證實KDELR2敲低顯著抑制胰腺癌細胞的在體生長。結論： KDELR2在胰腺癌中顯著高表達且與患者不良預后密切相關，KDELR2可能參與調控線粒體的功能影響癌細胞能量代謝。

［關鍵詞］ 胰腺癌；內質網蛋白駐留受體2；治療靶點；增殖；遷移

［中圖分類號］ R735.9

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）02-0118-14

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230254

［引用格式］王書航，吳曉陽. 內質網蛋白駐留受體2蛋白對胰腺癌惡性生長的影響及機制研究［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（2）： 118-131.

Effect of KDEL endoplasmic reticulum protein retension receptor 2 on the malignant growth of pancreatic cancer and potential mechanisms

WANG Shuhang1， WU Xiaoyang2

（1. School of Medicine， Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212013; 2. Department of Gastrointestinal Surgery， Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University， Suzhou Jiangsu 215300， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the effect of KDELR2 on the malignant growth of pancreatic cancer cells， and its underlying molecular mechanisms. Methods： The expression of KDELR2 mRNA in pan-cancer and human pancreatic cancer tissues was analyzed by UCSC XENA database， and the association of its expression with clinicopathological characteristics and prognosis of pancreatic cancer patients was analyzed based on TCGA database. GO and KEGG analyses were used to explore the potential enriched signaling pathways of KDELR2-related differentially expressed genes （DEGs）. qRT-PCR and Western blotting were respectively applied to detect the KDELR2 mRNA and protein expression levels in different pancreatic cancer cell lines （BXPC-3， MIA PaCa-2， PANC-1， and PaTu 8988-T）， as well as normal HPNE， and the KDELR2 protein level of human pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues were also tested. Stable pancreatic cancer cells （PaTu 8988-T and PANC-1） containing the lentiviral particles encoding KDELR2 cDNA or KDELR2 shRNA and their scramble control lentiviral particles （“KDELR2-OE” and “Vec”， “shKDELR2-S1/S2”and “shNC”） were formed. In addition， CCK-8， EdU staining， Transwell， and cell colony formation experiments were applied to observe the functional change of those stable cell lines. The mitochondrial function of PaTu 8988-T and PANC-1 cells after KDELR2 knockdown was observed by JC-1， MitoSOX and DCFH-DA staining assays and ATP level detection assays respectively. Furthermore， the effect of KDELR2 shRNA on the growth of PANC-1 cells in vivo was explored by constructing a subcutaneous xenograft tumor model in nude mice. Results： KDELR2 was overexpressed in human pancreatic cancer tissues and cells， and its overexpression was positively correlated with higher tumor clinicopathological stages， indicating a poor prognosis of pancreatic cancer patients. GO function and KEGG enrichment analysis suggested that KDELR2 may regulate the growth of pancreatic cancer cells by regulating cellular energy metabolism. After silencing of KDELR2， the growth， proliferation and migration of pancreatic cancer cells were significantly inhibited. Ectopic overexpression of KDELR2 significantly promoted the proliferation and migration of pancreatic cancer cells. After KDELR2 knockdown， pancreatic cancer cells showed a significant decrease in mitochondrial membrane potential and ATP levels， a significant increase in reactive oxygen species levels （all Plt;0.05）. A subcutaneous xenograft model in nude mice demonstrated that KDELR2 knockdown significantly inhibited the growth of PANC-1 cells in vivo. Conclusion： KDELR2 is overexpressed in pancreatic cancer tissues and correlated with poor prognosis of pancreatic cancer patients， and KDELR2 may be involved in regulating mitochondrial function and energy metabolism in cancer cells.

［Key words］ pancreatic cancer; KDELR2; therapeutic target; proliferation; migration

胰腺癌是一種高致死性腫瘤，全球發病率逐年上升，總體5年生存率不足10%［1］。其具有起病隱匿、進展迅速、侵襲能力強、患者總體預后差等特點［2-3］。全球2020年胰腺癌的新發人數約為50萬［4］，大多數患者在確診時已經失去手術機會，因此化療和分子靶向治療是該病主要治療手段［5］。以吉西他濱為基礎的聯合化療是目前胰腺癌主要的化療方案，雖能改善腫瘤對化療藥物的總反應率，但不能有效延長患者的生存期［6］。對于轉移性胰腺癌患者，目前常用的治療方案包括mFOLFIRINOX方案（奧沙利鉑、伊立替康、氟尿嘧啶和亞葉酸鈣）和白蛋白結合性紫杉醇聯合吉西他濱方案，也只能適度改善患者的生存［7］。因此，進一步探索胰腺癌新的關鍵促癌基因，并在此基礎上進行靶向干預，是胰腺癌基礎和臨床研究的熱點。

賴氨酸天冬氨酸谷氨酸亮氨酸（KDEL）內質網蛋白駐留受體（endoplasmic reticulum protein retention receptor，KDELR）是一種七跨膜蛋白，負責將可溶性內質網駐留蛋白不斷從高爾基體回收到內質網，也是調節高爾基體和內質網之間囊泡運輸的關鍵參與者［8-10］。目前鑒定出3種KDELR亞型，分別是KDELR1、KDELR2和KDELR3［11］。截至目前，KDELR家族蛋白的功能尚不清楚。Bajaj等［12］證實，KDELR2通過增強高爾基體介導的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）分泌來驅動非小細胞肺癌的侵襲和轉移。此外，Liao等［13］證實，KDELR2通過激活mTOR信號促進缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）靶向的腦膠質母細胞瘤惡性生長。KDELR2通過促進驅動蛋白家族成員20A（kinesin family member 20A，KIF20A）的表達從而增強MMP2和MMP9的表達來促進膀胱癌細胞生長和轉移［14］。Wei等［15］證實，人組蛋白去乙酰化酶3（recombinant histone deacetylase 3，HDAC3）激活KDELR2，通過保護中心粒蛋白體5（proteome of centrioles，POC5）免受蛋白酶體降解來加速癌細胞的細胞周期進程。然而，目前尚未見KDELR2在胰腺癌中的研究報道。本課題聯合生物信息學分析及體內外細胞實驗系統驗證，初步探索了KDELR2的表達對胰腺癌細胞惡性生長的作用。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 KDELR2 mRNA的表達差異分析 基于UCSC XENA（https：//xenabrowser.net/datapages/）數據庫經Toil流程統一處理的TCGA、GTEx的TPM格式的RNAseq數據（泛癌），提取TCGA（泛癌）對應的數據和GTEx中對應的正常組織數據。在R（第4.2.1版本）軟件中采用Mann-Whitney U檢驗分析KDELR2 mRNA在多種腫瘤中的表達水平，并使用ggplot2包可視化KDELR2 mRNA在泛癌中的相對表達水平［16］。此外，從人類蛋白質圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數據庫下載人正常胰腺組織及胰腺癌組織免疫組化圖像，分析KDELR2在兩種組織中的表達差異。

1.1.2 KDELR2 mRNA表達水平與胰腺癌患者病理特征、生存率的關系 從TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）下載并整理包含TCGA-PAAD（胰腺癌）項目STAR流程的TPM格式轉錄本（RNAseq）數據以及臨床數據。根據不同的臨床相關特征將患者分成不同亞組，采用Mann-Whitney U檢驗和整體檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）＋多重假設檢驗（Dunn′s檢驗）統計分析不同亞組之間KDELR2 mRNA表達水平差異?；赥CGA-PAAD預后數據和預后補充數據，在R軟件上使用survival包進行比例風險假設檢驗并進行擬合生存回歸分析，并用survminer包和ggplot2包可視化不同亞組中KDELR2 mRNA高表達和低表達患者總體生存期（overall survival，OS）的差異［16］。采用單因素Cox回歸分析胰腺癌患者預后相關的因素；此外，使用ROC曲線評價KDELR2預測患者預后結局的準確性。

1.1.3 KDELR2相關差異表達基因分析 將TCGA-PAAD樣本高通量測序數據分為KDELR2 mRNA高表達組及低表達組，在R（第4.2.1版本）軟件中采用DESeq2包分析鑒定兩組之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。再篩選出編碼蛋白質的DEGs，篩選閾值：log2［差異倍數（fold change，FC）］gt;1.5及校正后P值（Padj）lt;0.05，使用火山圖可視化篩選結果，使用共表達熱圖展示與KDELR2顯著正相關和負相關的前10個DEGs，并繪制相關性熱圖分別展示正（負）相關前10個DEGs之間的相關性。此外，應用STRING在線數據庫（http：//string-db.org.https.gzlib.99885.net）分析上述DEGs，下載分析結果并將其導入Cytoscape 3.9.1軟件，分析并計算各節點度值（degree），并展示degree值大于10的蛋白互作（PPI）網絡圖。

1.1.4 GO和KEGG富集分析 在R（第4.2.1版本）軟件中采用clusterProfiler軟件包（［4.4.4］版本）對DEGs進行GO和KEGG富集分析。GO分析包括：生物學過程、細胞組分和分子功能；KEGG富集分析KDELR2相關DEGs主要參與的信號通路［16］。差異顯著標準：Padjlt;0.05及錯誤發現率（1 discovery rate，FDR）lt;0.25。

1.1.5 免疫細胞浸潤分析 基于TCGA-PAAD（胰腺癌）項目STAR流程的RNAseq數據，利用R軟件分析，使用Spearman進行相關分析，繪制棒棒糖圖和相關性散點圖可視化基因表達水平與免疫細胞之間的相關性。

1.2 細胞和組織實驗

1.2.1 細胞系及主要試劑 人胰腺癌細胞系（BXPC-3、PaTu 8988-T、PANC-1、MIA PaCa-2）及人胰腺導管細胞（HPNE）購自中科院上海生物科學研究所；細胞培養相關試劑（美國Gibco公司）；KDELR2慢病毒轉染試劑盒（上海吉凱基因科技有限公司）；KDELR2引物和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）檢測試劑盒（廣州銳博生物技術公司）；CCK8試劑（南京諾唯贊科技生物股份有限公司）；TUNEL、JC-1和ATP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；MitoSox試劑盒（美國MedChemExpress公司）；DCFH-DA試劑盒（亞科因生物技術有限公司）；一抗：兔抗人KDELR2（華安生物技術有限公司）；二抗：羊抗兔IgG（美國Abcam公司）。

1.2.2 組織標本 從江蘇大學附屬昆山醫院生物樣本庫收集近5年知情同意且術前未經任何治療的胰腺癌患者癌組織及對應癌旁組織（3對），以上研究得到江蘇大學附屬昆山醫院倫理委員會批準。

1.2.3 細胞轉染及分組 于6孔板中以3×104個/孔密度接種胰腺癌細胞（PaTu 8988-T和PANC-1），分為KDELR2敲低對照組（shNC）、KDELR2敲低組1（shKDELR2-S1）、KDELR2敲低組2（shKDELR2-S2）、KDELR2過表達對照組（Vec）和KDELR2過表達組（KDELR2-OE）。待細胞融合率接近50%時，將敲低、過表達慢病毒序列和對照組（shNC病毒：hu6-MCS-CBh-IRES-Puromycin；Vec病毒：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-IRES-Puromycin）序列分別轉入PaTu 8988-T和PANC-1細胞中，轉染24 h后，嘌呤霉素篩選。shKDELR2-S1序列：GTCCAGACCATCCTAT-ACT，shKDELR2-S2序列：GGATCTGGCGCTTCTAC-TT。

1.2.4 qRT-PCR實驗檢測KDELR2 mRNA表達水平 使用RNA快速提取試劑盒提取細胞中總RNA后逆轉錄成cDNA，按說明書配置反應體系，在標準條件下進行qRT-PCR實驗。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參。使用2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA相對表達水平。引物序列：KDELR2上游5′-TAAGGCAACCTACGATGGAAAT-3′，下游：5′-GGAAGGATAGCCACGGACTC-3′；β-肌動蛋白上游5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3′，下游5′-ACATCTGCTGGA-AGGTGGACA-3′。

1.2.5 蛋白質印跡實驗檢測KDELR2蛋白表達水平 將人胰腺導管細胞（HPNE）和人胰腺癌細胞（BxPC-3、PaTu 8988-T、PANC-1、MIA PaCa-2）冰上裂解、離心、取上清液后蛋白定量。組織蛋白提取方法詳見前期已發表的論文［17］。使用10% SDS-PAGE電泳后，轉膜、5%脫脂牛奶封閉、兔抗人KDELR2一抗封閉過夜、羊抗兔IgG二抗結合，最后使用化學發光儀壓片機曝光，用Image J軟件進行灰度值量化分析。

1.2.6 CCK8、EdU染色和細胞克隆形成實驗檢測胰腺癌細胞增殖能力 CCK8實驗：將1×104個轉染后胰腺癌細胞（100 μL）接種到96孔板中，分別培養0、24、48和72 h后，棄培養基，加入100 μL稀釋（完全培養基1∶9）的CCK8試劑，在37 ℃下培養2 h后，用酶標儀測量450 nm處的光密度（D）值。EdU細胞增殖實驗：于24孔板中以3×104個/孔接種轉染后的胰腺癌細胞（PaTu 8988-T和PANC-1），生長24 h后，使用EdU細胞增殖試劑盒進行細胞染色；在熒光顯微鏡下拍照，計算平均EdU陽性比率（%）=紅色熒光細胞數目/總細胞數目×100%。細胞克隆實驗：將分組轉染后的細胞以700個/孔鋪于6孔板中，中途換液，培養14 d至克隆完成后，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，洗凈晾干后拍照，并用Image J計算克隆形成數目。

1.2.7 Transwell實驗檢測胰腺癌細胞遷移能力 在24孔板中加入0.5 mL 20%的完全培養基，用空培養基重懸轉染的胰腺癌細胞（PaTu 8988-T和PANC-1），鋪在上室中（每孔約4×104個細胞），置于細胞培養箱內孵育48 h后，擦去上室未穿過的細胞，4%多聚甲醛固定小室下側，2.5%結晶紫染色，使用顯微鏡（10×）拍照并用Image J計數遷移細胞數目。

1.2.8 JC-1檢測線粒體膜電位 將上述穩轉細胞株以3×105個/孔鋪入24孔板中，培養24 h后，每孔加入300 μL JC-1工作液，孵育30 min，棄孵育液，預熱的DMEM完全培養基清洗2次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J統計分析JC-1單體（綠色）熒光強度。

1.2.9 MitoSOX和DCFH-DA染色分別測定線粒體和細胞內活性氧（ROS）水平 將上述穩轉細胞株鋪入24孔板中，細胞形態較好時，PBS潤洗3次，加入300 μL MitoSOX工作液/DCFH-DA檢測液，孵育30 min，并于熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image J統計分析熒光強度。

1.2.10 細胞內腺苷三磷酸（ATP）水平測定 將上述穩定轉染細胞株鋪入6孔板中，培養一定時間后，加入細胞裂解液，裂解離心后，取上清液，用于后續的測定。按照1∶4的比例配置ATP檢測試劑，使用化學發光儀測定樣品相對光單位（RLU）并進行統計分析。

1.3 動物實驗及分組

從杭州子源實驗動物科技有限公司購買4周齡的雌性裸鼠6只，體重15～18 g，許可證號：SCXK（浙）2019-0004，并在無特定病原體（SPF）環境中飼養。將穩轉shKDELR2-S1和shNC的PANC-1細胞皮下注射到裸鼠的右側腋下（每只小鼠5×104個細胞，每組3只小鼠，共計6只），然后每5天記錄一次腫瘤體積；喂養至第35天時，對所有小鼠實施安樂死，分離瘤組織，并測量瘤重；使用蛋白質印跡實驗檢測shNC和shKDELR2-S1組荷瘤組織KDELR2蛋白表達水平；使用組織凋亡（Tunel）實驗檢測shNC和shKDELR2-S1組荷瘤組織的凋亡細胞個數。Tunel實驗見已發表的文獻［17］。

1.4 統計分析

應用SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析并繪制圖表，計量數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KDELR2 mRNA在泛癌和人胰腺癌組織中高表達

基于UCSC XENA數據庫的泛癌數據分析結果表明，KDELR2 mRNA在多種腫瘤組織中的相對表達水平顯著高于對應癌旁組織，如腎上腺皮質癌、膀胱移行細胞癌、乳腺浸潤癌、肺腺癌、胰腺癌等共26種腫瘤；HPA數據庫的免疫組化結果提示KDELR2蛋白表達在人胰腺癌組織中表達水平增加。見圖1。

2.2 KDELR2 mRNA表達水平與胰腺癌患者病理特征密切相關

基于TCGA-PAAD臨床數據和RNASeq測序數據分析表明，KDELR2 mRNA表達水平與胰腺癌臨床病理T分期、N分期、M分期、病理學分期、組織學分級和總體生存期事件均明顯相關，見圖2。上述結果提示，KDELR2 mRNA的高表達與胰腺癌不良病理特征密切相關。

2.3 KDELR2 mRNA的高表達與胰腺癌患者不良預后密切相關

基于TCGA-PAAD預后數據、預后補充數據以及RNASeq測序數據，分析結果表明，與KDELR2 mRNA高表達胰腺癌患者相比，KDELR2 mRNA低表達胰腺癌患者總生存期更長（HR=1.80，P=0.006）；此外，在T1、T2和T3期，N0期，病理Ⅰ和Ⅱ期，殘存腫瘤R0，組織學分級G1和G2的亞組中，高表達KDELR2 mRNA的胰腺癌患者生存時間更短。見圖3。上述結果表明，KDELR2 mRNA表達水平增高與胰腺癌患者不良預后相關。

2.4 單因素Cox回歸分析預后不良因素

基于TCGA-PAAD預后數據、預后補充數據和RNASeq測序數據，進行單因素Cox回歸分析，結果提示T分期、N分期、病理學分期、組織學分級、術后殘存腫瘤以及KDELR2 mRNA表達水平（HR=1.568，95%CI：1.034～2.380，P=0.034）均是胰腺癌患者不良預后的影響因素，而接受放射治療（HR=0.507，95%CI：0.298～0.863，P=0.012）則是胰腺癌患者預后的有利因素（圖4A）；此外，ROC曲線（AUC：0.980）也表明KDELR2 mRNA的表達水平對于預測胰腺癌患者的預后結局具有較強的準確性（圖4B）。

2.5 KDELR2相關DEGs及共表達基因的分析

根據KDELR2表達量中位數將樣本分為KDELR2低表達組和高表達組，基因差異表達分析共得到8 142個KDELR2相關的編碼蛋白質的基因（Padjlt;0.05），進一步將篩選閾值設置為log2（FC）gt;1.5，篩選得到47個上調基因和330個下調基因，共377個DEGs（圖5A）。用共表達熱圖展示與KDELR2密切相關的基因，其中包含前10個正相關基因：IGF2BP3、TRIM40、H2BC7、BTNL8、GPA33、SMIM31、LRRC31、SLC5A12、APOBEC1和MOGAT3；前10個負相關基因：AMY2B、GPHA2、BRSK2、TMED6、FAM240C、FITM1、GAMT、CELA2A、P2RX1和CUZD1（圖5B-C）。根據共表達基因表達水平，使用相關性熱圖展示其相關性（圖5D-E）。此外，結合STRING在線數據庫和Cytoscape軟件分析DEGs得到PPI網絡圖，前10位Hub基因是ALB、CTRB1、PPY、CEL、CPA1、CTRB2、SYP、CPB1、PNLIP和PRSS1。

2.6 GO和KEGG富集分析KDELR2潛在的生物學功能

為初步探索KDELR2潛在的生物學功能和參與調控的信號通路，對KDELR2相關的DEGs［閾值：log2（FC）gt;1］進行GO分析和KEGG富集分析。分析結果表明，上述DEGs參與的生物學過程主要包括化學突觸傳遞的調節、跨突觸信號轉導的調節、激素水平調節、膜電位調節、消化、鉀離子轉運、信號釋放、激素轉運、胞內運輸和激素分泌等（圖6A）；主要分布和表達所在的細胞組分包括突觸前、離子通道復合物、跨膜轉運蛋白復合物、神經元細胞體、陽離子通道復合物、運輸復合體、神經元投射末端等（圖6B）；參與的分子功能主要包括被動跨膜轉運蛋白活性、通道活性、門控通道活性、離子通道活性、激素活性、金屬離子跨膜轉運蛋白活性、鉀離子跨膜轉運蛋白活性、絲氨酸型肽內切酶活性、受體配體活性等（圖6C）。KEGG富集分析結果提示，KDELR2相關DEGs主要參與胰腺分泌、神經活性配體受體相互作用、蛋白質消化和吸收、脂肪消化和吸收、年輕人的成熟期糖尿病、碳水化合物的消化和吸收、尼古丁成癮、GABA能突觸、膽汁分泌和胰島素分泌等信號通路（圖6D）。上述結果提示，KDELR2可能通過調控細胞能量代謝來調節胰腺癌細胞的惡性生長。

2.7 KDELR2免疫浸潤分析

ssGSEA算法免疫浸潤分析結果表明，KDELR2高表達組織樣本中存在多種免疫細胞的浸潤（圖7A）；其中，KDELR2表達水平與輔助性T細胞2（Th2細胞）呈正相關（r=0.512，Plt;0.001），與漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）、濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell，TFH）、細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）等呈負相關（圖7B）。以上結果表明KDELR2可能參與調節了胰腺癌組織免疫微環境，或許是潛在的免疫治療新靶點。

2.8 KDELR2在人胰腺癌細胞和組織中高表達

qRT-PCR和蛋白質印跡實驗結果表明，胰腺癌細胞中KDELR2 mRNA及蛋白表達水平明顯高于HPNE細胞，并在PaTu 8988-T和PANC-1細胞中顯著高表達（圖8A-B）。此外，對3例人胰腺癌組織及癌旁組織行蛋白質印跡實驗，結果表明KDELR2蛋白水平在人胰腺癌組織中顯著高于癌旁組織（圖8C）。

2.9 敲低或過表達KDELR2對胰腺癌細胞增殖能力的影響

蛋白質印跡實驗結果表明，與shNC組相比，穩定轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的胰腺癌細胞（PaTu 8988-T、PANC-1）中KDELR2蛋白表達水平明顯降低（P均lt;0.05）；與Vec組相比，轉染KDELR2-OE的PaTu 8988-T、PANC-1細胞中KDELR2蛋白表達水平顯著增加（P均lt;0.05），證實了慢病毒轉染效率。見圖9。

CCK8實驗結果表明，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1的PaTu 8988-T、PANC-1細胞在24、48和72 h的細胞活力降低，在72 h時細胞活力顯著減弱（Plt;0.05）；與Vec組相比，轉染KDELR2-OE的PaTu 8988-T、PANC-1細胞在24、48和72 h的細胞活力增高，PaTu 8988-T細胞在72 h時細胞活力顯著增強（Plt;0.05），PANC-1胰腺癌細胞在48 h、72 h時細胞活力顯著增強（Plt;0.05），見圖10。

EdU染色和細胞克隆實驗結果顯示，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的PaTu 8988-T、PANC-1細胞EdU核陽性比率顯著下降（P均lt;0.05），細胞克隆數明顯減少（P均lt;0.05）；與Vec組相比，轉染KDELR2-OE的PaTu 8988-T、PANC-1細胞EdU核陽性比率顯著增加（P均lt;0.05），細胞克隆數明顯增加（P均lt;0.05），見圖11、12。

2.10 敲低或過表達KDELR2對胰腺癌細胞遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的PaTu 8988-T、PANC-1細胞遷移數明顯減少（P均lt;0.05）；與Vec組相比，轉染KDELR2-OE的胰腺癌細胞遷移數顯著增多（P均lt;0.05），見圖13。

2.11 敲低KDELR2降低胰腺癌細胞線粒體膜電位水平

基于TCGA數據庫分析結果提示，KDELR2可能參與調控腫瘤細胞的能量代謝。因此，進一步分析KDELR2的表達水平對胰腺癌細胞線粒體功能的影響。JC-1實驗結果表明，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的PaTu 8988-T、PANC-1細胞線粒體膜電位水平明顯降低（P均lt;0.05），見圖14。

2.12 敲低KDELR2誘導胰腺癌細胞內ROS水平升高

MitoSOX染色實驗結果表明，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的胰腺癌細胞（PaTu 8988-T、PANC-1）線粒體內ROS水平明顯升高（P均lt;0.05）。DCFH-DA實驗結果表明，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的胰腺癌細胞內ROS水平升高（P均lt;0.05），見圖15。

2.13 敲低KDELR2降低胰腺癌細胞內ATP水平

細胞內ATP水平測定實驗結果表明，與shNC組相比，轉染shKDELR2-S1和shKDELR2-S2的胰腺癌細胞（PaTu 8988-T、PANC-1）內ATP水平顯著降低（P均lt;0.05），見圖16。

2.14 敲低KDELR2抑制胰腺癌PANC-1細胞裸鼠皮下移植瘤的生長

皮下荷瘤模型實驗結果表明，shKDELR2-S1組移植瘤的體積顯著小于shNC組移植瘤的體積（第35天：t=8.705，Plt;0.05）；shKDELR2-S1組移植瘤重量較shNC組明顯減輕（圖17A）。蛋白質印跡實驗證明，與shNC組相比，shKDELR2-S1組KDELR2蛋白表達水平明顯降低（Plt;0.05，圖17B）。Tunel實驗表明，shKDELR2-S1組較shNC組的凋亡細胞比例顯著增加（Plt;0.05，圖17C）。以上結果表明，敲低KDELR2后抑制胰腺癌PANC-1細胞的在體生長，并誘導癌細胞凋亡。

3 討論

胰腺癌是我國常見的惡性腫瘤，同時也是我國第六大癌癥死亡原因［18］。近年來，胰腺癌的分子靶向治療研究發展迅猛，包括EGFR抑制劑、PARP抑制劑在內的靶向治療藥物已應用于臨床，使得部分患者的生存率得到明顯提高［19］。因此，探索新的胰腺癌治療靶點尤為重要。本研究利用生物信息學分析發現，KDELR2在胰腺癌中顯著高表達，且其高表達水平與患者病理分期及不良生存預后密切相關；這一結果初步表明KDELR2或是胰腺癌患者分子靶向治療的潛在靶點。

Ruggiero等［20］研究表明，通過KDELR的膜運輸產生的信號轉導，通過激活非受體酪氨酸激酶（Src）誘導人惡性黑色素瘤細胞外基質降解，從而促進癌細胞侵襲。此外，Zhang等［21］證實，細胞內前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）與KDELR結合后激活Gs-PKA信號轉導，從而促進結直腸癌轉移。本研究結果表明，在體外敲低KDELR2后，胰腺癌細胞的增殖和遷移能力顯著被抑制；外源性過表達KDELR2則顯著增強胰腺癌細胞的增殖和遷移能力。此外，小鼠荷瘤模型結果證實，敲減KDELR2顯著抑制胰腺癌細胞在裸鼠皮下的生長。

線粒體是細胞的能量工廠，在癌細胞的能量調控中至關重要［22］。ATP主要在線粒體中產生，癌細胞的生長轉移需要消耗大量ATP；此外，若癌細胞線粒體產生過量的ROS，可使癌細胞遷移能力減弱，甚至死亡［23］。生信分析結果初步提示，KDELR2可能參與調控細胞的能量代謝。因此，本研究進一步探究了KDELR2對胰腺癌細胞線粒體功能的影響。JC-1、MitoSOX和DCFH-DA染色以及ATP水平檢測實驗等結果顯示，敲低KDELR2后，癌細胞內線粒體膜電位水平明顯降低、ROS水平明顯升高及細胞內ATP水平明顯降低。上述結果初步提示，KDELR2可能參與調控線粒體的功能并影響癌細胞能量代謝。然而，KDELR2參與調控胰腺癌細胞能量代謝的分子機制有待進一步闡明。

近期研究表明，pDC和TFH在腫瘤發生發展中發揮重要作用［24-25］。Hernndez等［26］證實，pDC可通過分泌顆粒酶B和腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）等直接殺傷腫瘤細胞。此外，pDC還可通過分泌Ⅰ型干擾素直接作用于腫瘤細胞，從而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移［27］。TFH可通過分泌CXCL13和IL-21重塑胰腺癌的免疫微環境，從而增強免疫細胞的抗腫瘤效應［28］。本研究中基于TCGA數據庫的ssGSEA免疫浸潤分析結果顯示，KDELR2與胰腺癌腫瘤微環境中的pDC和TFH浸潤呈顯著負相關。因此，KDELR2的高表達或可抑制腫瘤微環境中的pDC和TFH浸潤，從而促進腫瘤的惡性生長。然而，KDELR2的表達水平與胰腺癌腫瘤微環境中pDC和TFH的相關性有待進一步驗證。

綜上所述，本研究初步證實了KDELR2促胰腺癌惡性進展的關鍵作用，或是胰腺癌新的潛在干預靶點。但是本課題僅通過生信分析和細胞學實驗初步探索了KDELR2在胰腺癌中的潛在生物學功能，而KDELR2在胰腺癌中高表達及其促癌作用的分子機制有待進一步闡明。

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［收稿日期］ 2023-11-30" ［編輯］ 何承志

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82072712）

［作者簡介］王書航（1998—），男，碩士研究生；吳曉陽（通訊作者），碩士生導師，副教授，E-mail： wxy3339@163.com