兩種白穎苔草對梯度NaCl脅迫的生理生化響應及綜合評價

關鍵詞：白穎苔草;鹽脅迫;抗氧化酶活性;隸屬函數;綜合評價

土壤鹽漬化是影響植物生長發育、限制農作物產量最重要的非生物脅迫因素之一[1]。世界范圍內，每天約有2000hm2 的耕地由于土地鹽堿化而損失[2]。通過在受鹽堿化影響的土地上建植耐鹽植物，能夠起到對鹽堿地改良、修復和再利用的作用。研究表明，草坪草不僅在城市綠化、園林觀賞等方面發揮作用，也在屋頂綠化[3]、水土保持[4]及土地改良[5]等生態方面有廣泛的應用價值。

苔草屬（Carex L.）是草坪草中重要的成員，同時也是莎草科中體量較大的屬之一[6]，廣泛分布于世界各地的溫帶和寒帶[7]地區。近年來關于苔草屬及其分類下植物的研究不斷增多，包括苔草屬植物的生長、返青特性[8]、抗逆性比較[9-11]等。白穎苔草（Carexrigescens）是莎草科（Cyperaceae）苔草屬寸草亞種，是我國特有的鄉土草種，廣泛分布于我國河北、北京、甘肅、內蒙古、山東等北方省份[12-13]，具有成坪快、觀賞價值高、耐踐踏、低養護、返青早等優良特性。同時，與其他苔草屬物種一樣[14]，白穎苔草對各類環境逆境均有良好的耐受性。

白穎苔草抗逆性方面的研究目前已經有一定進展。江佳琳等[15-16]鑒定了不同地區采集的白穎苔草耐熱性和耐遮蔭性;張昆等[17]計算出‘綠坪1號’白穎苔草耐鹽閾值為262.59mmol·L-1。ZHANG等[18]還從分子層面上利用轉錄組學技術對白穎苔草耐鹽相關基因進行了挖掘，并完成了對白穎苔草糖基轉移酶基因（CrUGT87A1）的耐鹽性[19]和咖啡酸O-甲基轉移酶基因（CrCOMT）的耐鹽[20]及耐旱[21]功能驗證。同時，HU 等[22]還發現外源施加乙酸可以增強白穎苔草耐鹽性。已有的研究發現‘綠坪1號’和‘綠坪2號’可以作為白穎苔草應答短期鹽脅迫的兩種代表性材料[23]，然而長期鹽脅迫下兩種白穎苔草的生理生化和抗氧化酶活性變化仍需進一步探明。

為研究長期鹽脅迫下白穎苔草生理生化指標和抗氧化酶活的變化，本試驗以‘綠坪1 號’（Carexrigescens ‘LvPingNo.1’）和‘綠坪2號’白穎苔草（Carexrigescens ‘LvPingNo.2’）品種為材料，用0，100，200和300mmol·L-1NaCl溶液模擬鹽脅迫，對其進行耐鹽性評價。通過測定鹽脅迫下材料的光合、生理生化和抗氧化酶活等指標，利用主成分分析法和模糊數學隸屬函數法進行數據分析，對兩白穎苔草材料耐鹽性進行綜合評價，以期為鹽堿地改良利用提供新的植物材料，同時也為白穎苔草后續耐鹽的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試白穎苔草種子取自中國農業大學草業科學與技術學院草坪科學與工程系。

試驗在中國農業大學草業科學與技術學院溫室中進行，溫度23～28℃，光照強度7000lx，白天12h黑暗12h。20%氫氧化鈉浸泡白穎苔草種子40min[24]，自來水清洗種子至pH 呈中性后種于17.5cm×12.5cm×13.5cm（口徑×底徑×高）的塑料花盆中，每盆30株，每處理5盆。培養基質為泥炭土、蛭石、生土等比例混合。生長60d后，將兩品種白穎苔草植株統一修剪至10cm，24h后開始脅迫。設置0，100，200和300mmol·L-13個NaCl濃度，為避免高鹽濃度的突然沖擊對植物造成損傷，NaCl濃度每天增加50mmol·L-1，達到目標濃度后，于第1，4，7，10，13，16和19d澆灌相應NaCl溶液（對照用蒸餾水代替），每次標準為底部滲出溶液積滿杯底托盤，脅迫21d后進行各項指標的測定。

1.2 生理指標測定方法

1.2.1 光合指標 使用便攜式光合測定儀（LI-6400，Li-COR，Lincoln，NE，USA）對脅迫21d的葉片進行光合指標測定，測定指標為凈光合速率（Netphotosyntheticrate，Pn）、氣孔導度（Stomatalconductance，Gs）、胞間二氧化碳濃度（Intercellularcarbon dioxide concentration，Ci）和蒸騰速率（Transpirationrate，Tr）。選取從上至下數第3枚完整的葉片為光合測定葉片，每處理重復3次。

1.2.2 葉綠素含量 稱取葉片0.2g，放入含10mL95%乙醇的玻璃管中，避光提取，期間震蕩幾次使提取效果充分，待葉片變白后，吸取適量的提取液，在649nm 和665nm 處測定吸光度。葉綠素（Chloro-phyllcontent，CC）含量=（13.95A665 -6.88A649）+（24.96A649-7.32A665）[25]。每處理重復3次。

1.2.3 相對電導率 在離心管內裝入35mL蒸餾水，測其電導率記為S0，稱取葉片0.2g，用吸水紙包裹浸沒于離心管中，室溫放置24h后測定管內的電導率記為S1，沸水浴30min，待管子冷卻后測定管內的電導率記為S2，葉片電導率（Relativeelectrolyticleakage，REL）=（S1 -S0）/（S2 -S0）[26]。每處理重復3次。

1.2.4 相對含水量 稱取植株葉片0.5g，記為Wf，葉片用吸水紙包裹，浸沒于含蒸餾水離心管中過夜，取出后擦干表面水分，稱重記為Wd，80℃烘箱中烘干至恒重，記為Wt。相對含水量（Relativewatercontent，RWC）=（Wf -Wd）/（Wt-Wd）。每處理重復3次。

1.2.5 離子含量測定 （1）取植物葉片，用去離子水沖洗干凈。105℃殺青15min，80℃烘箱內烘干至恒重。使用研缽將完全干燥的葉片研磨成粉末，過篩，干燥處保存待測。（2）稱取葉片粉末0.5g，裝入25mL容量瓶中，將容量瓶放置到加熱板上，在通風處內加入HNO3 和HClO4 混合液（V/V9∶4）10mL，溶解樣品直至樣品變成無色。（3）打開容量瓶口待NO2 揮發，直至容量降低3～5mL。（4）容量瓶放置室溫處，加入去離子水定容至25mL。濾紙過濾溶液，保存。（5）上樣，使用原子吸收分光光度計，測定離子含量。

1.2.6 生化指標及抗氧化酶活性測定 參照丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（No.BC0020）、超氧化物歧化酶（Superoxidedismutaseactivity，SOD）活性檢測試劑盒（No.BC0170）、過氧化物酶（Peroxidaseactivity，POD）活性檢測試劑盒（No.BC0090）和過氧化氫（H2O2）含量檢測試劑盒（No.BC3590）指導手冊進行相關指標測定。每處理重復3次。上述試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 數據處理與統計分析

綜合評價耐鹽性方法參照文獻[27-28]。

鹽害系數計算STC=M/C×100%，其中STC 為鹽害系數，M 為各處理下指標測定值，C 為對照測定值。

隸屬函數公式X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），i=1，2，…n。計算在不同NaCl處理下各指標隸屬函數值（式中，Xi 為白穎苔草各指標測定值，Xmin和Xmax為指標測定值中最小值和最大值）。

數據統計使用Excel。數據分析使用SPSS19.0（IBM，美國），顯著性計算基于單因素方差分析和鄧肯多重比較（Plt;0.05），并對各指標進行主成分分析、相關性分析和加權隸屬函數法，綜合評價不同品種白穎苔草的耐鹽性。

2 結果與分析

2.1 不同鹽濃度處理對白穎苔草生理生化指標的影響

兩白穎苔草品種葉綠素含量隨鹽處理濃度升高而下降（圖1）。‘綠坪1號’中，所有鹽濃度處理下其葉綠素含量均顯著低于對照（P lt;0.05），且在300mmol·L-1時達到最低，與對照相比降低37.40%。‘綠坪2號’在鹽濃度達到200和300mmol·L-1時葉綠素含量均顯著低于對照（P lt;0.05），在300mmol·L-1時與對照相比下降13.74%，降幅小于‘綠坪1號’。

兩白穎苔草品種相對電導率均隨鹽濃度升高而升高（圖2），且均在300mmol·L-1時達到最大值。‘綠坪1號’中，100，200和300mmol·L-1鹽濃度下其相對電導率均顯著高于對照（Plt;0.05），在300mmol·L-1時與對照相比增幅為45.55%，但在200和300mmol·L-1鹽濃度下二者電導率并無顯著差異。‘綠坪2號’在100，200和300mmol·L-1鹽濃度下其相對電導率變化與‘綠坪1號’一致，均顯著高于對照（Plt;0.05），在300mmol·L-1時與對照相比增幅為15.01%，增幅小于‘綠坪1號’。

兩白穎苔草品種相對含水量均隨鹽濃度升高而下降（圖3）。不同的是，‘綠坪1號’相對含水量在各個鹽處理下均顯著低于對照（Plt;0.05），在鹽濃度為300mmol·L-1 時最低，與對照相比降低57.74%。‘綠坪2號’在鹽濃度達200和300mmol·L-1時相對含水量顯著低于對照（Plt;0.05），在鹽濃度300mmol·L-1時最低，較對照相比降低43.89%，降幅小于‘綠坪1號’。

兩白穎苔草品種過氧化氫含量均有隨鹽濃度升高而升高的趨勢（圖4A），不同的是，‘綠坪1號’在鹽濃度為200和300mmol·L-1時H2O2 含量均顯著高于對照（Plt;0.05），且在300mmol·L-1時達到最大值。‘綠坪2號’在3個鹽濃度下H2O2 含量均與對照不存在顯著差異，且在鹽濃度為200mmol·L-1時達到最大值，與對照相比增幅為2.84%，最大增幅小于‘綠坪1號’。

兩白穎苔草品種丙二醛含量均隨鹽濃度升高而升高（圖4B），且均在300mmol·L-1時達到最大值。‘綠坪1 號’在鹽濃度為200 和300mmol·L-1時丙二醛含量與對照相比均顯著升高（Plt;0.05），最大增幅為39.73%。‘綠坪2號’丙二醛含量在各個鹽處理下均顯著高于對照（Plt;0.05），增幅最大為22.31%，增幅小于‘綠坪1號’。

總的來說，兩材料葉綠素、相對電導率、相對含水量和MDA 含量變化趨勢一致，值得注意的是，‘綠坪1號’白穎苔草葉綠素含量和相對含水量在鹽濃度達300mmol·L-1時較200mmol·L-1有較大幅度下降，下降幅度分別為19.67%和45.19%，且均存在顯著差異（Plt;0.05）。

2.2 不同鹽濃度處理對白穎苔草鉀鈉比（K+/Na+ ）的影響

兩白穎苔草品種鉀鈉比均隨鹽濃度的升高而下降（圖5），且在不同鹽濃度下均顯著低于對照（P lt;0.05），各組間均存在顯著差異（P lt;0.05），并都在鹽濃度300 mmol·L-1 時達到最低值。‘綠坪1號’最低值為0.25，‘綠坪2號’最低值為0.28。

2.3 不同鹽濃度處理對白穎苔草光合作用相關指標的影響

兩白穎苔草品種凈光合速率均隨鹽濃度升高而降低（圖6A），均在鹽濃度300mmol·L-1時與同組對照相比達到最小值，同時不同鹽濃度處理下Pn 與對照相比均顯著下降（Plt;0.05）。不同的是，‘綠坪1號’各處理間Pn 存在顯著差異（Plt;0.05），且Pn 與對照相比最大降幅為84.40%。‘綠坪2 號’Pn 在鹽濃度200mmol·L-1與300mmol·L-1時不存在顯著差異，與對照相比Pn最大降幅為72.20%，降幅小于前者。

兩白穎苔草品種氣孔導度均隨鹽濃度升高而降低（圖6B），且均在鹽濃度300mmol·L-1時達到最小值，同時二者除對照外各鹽濃度下氣孔導度均不存在顯著差異。‘綠坪1號’氣孔導度與對照相比最大降幅為85.28%，‘綠坪2號’氣孔導度與對照相比最大降幅為91.35%，降幅高于前者。

隨鹽濃度增加，兩白穎苔草品種胞間二氧化碳濃度均有逐漸上升的趨勢（圖6），但不同處理間Ci均無顯著差異。

兩白穎苔草品種蒸騰速率的變化與氣孔導度的變化趨勢基本一致（圖6D）。‘綠坪1號’Tr 與對照相比最大降幅為88.13%，‘綠坪2號’Tr 與對照相比最大降幅為90.90%，與Gs 一樣，降幅高于‘綠坪1號’。

2.4 不同鹽濃度處理對白穎苔草抗氧化物酶活性的影響

兩白穎苔草品種超氧化物歧化酶活性均在鹽濃度達200mmol·L-1時達到最大（圖7A）。‘綠坪1號’在鹽濃度達到100mmol·L-1和200mmol·L-1 時SOD活性與對照相比有顯著上升（Plt;0.05），鹽濃度為300mmol·L-1時與對照相比不存在顯著差異，最大增幅為6.99%。‘綠坪2號’在各個鹽濃度下與對照相比均存在顯著差異（Plt;0.05），但SOD活性在鹽濃度為200mmol·L-1和300mmol·L-1時無顯著差異。

兩白穎苔草品種過氧化物酶活性隨鹽濃度增加變化趨勢不一致（圖7B）。‘綠坪1號’POD活性呈現先升高后下降的變化趨勢，在鹽濃度100mmol·L-1和200mmol·L-1 時與對照相比有顯著上升（P lt;0.05），在鹽濃度300mmol·L-1時與對照相比不存在顯著差異。‘綠坪2號’POD活性呈現下降-上升-下降的變化趨勢，在鹽濃度200mmol·L-1時POD活性與對照相比增加9.21%，但不存在顯著差異;鹽濃度100mmol·L-1和300mmol·L-1時POD活性與對照相比均顯著下降（Plt;0.05）。

2.5 兩白穎苔草品種各項指標的相關性分析

對兩白穎苔草品種不同濃度鹽處理后各項指標進行相關性分析（表1），指標間相關系數在—0.933～0.988之間，其中凈光合速率與相對含水量、凈光合速率與蒸騰速率、鉀鈉比與蒸騰速率、氣孔導度與蒸騰速率、相對電導率與丙二醛含量之間存在顯著相關性（Plt;0.05），凈光合速率與鉀鈉比、葉綠素含量與相對含水量之間存在極顯著相關性（P lt;0.01）。說明兩白穎苔草品種在不同鹽處理下部分指標之間具有相關性。

2.6 各指標的主成分分析和隸屬函數分析

接下來對各指標進行主成分分析（表2）發現，第1主成分的貢獻率為55.229%，第2，3主成分的貢獻率為25.878%和13.962%，累積貢獻率達到95.069%，基本代表了試驗材料所測指標的大部分信息。因此，選取前3個主成分作為白穎苔草耐鹽性評價的綜合指標（表2）。

根據隸屬函數公式計算兩白穎苔草品種各綜合指標的隸屬函數值（表3），根據各綜合指標的貢獻率得到3個綜合指標的權重分別為0.581，0.272和0.147（表4），最后依舊計算得出的D值大小對白穎苔草材料進行耐鹽能力綜合排序，其中‘綠坪1號’和‘綠坪2號’的D值分別為0.419和0.581，表明‘綠坪2號’白穎苔草的綜合耐鹽性強于‘綠坪1號’。

3 討論

3.1 鹽脅迫對白穎苔草丙二醛和過氧化氫含量的影響

丙二醛是膜脂過氧化作用的產物之一，使得細胞膜透性增加，進而加強脂質過氧化作用，其含量直接反映細胞膜受損程度[29]。同時，鹽脅迫下，氧氣可與植物葉綠體和線粒體電子傳遞鏈中泄露的電子反應生成H2O2，盡管H2O2 本身對植物的毒害作用不大，但可通過后續反應轉化為OH-[30]，具有很大的毒性。研究表明，隨鹽濃度升高，‘綠坪1號’和‘綠坪2號’白穎苔草MDA 含量均呈上升趨勢，這與劉燕等[31]在草地早熟禾（PoaPratensis）和周興元等[32]在假儉草（Eremochloaophiuroides （Munro）Hack.）中研究結果一致，表明植物正遭受嚴重的氧化脅迫;然而，這與楊瑞瑞等[33]對鹽爪爪（K.foliatum）在梯度鹽脅迫下MDA 變化趨勢的研究結果不一致，這可能是因為低鹽環境促進鹽爪爪生長[34]，而白穎苔草雖能耐受一定程度的鹽堿但低鹽環境不會促進其生長。同時，‘綠坪2號’白穎苔草中MDA 和H2O2 含量雖也有上升，但總體上升幅度較小，尤其H2O2 含量各處理間均不存在顯著差異，這表明該品系體內具有較強的應對氧化脅迫的能力。

3.2 鹽脅迫對白穎苔草光合作用的影響

光合作用可以間接反映植物在鹽脅迫下受到的損傷程度。研究表明，兩種白穎苔草凈光合速率均隨鹽濃度升高而下降，這與張濤等[35]在結縷草（Zoysiajaponica）中研究結果一致，表明鹽堿環境較大程度的抑制了白穎苔草生長;兩種白穎苔草胞間二氧化碳濃度在各鹽濃度下均無顯著差異，這與劉一明[36]對假儉草（Eremochloaophiuroides）在12d鹽脅迫下的研究一致，與張燕等[37]在草地早熟禾中研究結果不一致，可能是物種間存在一定差異，也可能由于白穎苔草光合作用主要受非氣孔因素影響所致[39]。

3.3 鹽脅迫對白穎苔草抗氧化酶活性的影響

在高鹽脅迫下，植物體內發生氧化脅迫，酶系統對氧代謝的平衡遭到破壞，植物可通過提高自身抗氧化酶活性來應對[39]。本研究中，‘綠坪1號’白穎苔草SOD活性隨鹽濃度升高呈先上升后下降趨勢，這與陳雅琦等[40] 在醉馬草（Achnatherum inebrians）和高羊茅（Festucaarundinacea）中研究結果一致，表明隨鹽濃度升高，植物啟動自身抗氧化系統以抵抗過氧化作用;但當鹽濃度超過植物耐受限度，細胞受到相當程度損傷進而導致抗氧化酶活性下降。‘綠坪1號’POD 活性在高鹽濃度時的變化與朱天奇等[41]研究中耐鹽性較弱的高羊茅變化趨勢相同，進一步說明‘綠坪1號’耐鹽性較弱。兩白穎苔草POD活性在高鹽濃度下與對照相比均出現下降，結合MDA 和H2O2 變化情況分析，可能是由于‘綠坪2號’白穎苔草具有較高的耐鹽性，能通過自身調節一定程度緩解了高鹽脅迫。而‘綠坪1號’白穎苔草由于自身耐鹽性較差，體內MDA 和H2O2含量較高，過高的鹽濃度可能破壞了材料的抗氧化系統，從而導致體內抗氧化酶活性下降。

3.4 鹽脅迫下白穎苔草隸屬函數分析

鹽脅迫對植物造成的傷害主要包括滲透脅迫、離子毒性、氧化脅迫以及由此所引發的一系列次級脅迫[42]。因此，單一指標往往無法全面反映植物耐鹽性。本試驗通過對白穎苔草鹽脅迫下各項指標進行相關性分析和主成分分析，將12個單項指標轉換成彼此獨立的3個綜合指標，并根據綜合指標占的權重不同進行加權，得到D 值，根據D 值大小對材料耐鹽性進行評價，較為客觀的反映了兩白穎苔草耐鹽性強弱。本研究為白穎苔草在鹽堿地利用提供了依據，同時也為后續研究其耐鹽機理提供基礎。

4 結論

本試驗中兩白穎苔草品種在不同鹽濃度下耐鹽性強弱表現不同，隨鹽濃度增加兩白穎苔草除過氧化氫含量和POD活性兩指標外其余指標變化趨勢相同，結合SOD 和POD 活性變化分析，初步得出‘綠坪2號’更耐鹽的結論，最后通過對各指標的相關性分析、主成分分析和隸屬函數分析得出，長期鹽脅迫下‘綠坪2號’的耐受性大于‘綠坪1號’白穎苔草。本試驗將為鹽堿地改良和后續白穎苔草耐鹽機理研究提供參考。