Foxp3在小鼠肺發育中的動態表達及意義

［摘要］ 目的： 通過分析叉頭樣轉錄因子3（forkhead box protein 3，Foxp3）在小鼠肺發育過程中的表達及其與肺發育相關標志物之間的關系，探討Foxp3在肺發育中的可能作用。方法： 根據小鼠肺發育的進程，選取胎鼠及新生鼠分為6組，分別于孕17.5 d及出生后1、4、7、14、21 d留取肺組織，HE染色觀察肺組織形態，免疫組織化學染色檢測CD31含量并觀察肺微血管密度。qRT-PCR檢測Foxp3及肺表面活性蛋白C（surfactant protein C，SP-C）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）、血管生成素-1（angiopoietin 1，Ang-1）mRNA表達，蛋白質印跡法檢測Foxp3及SP-C、VEGF-A、Ang-1蛋白表達。結果： 肺組織內Foxp3 mRNA在孕17.5 d小管期表達最高，后呈現不斷減少趨勢。SP-C mRNA在小鼠出生后1 d表達最高，隨后逐漸減弱，直至肺泡化晚期。VEGF-A、Ang-1 mRNA在孕17.5 d表達最高，之后呈現不斷減少趨勢，最終趨于穩定。Foxp3蛋白在小管期已有表達，且在小管期及囊泡期表達最高，其后逐漸趨于平穩，VEGF-A及Ang-1在小管期及囊泡期表達亦最高，后逐漸減少；SP-C表達于出生后1 d達到最高，隨后逐漸減少，并于肺泡化中晚期趨于平穩。相關性分析顯示，Foxp3與SP-C、VEGF-A及Ang-1存在相關性（r分別為0.661、0.630和0.738）。結論： Foxp3在胎肺期及出生后早期呈現動態表達，Foxp3在小管期及囊泡早中期的高表達與SP-C、VEGF-A及Ang-1呈正相關，提示Foxp3可能促進肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞的增殖，參與肺發育過程。

［關鍵詞］ 肺發育；叉頭樣轉錄因子3；肺表面活性蛋白C；血管內皮生長因子A；血管生成素-1；調節性T細胞

［中圖分類號］ R722.6

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）02-0132-06

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230136

［引用格式］江健鋒，盧紅艷，朱玥，等. Foxp3在小鼠肺發育中的動態表達及意義［J］. 江蘇大學學報（醫學版）， 2024， 34（2）： 132-137.

Dynamic expression and significance of Foxp3 in the development of mouse lung

JIANG Jianfeng， LU Hongyan， ZHU Yue， HE Langyue， ZHU Ying

（Department of Pediatrics， Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001， China）

［Abstract］ Objective： To explore the possible role of forkhead box protein 3 （Foxp3） in lung development by analyzing the dynamic expression of Foxp3 during mouse lung development and its relationship with lung development related markers. Methods： According to the process of lung development， fetal and newborn mice were divided into 6 groups. Lung tissues were taken at 17.5 days of pregnancy and 1 day， 4 days， 7 days， 14 days and 21 days after birth. Lung morphology was observed by HE staining， CD31 content was detected by immunohistochemical staining and pulmonary microvessel density was observed. The expression of Foxp3 and surfactant protein C （SP-C）， vascular endothelial growth factor A （VEGF-A）， angiopoietin 1 （Ang-1） mRNA was detected by qRT-PCR， and the protein expression of Foxp3 and SP-C， VEGF-A， Ang-1 was detected by Western blotting. Results： The expression of Foxp3 mRNA in lung tissue was the highest in the tubule stage at E17.5 d， and then decreased continuously. The expression of SP-C mRNA was the highest at 1 day after birth， and then decreased gradually until the late stage of alveolization. The expression of VEGF-A and Ang-1 mRNA was the highest at E17.5 d， then decreased gradually， and finally tended to be stable. The expression of Foxp3 protein was found in the tubule stage， and the expression was the highest in the tubule phase and vesicular phase， and then gradually stabilized. The expression of VEGF-A and Ang-1 was also the highest in the tubule and vesicular phase， and then decreased gradually， while the expression of SP-C reached the peak at 1 day after birth， then decreased gradually， and tended to be stable in the middle and late stage of alveoli. Correlation analysis showed that Foxp3 was correlated with SP-C， VEGF-A and Ang-1 （r=0.661， 0.630 and 0.738）. Conclusion： Foxp3 showed dynamic expression in fetal lung and early postnatal stage. The high expression of Foxp3 in tubule stage and early and middle vesicle stage was positively correlated with SP-C， VEGF-A and Ang-1， suggesting that Foxp3 may promote the proliferation of alveolar epithelial cells and pulmonary vascular endothelial cells and participate in the process of lung development.

［Key words］ lung development; forkhead box protein 3 （Foxp3）; surfactant protein C （SP-C）; vascular endothelial growth factor A （VEGF-A） ; angiopoietin 1 （Ang-1）; regulatory T cells （Treg）

肺由內胚層經一系列分支形態發生發育而來，并逐漸產生氣道上皮、血管內皮等各種譜系。根據肺泡化的進程，肺發育可大致分為胚胎期、腺體期、小管期、囊泡期和肺泡期5個時期［1］，主要包括肺泡上皮發育及肺血管內皮發育。Ⅱ型肺泡上皮細胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells，AEC Ⅱ）是肺泡上皮的干細胞，其增殖與分化居于肺泡發育的中心位置，肺表面活性蛋白C（surfactant protein C，SP-C）是AEC Ⅱ標志性蛋白之一，可間接反映肺上皮發育成熟度［2］。血小板內皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）常用于標記肺微血管內皮細胞［3］，血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）和血管生成素-1（angiopoietin 1，Ang-1）是肺血管發育重要的調節因子，可間接反映肺血管的發育成熟度［4］。研究發現，叉頭樣轉錄因子3（forkhead box protein 3，Foxp3）在胚胎發育和成體穩態中調控細胞增殖、分化和凋亡［5］。Foxp3是公認的調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）標志性基因，決定著Treg細胞分化和功能［6］。已有研究發現，Foxp3基因調控新生小鼠心肌細胞增殖及肺泡上皮細胞修復再生［7-8］，同時參與肺腫瘤細胞異常增殖［9］，但在小鼠肺發育生理過程中的作用研究較少，故本研究通過檢測Foxp3、SP-C、VEGF-A及Ang-1在小鼠肺發育不同階段的動態表達情況，初步探討Foxp3在肺發育中的可能作用，為早產兒肺發育研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選擇10～12周齡、體重22～25 g，發育狀況相近的C57系小鼠（江蘇大學動物中心），合格證號：SCXK（蘇）2013-0011，雌雄按3∶1合籠交配，次日晨取雌鼠陰道分泌物涂片，鏡檢見精子的當日計為孕0.5 d，足月小鼠一般孕19～21 d分娩。參考文獻［1］選取小鼠孕17.5 d（小管期）及出生后1 d（囊泡中期）、4 d（囊泡末期）、7 d（肺泡早期）、14 d（肺泡中期）、21 d（肺泡晚期）6個時間節點，代表肺發育不同階段。

1.1.2 主要試劑 Trizol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），大鼠抗小鼠Foxp3抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗小鼠CD31單克隆抗體、兔抗小鼠SP-C多克隆抗體、兔抗小鼠VEGF-A單克隆抗體、兔抗小鼠Ang-1單克隆抗體、大鼠抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗大鼠IgG（南京福麥斯生物技術有限公司），苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、SDS-PAGE配膠試劑盒及上樣緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司），8%～16%梯度膠（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理 妊娠17.5 d的孕鼠腹腔注射200 g/L烏拉坦麻醉后脫頸處死孕鼠，迅速打開腹腔，分離妊娠子宮，取出胎鼠，顯微鏡下操作留取孕鼠的胎肺；于小鼠自然分娩出生后1、4、7、14及21 d處死新生小鼠，迅速打開胸腔，留取相應時間點肺組織。PBS灌洗兩肺至略蒼白后留取肺組織，石蠟包埋后進行組織學染色觀察，其余組織保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 HE染色觀察肺組織形態 肺組織石蠟包埋后，3 μm切片，行HE染色，細胞核呈深藍色，胞質和纖維組織呈紅色，觀察肺組織形態。

1.2.3 CD31含量及肺微血管密度觀察 各時間點肺組織切片常規脫蠟至水，修復抗原、牛血清白蛋白封閉，加入1∶50兔抗小鼠CD31一抗、1∶5 000山羊抗兔IgG二抗，DAB染色，蘇木精復染、脫水、透明、封片，陰性對照組使用等體積同型IgG對照抗體代替一抗孵育，其他步驟相同。采用Image J圖像采集系統分析CD31免疫組織化學圖片，以細胞中存在棕黃色顆粒為陽性染色，以陽性細胞積分光密度值記為該肺組織標本中CD31含量，并計算肺微血管密度。肺微血管密度（%）=肺組織CD31免疫染色陽性的內皮細胞面積/肺實質細胞總面積×100%。

1.2.4 qRT-PCR檢測Foxp3、SP-C、VEGF-A、Ang-1 mRNA表達 稱量100 mg肺組織置于高壓滅菌后的研缽中，加入1 mL Trizol試劑提取組織中總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉為cDNA。PCR反應體系（20 μL）：7.2 μL DEPC水、10 μL 2×SYBR Green Mix和上、下游引物各0.4 μL、2 μL cDNA。反應程序：95 ℃ 300 s（預變性），95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s（循環反應），95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s（熔解曲線），共40個循環，4 ℃存放。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列：GAPDH上游引物5-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-TG-GTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；Foxp3上游引物5′-TTACTCGCATGTTCGCCTACTTCAG-3′，下游引物5′-CTCGCTCTCCACTCGCACAAAG-3′；SP-C上游引物5′-CTGAGATGGTCCTTGAGATGAG-3′，下游引物5′-TCATAGTGTAGTAGGTTCC-3′；VEGF-A上游引物5′-TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC-3′，下游引物5′-CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA-3′；Ang-1上游引物5′-GAAGGATGCTGATAACGACAAC-3′，下游引物5′-AGTTTTCCATGATTTTGTCCCG-3′。以GAPDH作為內參，ΔCt（所測組別）=Ct所測組別-CtGAPDH，ΔΔCt（所測組別）=ΔCt所測組別-ΔCt孕17.5 d，對應相對表達量即為2-ΔΔCt。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測Foxp3、SP-C、VEGF-A、Ang-1蛋白表達 肺組織剪小塊，加入裂解液及蛋白酶抑制劑勻漿肺組織提取蛋白質，10 μL蛋白上樣電泳（恒壓70 V），轉膜（恒流350 mA、時間90 min），5%脫脂奶粉封閉后4 ℃分別孵育大鼠抗小鼠Foxp3（1∶1 000）、兔抗小鼠SP-C（1∶200）、兔抗小鼠VEGF-A（1∶1 000）、兔抗小鼠Ang-1（1∶1 000），孵育一抗過夜，洗膜后室溫下分別孵育山羊抗大鼠、山羊抗兔二抗（1∶5 000），化學發光法顯色，Image J軟件分析灰度值，進行定量分析。

1.3 統計學處理

應用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩樣本間相關性采用Pearson相關分析，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織形態

小鼠肺組織HE染色顯示，孕17.5 d時，可見原始肺芽內出現氣腔樣結構，環形排列，上皮細胞呈高柱狀，間質結構致密；出生后1 d時，肺芽完全分開，各自獨立，肺腺泡腔廣泛增多，上皮細胞多為單層立方上皮，腔內面積增大；4 d時已出現初級肺泡，大小不均，間質變薄，呈條索狀排列；7 d時，肺組織基本結構單位為初級肺泡，分隔增多，結構逐漸規整，出現脊突向腔內；14 d時，肺泡成熟化，間隔變薄，數目增加；21 d時，肺組織基本結構單位為成熟肺泡，結構規整，分隔菲薄。見圖1。

2.2 小鼠肺發育各期CD31含量及肺微血管密度

小鼠肺組織免疫組織化學染色顯示，在孕17.5 d肺發育小管期末，血管內皮細胞數量較多，與肺泡上皮細胞緊密排列；出生后1 d時，肺血管繼續發育，血管內皮細胞密度仍處于較高水平，沿原始肺腺泡腔廣泛分布；4 d時，血管內皮細胞呈條索狀分布，伴行肺泡上皮形成初級肺泡。至出生后7、14、21 d肺泡期，肺毛細血管網不斷擴張，同一高倍鏡視野下，血管內皮細胞數量明顯減少，所占比例明顯降低，形成與肺泡分隔伴行的毛細血管層，血管內皮細胞數量和比例隨小鼠日齡增大逐漸趨于穩定，最終形成成熟肺微血管網絡。見圖2。

CD31陽性細胞光密度值測量結果顯示，在孕17.5 d，CD31陽性細胞含量最高，光密度值達到最高，出生后1 d時，光密度值稍降低。與孕17.5 d、出生后1 d組相比，出生后7、14、21 d組光密度值明顯降低（P＜0.01）。微血管密度計算結果顯示，孕17.5 d時，微血管密度最高，出生后1 d仍處于較高水平，與孕17.5 d及出生后1 d時相比，出生后4、7、14、21 d微血管密度均明顯降低，出生后21 d時微血管密度已處于較低水平（P＜0.01）。見圖3。

2.3 各組肺組織Foxp3及SP-C、VEGF-A、Ang-1 mRNA表達

肺組織內Foxp3 mRNA在孕17.5 d小管期表達最高，出生后1 d時仍大量表達，后呈現不斷減少趨勢，與孕17.5 d和出生后1 d組相比，出生后4、7、14、21 d組Foxp3 mRNA明顯減少（P均＜0.01）。SP-C mRNA在小鼠出生后1 d表達最高，出生后4 d開始減少，直至出生后21 d（P均lt;0.01）。VEGF-A mRNA在孕17.5 d表達最高，出生后1 d時稍減少，與孕17.5 d及出生后1 d相比，出生后4 d及以后組呈現不斷減少趨勢（P均lt;0.01）。Ang-1 mRNA同樣于孕17.5 d表達最高，與孕17.5 d組相比，出生后小鼠表達明顯減少，并隨小鼠日齡增大不斷減少，直至出生后21 d（P均lt;0.01）。見圖4。

2.4 各組肺組織Foxp3及SP-C、VEGF-A、Ang-1蛋白表達

Foxp3蛋白在小管期已有表達，在孕17.5 d小管期及出生后1 d囊泡早中期表達最高，與孕17.5 d和出生后1 d組相比，出生后4 d開始明顯降低，直至出生后21 d（P均lt;0.01）。SP-C蛋白表達于出生后1 d達到最高，與出生后1 d時相比，4 d時開始減少，7、14、21 d肺泡期明顯減少（P均lt;0.01）。VEGF-A蛋白于孕17.5 d含量最高，出生后1 d時仍有大量表達，4 d時開始減少，至出生后21 d時含量減少到最低（P均lt;0.01）。Ang-1蛋白在孕17.5 d時表達最高，出生后4 d表達顯著減少，至21 d肺泡化晚期維持在相對較低水平（P均lt;0.01）。見圖5。

2.5 Foxp3與SP-C、VEGF-A及Ang-1在小鼠肺發育中相關性分析

相關性分析結果顯示，Foxp3與肺發育的相關蛋白SP-C、VRGF-A及Ang-1呈正相關（P均lt;0.01），相關系數分別為0.661、0.630和0.738。見圖6。

3 討論

人類胎齡小于36周早產兒，肺發育處于小管期和囊泡期，36周開始進入肺泡期，至大概21歲時肺泡化完成。小管階段接近尾聲時，肺可能會發生第一次氣體交換，標志著肺換氣功能建立，極早早產兒因此可能存活。小鼠肺發育與人相似，孕17.5 d小鼠處于小管期末（相當于24周早產兒），直至約生后36 d（相當于人類17～21歲）肺泡化完成［10］。

SP-C表達量可間接反映肺泡上皮細胞發育程度，本研究發現，在小管期末，SP-C蛋白含量已積累到較高水平；進入到囊泡中期，SP-C蛋白含量最高；到囊泡晚期及肺泡期，SP-C含量不斷降低，最終穩定在較低水平。小管期肺臟的發育特點為肺實質的管狀化，到小管期末，已形成原始肺泡管和肺腺泡，此時AEC Ⅱ已大量增殖，故SP-C蛋白含量積累到較高水平。進入到囊泡早期和中期，肺腺泡保持數量不變，僅有極少數的末端氣道在囊泡早中期形成，AEC Ⅱ仍略有增加，此時SP-C蛋白含量最高。到囊泡晚期及肺泡期，肺實質的體積和表面積增長主要發生在腺泡內，AEC Ⅱ繼續分化為行使氣體交換功能的AECⅠ，AEC Ⅱ數量逐漸減少［11］，SP-C含量也不斷降低，最終隨著肺發育逐漸成熟而趨于穩定。

VEGF是整個胚胎期、胎兒期和出生后肺血管生長與維持最關鍵的調節因子之一，參與調節肺血管內皮細胞遷徙、生存、增殖和分化，VEGF-A是VEGF最主要結構成分［12］。Ang-1能促進血管內皮細胞與細胞外基質、肺泡上皮細胞間的相互作用，有助于肺血管成熟和肺換氣結構成熟［3］。本研究發現，CD31含量及肺血管發育相關標志物VEGF-A及Ang-1在肺發育過程中呈動態變化，在小管期及囊泡早中期肺血管內皮細胞大量增殖分化，VEGF-A及Ang-1表達最為活躍，在隨后的囊泡晚期及肺泡期，血管內皮細胞增殖分化速度放緩，其相應標志物VEGF-A及Ang-1的表達水平也逐漸下降，最終趨于平穩，這與已有報道新生大鼠VEGF-A及Ang-1表達的潛在趨勢相符合［13］。

Fox是具有多種功能的轉錄因子家族，與細胞生長發育的調控密切相關，Foxp3是Fox家族成員之一，對細胞增殖及分化有多向調節作用［14］。研究發現，新生小鼠心肌細胞損傷再生時Foxp3表達量顯著增加［15］，妊娠期間敲低Foxp3會阻礙胎兒心肌細胞的正常增殖［6］，此外，抑制Foxp3基因表達可導致肺損傷修復時肺泡上皮細胞和血管內皮細胞增殖受阻［7］，說明Foxp3有促進細胞增殖作用。本研究發現，在肺發育過程中，Foxp3在小管期及囊泡早中期大量表達，在出生后4 d囊泡晚期及7、14、21 d肺泡期表達逐漸下降，出生后4 d及更大日齡組內差異不顯著。小管期及囊泡早中期肺腺泡區面積增大，AEC Ⅱ進一步增殖，遠端毛細血管網進一步生成［16］，提示Foxp3的高表達時期與氣體交換結構形成高峰期相適應。相關性分析顯示，Foxp3與SP-C、VEGF-A及Ang-1的表達呈正相關，提示Foxp3表達有助于肺泡上皮及肺血管發育。Foxp3是Treg表達的一種重要轉錄因子，對于Treg細胞表型穩定和功能發揮起關鍵作用，也是Treg的常用分子標記。在肺損傷修復早期，Foxp3通過調節Treg促進新生血管生成［17］，Foxp3+Treg細胞與AEC Ⅱ共培養可促進AEC Ⅱ增殖［18］，而敲低Foxp3后Treg細胞數量明顯下降，肺泡上皮及肺微血管內皮細胞修復再生能力喪失［19］。以上結果提示，Foxp3在小管期及囊泡早中期大量表達的最主要細胞類型可能為Treg細胞。

綜上所述，Foxp3在胎肺期及出生后早期呈動態表達，Foxp3在小管期及囊泡早中期的高表達與SP-C、VEGF-A及Ang-1呈正相關，提示Foxp3可能促進肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞的增殖，參與肺發育過程。敲除或過表達Foxp3對SP-C、VEGF-A、Ang-1及肺發育影響以及Foxp3高表達的可能細胞類型，仍需進一步研究。

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［收稿日期］ 2023-05-09" ［編輯］ 郭 欣

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（82171702）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20201226）

［作者簡介］江健鋒（1998—），男，碩士研究生；盧紅艷（通訊作者），主任醫師，教授，博士生導師，E-mail： lhy5154@163.com