人臍帶間充質干細胞源胞外囊泡對屋塵螨誘導的哮喘小鼠氣道炎癥的影響

［摘要］ 目的： 探討人臍帶間充質干細胞源胞外囊泡（human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles，hUCMSC-EVs）對屋塵螨（house dust mite，HDM）誘導的哮喘小鼠氣道炎癥的影響。方法： 超高速離心法提取hUCMSC-EVs；透射電鏡觀察hUCMSC-EVs形態(tài)；蛋白質印跡法檢測胞外囊泡標志物腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）和熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）表達。將15只雌性BALB/C小鼠隨機均分為3組，每組5只，分別為對照組（不做任何處理）、HDM組（HDM處理）和HDM+EVs組（HDM+hUCMSC-EVs處理）；蘇木精伊紅（HE）和過碘酸雪夫（PAS）染色法分別觀察各組小鼠肺臟氣道炎性細胞浸潤和杯狀細胞化生；收集各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）并對總細胞和嗜酸性粒細胞進行計數(shù)；ELISA法檢測BALF中IL-4和IL-13含量；蛋白質印跡法檢測肺臟中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和閉鎖連接蛋白1（ZO-1）表達。將人支氣管上皮BEAS-2B細胞株分為對照組和EVs組（DIO標記的hUCMSC-EVs處理），共聚焦顯微鏡觀察細胞對DIO標記的hUCMSC-EVs的內吞情況。另將BEAS-2B細胞分為3組：對照組、HDM組（HDM處理）、HDM+EVs組（HDM+hUCMSC-EVs處理），蛋白質印跡法檢測細胞中E-cadherin和ZO-1表達。結果： hUCMSC-EVs呈杯托樣膜性結構且表達HSP70和TSG101。與HDM組相比，HDM+EVs組小鼠氣道炎性評分、PAS評分、BALF中總細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)、IL-4和IL-13含量均顯著下調（P均lt;0.01），而肺臟組織中E-cadherin和ZO-1表達明顯增加（Plt;0.05）。體外實驗顯示hUCMSC-EVs可被人支氣管上皮BEAS-2B細胞內吞；與HDM組相比，HDM+EVs組BEAS-2B細胞中E-cadherin和ZO-1表達明顯增加（Plt;0.01或lt;0.05）。結論： hUCMSC-EVs可顯著改善HDM誘導的小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤和氣道杯狀細胞化生。

［關鍵詞］ 人臍帶間充質干細胞源胞外囊泡；過敏性哮喘；屋塵螨；氣道炎癥；支氣管上皮細胞

［中圖分類號］ R562.1

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 1671-7783（2024）02-0138-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230149

［引用格式］羅鑫凱，鄭婷婷，董利陽，等. 人臍帶間充質干細胞源胞外囊泡對屋塵螨誘導的哮喘小鼠氣道炎癥的影響［J］. 江蘇大學學報（醫(yī)學版）， 2024， 34（2）： 138-144.

Effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles on house dust mite-induced airway inflammation in asthmatic mice

LUO Xinkai， ZHENG Tingting， DONG Liyang， XU Xiaowei， GAO Xuerong， GU Weifeng， MAO Chaoming

（Department of Nuclear Medicine， Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001， China）

［Abstract］ Objective： To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles （hUCMSC-EVs） on house dust mite （HDM）-induced airway inflammation in asthmatic mice. Methods： hUCMSC-EVs was extracted by ultra-high speed centrifugation; morphological characteristics of hUCMSC-EVs were observed by transmission electron microscopy. EVs markers， tumor susceptibility gene 101 （TSG101） and heat shock protein 70 （HSP70）， were detected by Western blotting. Fifteen female BALB/C mice were randomly divided into 3 groups， 5 mice in each group， including control group （without any treatment）， HDM group （HDM treatment） and HDM+EVs group （HDM+hUCMSC-EVs treatment）. Hematoxylin and eosin （HE） and periodic acid-Schiff （PAS） staining were used to observe the inflammatory cell infiltration and goblet cell hyperplasia of lung airway in each group. Bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was collected， and the numbers of total cells and eosinophils were counted. The contents of IL-4 and IL-13 in BALF were detected by ELISA. The expression of E-cadherin and atresia connexin 1（ZO-1） in the lungs was detected by Western blotting. Human bronchial epithelial BEAS-2B cell lines were divided into control group and EVs group （DIO-labeled hUCMSC-EVs treatment）. Confocal microscopy was used to observe the endocytosis of DIO-labeled hUCMSC-EVs cells. BEAS-2B cells were divided into three groups： control group， HDM group （HDM treatment）， and HDM+EVs group （HDM+hUCMSC-EVs treatment）， and the protein expression of E-cadherin and ZO-1 in the cells was detected by Western blotting. Results： hUCMSC-EVs showed a circular membrane structure and expressed HSP70 and TSG101. Compared with HDM group， airway inflammatory score， PAS score， the number of total cells and eosinophils in BALF， the contents of IL-4 and IL-13 in BALF were significantly decreased in HDM+EVs group （all Plt;0.01）， whereas E-cadherin and ZO-1 expressions in lung tissues were markedly increased （Plt;0.05）. In vitro experiments showed that hUCMSC-EVs could be endocytosed by human bronchial epithelial cell line BEAS-2B. Compared with HDM group， the expressions of E-cadherin and ZO-1 were significantly increased in HDM+EVs group （Plt;0.01 or lt;0.05）. Conclusion： hUCMSC-EVs could ameliorate HDM-induced peri-airway inflammatory cell infiltration and airway goblet cell hyperplasia in mice.

［Key words］ human umbilical cord mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles; allergic asthma; house dust mite; airway inflammation; bronchial epithelial cells

哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)性疾病，以氣道炎癥和氣道黏液高分泌為主要病理特征［1］。我國哮喘患者人數(shù)高達4 500萬（2/3為過敏性哮喘），哮喘患病率為4.2%且呈逐年遞增態(tài)勢［2-3］。哮喘患者的常規(guī)用藥有皮質類固醇和長效β2受體激動劑，但這些藥物僅限于對癥治療而無法從根本上治愈疾病［4］。

研究證實，屋塵螨（house dust mite，HDM）是誘發(fā)過敏性哮喘發(fā)生的常見變應原，其誘導氣道上皮細胞間屏障蛋白缺失后可進入氣道黏膜下層進而促發(fā)機體Ⅱ型免疫反應［5］。通過吸入HDM法構建的動物哮喘模型可以很好地模擬人類哮喘的致病過程，現(xiàn)已廣泛用于哮喘發(fā)病機制及治療策略的研究［6］。

間充質干細胞源胞外囊泡（mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles，MSC-EVs）是一種間充質干細胞（MSCs）分泌的納米級膜性囊泡。由于微小、無核、易存儲等特點，MSC-EVs已成為“MSCs非細胞”治療策略的代表且用于多種肺臟疾病的臨床前干預［7-8］。近年來，Duong等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以改善HDM誘導的過敏性氣道炎癥和氣道高反應性。然而目前尚不清楚MSC-EVs對HDM誘導的哮喘小鼠的作用。因此，本研究擬探討人臍帶MSC-EVs（human umbilical cord MSC-EVs，hUCMSC-EVs）對HDM誘導的哮喘小鼠氣道病理的影響并初步闡述其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 hUCMSCs的提取參考本課題組前期報道［10］，臍帶樣品采集經(jīng)孕婦本人知情同意且流程經(jīng)江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會同意。人支氣管上皮細胞系BEAS-2B購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

SPF級雌性BALB/C小鼠15只，8周齡，體重（20±2）g，購自江蘇大學實驗動物中心，合格證號No.202224908。小鼠自由進食和飲水，保證12 h/12 h明暗交替的飼養(yǎng)環(huán)境，維持相對濕度為40%～70%。本研究依照江蘇大學動物保護和使用委員會指南協(xié)議進行。

1.1.2 主要試劑和儀器 hUCMSCs培養(yǎng)基（蘇州賽業(yè)公司）；DMEM、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（美國Gibco公司）；HDM（XPB82D3A2.5）購自北京博蕾德生物科技有限公司；IL-4和IL-13酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；DIO熒光染料購自上海Invitrogen公司；Triton X-100、DAPI染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司；兔抗人單克隆抗體腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、兔抗人單克隆抗體熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、小鼠抗（人、小鼠）單克隆抗體E-cadherin（美國Abcam公司）；兔抗（人、小鼠）多克隆抗體閉鎖連接蛋白1（ZO-1）、小鼠抗（人、小鼠）單克隆抗體GAPDH（美國Proteintech公司）；山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗（美國Affinity公司）；ECL發(fā)光液和PVDF膜（美國Millipore公司）。

1.2 hUCMSC-EVs提取和鑒定

1.2.1 hUCMSC-EVs提取 hUCMSCs達80%融合時更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集上清液，順序經(jīng)300×g離心10 min，2 000×g離心20 min，100 000×g離心90 min（均4 ℃）；收集沉淀，PBS洗滌；再次梯度離心后收集沉淀，即hUCMSC-EVs。儲存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 透射電鏡觀察hUCMSC-EVs形態(tài) 采用4%多聚甲醛和4%戊二醛固定hUCMSC-EVs，然后滴加至碳涂層銅網(wǎng)，滴加磷鎢酸溶液（pH=7.0），染色30 s，隨后烘干。在透射電鏡下觀察hUCMSC-EVs形態(tài)，拍照記錄。

1.2.3 蛋白質印跡實驗檢測hUCMSC-EVs中HSP70、TSG101蛋白表達水平 取“1.2.1”中提取的hUCMSC-EVs，加入適當體積的RIPA裂解液（使用前數(shù)分鐘加入PMSF，致PMSF終濃度為1 mmol/L），充分振蕩混勻后置于冰上（重復3次，每次間隔10 min），然后13 000 r/min離心10 min，取上清液。BCA法測定提取的蛋白濃度，隨后加入上樣緩沖液充分混勻，95 ℃煮10 min，恢復至室溫備用。配制10%分離膠行SDS-PAGE（每孔加入20 μg蛋白樣品），60 mA電泳50 min使蛋白轉至PVDF膜；100 V轉膜120 min；將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h（緩慢搖晃）；加入相應一抗HSP70（1∶1 000）、TSG101（1∶3 000），4 ℃孵育過夜；1×TBST洗膜3次；加入HPR標記的山羊抗兔二抗（1∶3 000），37 ℃孵育1 h；1×TBST洗滌3次；ECL曝光顯影，計算灰度值。

1.3 動物相關實驗

1.3.1 小鼠哮喘模型構建和hUCMSC-EVs干預 將15只雌性BALB/C小鼠按隨機數(shù)字法均分為3組，每組5只，分別為對照組、HDM組（哮喘模型）和HDM+EVs組（哮喘模型+hUCMSC-EVs干預）。HDM誘導的小鼠哮喘模型的構建參照文獻［11］，將HDM提取物溶解于無菌PBS中，HDM濃度為1 μg/μL。對照組小鼠不做任何處理；HDM組小鼠在第0天（致敏）和第11～13天（激發(fā)）予以HDM鼻內給藥，20 μg/次，共4次（哮喘模型）；HDM+EVs組小鼠在第11天HDM鼻內激發(fā)12 h后進行尾靜脈輸注hUCMSC-EVs，每只小鼠注射0.1 mL EVs混合液（40 μg hUCMSC-EVs溶解于0.1 mL PBS）；在第14天，采用脊椎脫臼法處死各組小鼠并收集標本（肺泡灌洗液和肺組織）。哮喘模型構建成功以肺臟病理診斷為準，即出現(xiàn)氣道炎癥細胞浸潤和杯狀細胞化生。

1.3.2 肺組織蘇木精伊紅（HE）染色和過碘酸雪夫（PAS）染色及評分 取小鼠右肺組織，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋和切片，采用HE、PAS染色評估肺部病理。

采用半定量評分評估支氣管周圍炎性細胞浸潤［12］，分級如下：0級（未見炎性細胞）、1級（偶見炎性細胞）、2級（支氣管被1～3層炎性細胞包圍）、3級（支氣管或血管被4～5層炎性細胞包圍）、4級（大多數(shù)支氣管或血管被5層以上炎性細胞包圍）。基于上皮中杯狀細胞的百分比［13］，根據(jù)五點評分系統(tǒng)（0～4級）評價病理變化：0級，無杯狀細胞；1級，＜25%；2級，［25%，50%）；3級，［50%，75%）；4級，≥75%。觀察載玻片，計算每只小鼠的平均HE和PAS染色評分。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液獲取及細胞計數(shù) 處死小鼠后，對其進行乙醇浸泡消毒，隨后取仰臥位固定于解剖板上，沿氣管前正中切開顯露氣管，進行氣管插管，并用縫合線固定氣管，結扎小鼠的左支氣管。將預冷的無菌PBS（0.5 mL）分兩次注入右肺。緩慢來回抽吸3次，收集支氣管肺泡灌洗液，每只小鼠重復灌洗3次。將收集的灌洗液于4 ℃，1 500 r/min離心10 min；收集上清液于-80 ℃保存，用于細胞因子分析；細胞沉淀重懸于1 mL PBS中，采用血細胞計數(shù)器計數(shù)炎性細胞的總量，采用瑞氏和吉姆薩染色進行嗜酸性粒細胞計數(shù)。

1.3.4 ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13含量 在96孔板中加入100 μL對應的標準品、標準品稀釋液以及肺泡灌洗液，每孔加入50 μL待測抗體，室溫孵育1.5 h；洗滌液反復洗滌6次；每孔加入100 μL HRP標記的親和素，室溫孵育0.5 h；洗滌液反復洗滌6次；加入底物顯色，嚴格室溫避光孵育20 min；加入終止液后，20 min內檢測光密度（D）值。采用酶標儀在450 nm和630 nm處測定最終反應物的D值，依據(jù)標準品繪制標準曲線，計算IL-4和IL-13含量。

1.3.5 蛋白質印跡實驗檢測各組小鼠肺臟中ZO-1和E-cadherin蛋白表達水平 取“1.3.1”收集的小鼠肺組織，充分研磨，實驗方法同“1.2.3”。一抗稀釋比ZO-1和E-cadherin均1∶1 000，GAPDH 1∶2 000；相應HPR標記的山羊抗兔/小鼠二抗1∶3 000。

1.4 細胞相關實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人支氣管上皮細胞系BEAS-2B培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM（含100 IU/mL青霉素及100 μg/L鏈霉素）中，并置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當細胞密度達80%～90%時，將細胞接種于6孔板中（3×105個細胞/孔），分為3組：對照組、HDM組、HDM+EVs組。對照組不做任何處理，HDM組中加入300 ng/mL HDM［14］，HDM+EVs組加入300 ng/mL HDM+20 μg/mL hUCMSC-EVs［15］。

1.4.2 激光共聚焦顯微鏡觀察 參考操作說明將綠色熒光染料DIO標記于hUCMSC-EVs。將細胞玻片置于24孔板中，并將人支氣管上皮細胞系BEAS-2B接種于培養(yǎng)板，分為兩組：對照組和EVs組。待細胞融合達60%時，兩組均換用無血清的DMEM，其中對照組不做處理，EVs組加入DIO標記的hUCMSC-EVs，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h；PBS洗滌3次；每孔加入4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次；加入0.5% Triton X-100，孵育5 min；棄上清液，用0.5 μg/mL DAPI對細胞核進行染色；PBS洗滌；封片；采用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.4.3 蛋白質印跡實驗檢測細胞中ZO-1和E-cadherin蛋白表達水平 按照“1.4.1”分組處理細胞，棄上清液，用PBS洗滌2遍。實驗方法同“1.2.3”。相應一抗及二抗稀釋比同“1.3.5”。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)先進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hUCMSC-EVs形態(tài)及鑒定

透射電鏡結果顯示，hUCMSC-EVs呈圓形杯托樣膜性結構（黑色箭頭所指），直徑為100～200 nm（圖1A）；蛋白質印跡結果顯示，hUCMSC-EVs表達EVs標志物TSG101和HSP70（圖1B）。

2.2 小鼠肺臟組織病理學變化

HE染色結果顯示，與對照組相比，HDM組小鼠支氣管上皮增生明顯，氣管周圍有大量炎性細胞浸潤且炎癥評分顯著增高（Plt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組上皮增生減輕，支氣管周圍炎性細胞浸潤減少且炎癥評分明顯降低（Plt;0.01，圖2A）。PAS染色結果顯示，與對照組相比，HDM組小鼠肺上皮層有明顯杯狀細胞化生且PAS評分明顯升高（Plt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組杯狀細胞化生減輕，同時PAS評分顯著降低（Plt;0.01，圖2B）。由此表明，hUCMSC-EVs可顯著抑制HDM誘導的哮喘小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤和杯狀細胞化生。

2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞和Ⅱ型細胞因子含量

與對照組相比，HDM組支氣管肺泡灌洗液中總細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)明顯增加（P均lt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組總細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)顯著減少（P均lt;0.01，圖3A～B）。ELISA結果顯示，與對照組相比，HDM組支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13含量明顯升高（P均lt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組IL-4和IL-13含量顯著降低（P均lt;0.01，圖3C～D）。由此表明，hUCMSC-EVs可明顯降低HDM誘導的哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞和Ⅱ型細胞因子含量。

2.4 hUCMSC-EVs對哮喘小鼠肺組織中E-cadherin和ZO-1表達的影響

蛋白質印跡結果顯示（圖4），與對照組相比，HDM組小鼠肺組織中E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05或Plt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平明顯升高（P均lt;0.05）。由此表明，hUCMSC-EVs可以部分恢復哮喘小鼠肺組織中上皮連接蛋白表達。

2.5 體外實驗觀察BEAS-2B細胞對hUCMSC-EVs的內吞

共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，EVs組人支氣管上皮BEAS-2B細胞胞質內出現(xiàn)綠色熒光，而對照組無綠色熒光（圖5），說明hUCMSC-EVs可被BEAS-2B細胞內吞。

2.6 hUCMSC-EVs對BEAS-2B細胞中E-cadherin和ZO-1表達的影響

與對照組相比，HDM組BEAS-2B細胞中E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平明顯下降（P均lt;0.01）；與HDM組相比，HDM+EVs組E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平明顯升高（Plt;0.01或Plt;0.05，圖6）。由此提示，在體外細胞模型中，hUCMSC-EVs同樣可以恢復上皮連接蛋白的表達。

3 討論

鑒于臍帶組織獲取的便捷性及無倫理爭議，本研究選擇hUCMSCs作為MSC-EVs的來源［16］。本研究結果顯示，從hUCMSCs培養(yǎng)上清液中獲取的微粒呈圓盤樣結構，直徑為100～200 nm，并表達TSG101和HSP70，表明hUCMSC-EVs提取成功。誘發(fā)人類哮喘發(fā)生的過敏原大多經(jīng)呼吸的方式進入氣道，由于HDM是最常見的室內過敏原，因此本研究采用HDM滴鼻方式構建哮喘小鼠模型并評估hUCMSC-EVs對哮喘的干預功效。氣道炎癥和氣道黏液高分泌是哮喘的主要病理特征，且哮喘是一種典型的Ⅱ型免疫性疾病［17］。本研究結果顯示，與對照組相比，HDM組小鼠氣道炎癥評分和PAS評分均顯著增高，肺泡灌洗液中炎性細胞（如嗜酸性粒細胞）數(shù)量以及Ⅱ型細胞因子IL-4和IL-13含量顯著升高，提示哮喘模型構建成功。而hUCMSC-EVs可顯著抑制HDM哮喘小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤、氣道杯狀細胞化生以及肺泡灌洗液中炎性細胞和IL-4及IL-13含量，提示hUCMSC-EVs對HDM誘發(fā)的哮喘小鼠模型存在干預作用。

氣道上皮屏障是氣道阻止過敏原入侵的第一道防線，而上皮屏障功能障礙是哮喘發(fā)生的始動環(huán)節(jié)［18］。HDM可誘導支氣管上皮細胞連接蛋白如E-cadherin和ZO-1表達下調，導致細胞連接受到損傷，致使吸入的HDM到達黏膜下層［6，19］。HDM經(jīng)黏膜下層的樹突狀細胞攝取后呈遞給T細胞進而引發(fā)強烈的Ⅱ型免疫反應，致使IL-4和IL-13等細胞因子含量增加，造成氣道炎癥和杯狀細胞化生等病理狀態(tài)的形成［20］。顯然，上皮連接蛋白的調節(jié)為哮喘干預的潛在靶點。Ha等［21］研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒衣殼來源的球形結構域（Knob）蛋白可上調支氣管上皮細胞中E-cadherin表達，而進一步體內實驗證實Knob亦顯著減輕哮喘小鼠氣道炎癥。近來，胡倩等［22］研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSC-EVs可上調HDM處理的支氣管上皮細胞中E-cadherin表達。本研究結果亦顯示，hUCMSC-EVs顯著上調HDM處理的支氣管上皮細胞中E-cadherin和ZO-1蛋白含量。此外，本研究結果表明，hUCMSC-EVs可以與支氣管上皮細胞結合，進一步證實hUCMSC-EVs對支氣管上皮細胞存在直接調節(jié)作用。重要的是，本研究結果顯示，hUCMSC-EVs致HDM模型小鼠肺臟中E-cadherin和ZO-1表達上調，支氣管肺泡灌洗液中總細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量減少且IL-4和IL-13含量降低，由此提示hUCMSC-EVs可通過對哮喘發(fā)生發(fā)展上游事件，即上皮細胞連接蛋白缺失的調節(jié)來發(fā)揮抗哮喘作用。

總之，hUCMSC-EVs可減輕HDM誘導的哮喘小鼠氣道周圍炎性細胞浸潤和杯狀細胞化生，這可能與上調連接蛋白E-cadherin和ZO-1表達有關。而鑒于hUCMSC-EVs可通過轉運活性物質（如RNA和蛋白）至受體細胞來發(fā)揮調節(jié)功能的事實［23］，hUCMSC-EVs發(fā)揮抗哮喘的具體功能分子及機制有待進一步研究。

此外，除了靜脈給藥外，霧化吸入EVs——一種非侵襲性且具臨床應用前景的呼吸道疾病給藥方式［24］是否對HDM哮喘有干預功效有待探究。

［參考文獻］

［1］ Porsbjerg C， Me′lén E， Lehtimki L， et al. Asthma［J］. Lancet， 2023， 401（10379）： 858-873.

［2］ Huang K， Yang T， Xu J， et al. Prevalence， risk factors， and management of asthma in China： a national cross-sectional study［J］. Lancet， 2019， 394（10196）： 407-418.

［3］ Akar-Ghibril N， Casale T， Custovic A， et al. Allergic endotypes and phenotypes of asthma［J］. J Allergy Clin Immunol Pract， 2020， 8（2）： 429-440.

［4］ Kew KM， Dahri K. Long-acting muscarinic antagonists （LAMA） added to combination long-acting β2-agonists and inhaled corticosteroids （LABA/ICS） versus LABA/ICS for adults with asthma［J］. Cochrane Database Syst Rev， 2016， 2016（1）： CD011721.

［5］ CalderóN MA， Linneberg A， Kleine-Tebbe J， et al. Respiratory allergy caused by house dust mites： What do we really know？［J］. J Allergy Clin Immunol， 2015， 136（1）： 38-48.

［6］ Heijink IH， Kuchibhotla VNS， Roffel MP， et al. Epithelial cell dysfunction， a major driver of asthma development［J］. Allergy， 2020， 75（8）： 1902-1917.

［7］ Shi MM， Yang QY， Monsel A， et al. Preclinical efficacy and clinical safety of clinical-grade nebulized allogenic adipose mesenchymal stromal cells-derived extracellular vesicles［J］. J Extracell Vesicles， 2021， 10（10）： e12134.

［8］ 周新茹， 金倩， 張蕾蕾， 等. 人臍帶間充質干細胞來源外泌體促進小膠質細胞向M2極化［J］. 江蘇大學學報（醫(yī)學版）， 2020， 30（4）： 277-281.

［9］ Duong KM， Arikkatt J， Ullah MA， et al. Immunomodu-lation of airway epithelium cell activation by mesenchymal stromal cells ameliorates house dust mite-induced airway inflammation in mice［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2015， 53（5）： 615-624.

［10］ Dong L， Pu Y， Zhang L， et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles promote lung adenocarcinoma growth by transferring miR-410［J］. Cell Death Dis， 2018， 9（2）： 218.

［11］ Wypych TP， Pattaroni C， Perdijk O， et al. Microbial metabolism of L-tyrosine protects against allergic airway inflammation［J］. Nat Immunol， 2021， 22（3）： 279-286.

［12］ Cho KS， Park MK， Kang SA， et al. Adipose-derived stem cells ameliorate allergic airway inflammation by inducing regulatory T cells in a mouse model of asthma［J］. Mediators Inflamm， 2014， 2014： 436476.

［13］ Padrid P， Snook S， Finucane T， et al. Persistent airway hyperresponsiveness and histologic alterations after chronic antigen challenge in cats［J］. Am J Respir Crit Care Med， 1995， 151（1）： 184-193.

［14］ Liu M， Lu J， Zhang Q， et al. Clara cell 16 KDa protein mitigates house dust mite-induced airway inflammation and damage via regulating airway epithelial cell apoptosis in a manner dependent on HMGB1-mediated signaling inhibition［J］. Mol Med， 2021， 27（1）： 11.

［15］ Dong L， Wang Y， Zheng T， et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice［J］. Stem Cell Res Ther， 2021， 12（1）： 4.

［16］ Secco M， Zucconi E， Vieira NM， et al. Multipotent stem cells from umbilical cord： cord is richer than blood！［J］. Stem Cells， 2008， 26（1）： 146-150.

［17］ Lambrecht BN， Hammad H， Fahy JV. The cytokines of asthma［J］. Immunity， 2019， 50（4）： 975-991.

［18］ Akdis CA. Does the epithelial barrier hypothesis explain the increase in allergy， autoimmunity and other chronic conditions？［J］. Nat Rev Immunol， 2021， 21（11）： 739-751.

［19］ Wan H， Winton HL， Soeller C， et al. Der p 1 facilitates transepithelial allergen delivery by disruption of tight junctions［J］. J Clin Invest， 1999， 104（1）： 123-133.

［20］ Komlósi ZI， van de Veen W， Kovcs N， et al. Cellular and molecular mechanisms of allergic asthma［J］. Mol Aspects Med， 2022， 85： 100995.

［21］ Ha SG， Dileepan M， Ge XN， et al. Knob protein enhances epithelial barrier integrity and attenuates airway inflammation［J］. J Allergy Clin Immunol， 2018， 142（6）： 1808-1817.e3.

［22］ 胡倩， 李國榮， 侯晨輝， 等. 間充質干細胞來源外泌體對HDM刺激的氣道上皮細胞炎癥及EMT的影響［J］. 中國免疫學雜志， 2023， 39（3）： 560-565.

［23］ Wu P， Zhang B， Ocansey DKW， et al. Extracellular vesicles： A bright star of nanomedicine［J］. Biomaterials， 2021， 269： 120467.

［24］ Xu X， Wang Y， Luo X， et al. A non-invasive strategy for suppressing asthmatic airway inflammation and remodeling： Inhalation of nebulized hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles［J］. Front Immunol， 2023， 14： 1150971.

［收稿日期］ 2023-05-30" ［編輯］ 劉星星

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81900562，82300035）；江蘇省衛(wèi)健委醫(yī)學科研項目（H2023021）；江蘇省衛(wèi)健委“血地寄防”科研項目（x202306）；鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展）項目（SH2021050）

［作者簡介］羅鑫凱（1999—），男，碩士研究生；董利陽（通訊作者），副研究員，碩士生導師，E-mail： liyangdong@ujs.edu.cn；鄭婷婷（通訊作者），副主任技師，碩士生導師，E-mail： tingtingzheng@ujs.edu.cn