陰道菌群失調與早孕流產風險的關系

［摘 要］" 目的" 探討陰道菌群失調與早孕流產風險的關系。 方法" 選取2021年5月至2022年3月在陜西中醫藥大學第二附屬醫院婦科就診的147名孕婦為研究對象，其中病例組為早孕流產（妊娠12周內確診）患者（n=64），對照組為健康足月分娩者（n=83）。采用基于16S rRNA基因測序，對病例組與對照組研究對象妊娠早期的陰道菌群組成進行比較及分析。 結果" 病例組與對照組在年齡、體質量指數、吸煙者人數、妊娠情況、既往流產、胎齡、陰道pH值的分布比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。 在總樣本隊列中鑒定出244種細菌。樣本分為5個主要類型，其中菌落狀態類型 （CST） Ⅰ 的特征是卷曲乳酸桿菌占優勢 ，CST Ⅱ的特征是加氏乳酸桿菌占優勢，CST Ⅲ的特征是內乳酸桿菌占優勢，CST Ⅴ的特征是詹氏乳酸桿菌占優勢，而CST Ⅳ的特征是乳酸桿菌屬的豐度較低。在CST Ⅳ型群落中觀察到了最高的α多樣性和豐度。與對照組相比，病例組的陰道菌群組成中乳酸桿菌屬消耗的比例顯著增加［25.0%（16/64） vs. 6.0%（5/83），χ 2=10.626，P＜0.01］。病例組中CST Ⅳ型為主陰道菌群組成的比例明顯增加［29.7%（19/64） vs. 12.0%（10/83），χ 2=7.100，P＜0.01］。病例組的逆辛普森指數（2.81±1.20 vs. 1.41±0.48）和豐度（28.06±15.08 vs. 17.13±6.83）均明顯高于對照組（t值分別為4.641、3.523，P＜0.05）。當從病例組中排除報告陰道出血評分＞1的孕婦時，這種相關性仍然存在。與稽留流產相比，不完全/完全流產的陰道菌群組成中乳酸桿菌屬消耗的比例顯著增加［19.2%（10/52） vs. 75.0%（9/12），χ 2=14.527，P＜0.01］。不完全/完全流產中CST Ⅳ型為主陰道菌群組成的比例顯著增加［23.1%（12/52） vs. 75.0%（9/12），χ 2=11.923，P＜0.01］。 結論" 高度多樣性的陰道菌群群落和乳酸桿菌減少是早孕流產的危險因素。

［關鍵詞］ 陰道菌群；早孕流產；稽留流產；出血Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.05.002

［中圖分類號］ R173"""" ［文獻標識碼］ A""""［文章編號］ 1673-5293（2024）05-0008-07

Relationship between vaginal flora dysbiosis and the risk of early pregnancy abortion

DUAN Ningjuan 1，LIU Yan 2，WANG Zhenwei 3，XU Lan 3，JIA Jian 1

（1.Department of Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Xianyang 720000，China;2.Department of Gynecology，The First Affiliated Hospital of Xi′an Medical University，Shaanxi Xi′an 710077，China;3.Department of Gynecology，The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Xianyang 720000，China）

［Abstract］"" Objective" To explore the relationship between vaginal flora dysbiosis and the risk of early pregnancy abortion." Methods" From May，2021 to March，2022，a total of 147 pregnant women in Department of Gynecology，The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine participated in this study.Among them，the case group consisted of patients with early pregnancy obortion （diagnosed within 12 gestation weeks） （n=64），and the control group consisted of healthy fullterm delivery women （n=83）.The composition of vaginal microbiota in early pregnancy was compared and analyzed between the case group and the control group using 16S rRNA gene sequencing." Results" There were no statistically significant differences in age，body mass index，number of smokers，pregnancy status，previous abortions，gestational age，and vaginal pH between the case group and the control group （P＞0.05）.A total of 244 bacterial species were identified in the sample cohort.The samples were divided into 5 major types，among which the characteristic of community state type （CST） Ⅰ was dominance of Lactobacillus crispatus，CST Ⅱ was dominance of Lactobacillus gasseri， CST Ⅲ was dominance of Lactobacillus iners，CST Ⅴ was dominance of Lactobacillus jensenii，and CST Ⅳ had a lower abundance of Lactobacillus species.The highest αdiversity and abundance were observed in CST Ⅳ communities.Compared to the control group，the proportion of Lactobacillus consumption in the vaginal microbiota composition was significantly increased in the case group ［25.0% （16/64） vs. 6.0% （5/83），χ 2=10.626，P＜0.01］.The proportion of CST Ⅳ type as the dominant vaginal microbiota was significantly increased in the case group ［29.7% （19/64） vs. 12.0% （10/83），χ 2=7.100，P＜0.01］.The Simpson’s diversity index （2.81±1.20 vs. 1.41±0.48） and abundance （28.06±15.08 vs. 17.13±6.83） were significantly higher in the case group compared to the control group （t=4.641 and 3.523，respectively，P＜0.05）.This correlation persisted when pregnant women with vaginal bleeding scores ＞1 were excluded from the case group.Compared to missed abortion，the proportion of Lactobacillus consumption in the vaginal microbiota composition of incomplete/complete abortion was significantly increased ［19.2% （10/52） vs. 75.0% （9/12），χ 2=14.527，P＜0.01］.The proportion of CST Ⅳ type as the dominant vaginal microbiota was significantly increased in incomplete/complete abortion ［23.1%（12/52） vs. 75.0%（9/12）， χ 2=11.923，P＜0.01］." Conclusions" The high diversity of vaginal bacterial community and the decrease of Lactobacillus are the risk factors for early pregnancy abortion.

［Key words］" vaginal flora;early pregnancy abortion;missed abortion;bleeding

流產是最常見的不良妊娠結局。早孕流產通常發生在妊娠12周之前，并可能對育齡婦女的生殖健康產生嚴重影響。已知的早孕流產原因包括遺傳因素、內分泌因素、生殖道解剖異常、感染，以及環境、精神、男性和藥物相關因素，但是仍有約15%早孕流產的原因不明 ［1］。陰道為結構化微生物群落的發展提供了一個重要的棲息地。有研究者越來越關注女性懷孕期間陰道微生態的變化與妊娠結局之間的關系，并且發現陰道菌群失調與流產相關 ［2］。陰道菌群是抵御外來致病菌的第一道防線，其有助于機體保持相互依賴、相互制約的動態平衡 ［3］。健康的陰道菌群微生態由乳酸桿菌主導，如卷曲乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、無乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌 ［4］。盡管這些由乳酸桿菌主導的微生物群落與腸道微生物群比較相對簡單，但近期的研究表明，陰道菌群失調可能與婦科癌癥、妊娠期糖尿病、不良妊娠結局及早產有關 ［56］。孕早期為關鍵時期，大多數流產均發生在該階段，目前對妊娠12周之前陰道菌群組成的報道很少。本研究通過分析早孕流產與健康足月分娩產婦在妊娠早期的陰道菌群組成，比較兩者之間陰道菌群的差異。

1研究對象與方法

1.1研究對象

本研究為一項有對照組的觀察性隊列研究。

選取2021年5月至2022年3月在陜西中醫藥大學第二附屬醫院婦科就診的147名孕婦為研究對象，將其分為病例組（n=64）與對照組（n=83）；其中病例組均為早孕流產患者，其全部在妊娠12周內（孕早期）確診，對照組為健康足月分娩者。病例組所有胎兒都接受了基因診斷，未發現染色體異常。

納入標準：①21～40歲有正常月經周期史的孕婦；②在納入研究前3個月內未使用抗生素和益生菌；③在納入研究前1個月內無陰道用藥或灌洗史；④在納入研究前3個月內未做過陰道手術；⑤孕期未使用激素；⑥無糖尿病、腸炎、肝炎、肺結核等慢性病史；⑦能夠理解本研究并簽署知情同意書。排除標準：①已知遺傳或免疫相關的自然流產，如父母任何一方染色體異常；②生殖道畸形或子宮占位性病變，如子宮平滑肌瘤、子宮腺肌病、子宮內膜息肉、子宮粘連等疾病；③嚴重內科疾病的并發癥，如心臟、肝臟或腎臟疾病；④內分泌功能明顯異常，如多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥、甲狀腺功能減退或甲狀 腺功能亢進；⑤凝血異常伴血栓形成；⑥發熱或急性感染；⑦精神障礙；⑧宮頸癌前病變或宮頸癌的并發癥。

本研究已經通過陜西中醫藥大學第二附屬醫院醫學倫理委員會審批（編號：2020122003）。

1.2妊娠結局的判定

使用醫院病歷系統收集并記錄病例組與對照組的妊娠結局，主要結局是流產和足月活產。早孕流產定義為在孕齡12 +0周之前通過超聲檢查確認的妊娠停止；其包括稽留流產、完全流產、不完全流產。當經陰道超聲檢查顯示存在平均囊徑＞25mm或更大的空妊娠囊時，如果胚胎的頂臀長測量值為7mm或更大，而沒有胚胎心跳，則確定為稽留流產 ［7］。當經陰道超聲檢查顯示宮內妊娠后宮腔內未見任何異常回聲，診斷為完全流產。當經陰道超聲檢查顯示宮腔內有不規則的異物組織，且有血流信號，診斷為不完全流產。根據流產類型，將病例組分為稽留流產（n=52）與不完全/完全流產（n=12）。隨訪持續妊娠的孕婦至分娩。

1.3陰道拭子樣本的采集

病例組患者在診斷為早孕流產后，立即對其陰道分泌物取樣，對照組孕婦在妊娠5～12周內完成取樣。所有研究對象在排尿后進入婦科檢查室，取膀胱截石位；為了獲得足夠量的陰道分泌物，將2個無菌陰道拭子在陰道后穹窿的同一部位旋轉3次取樣。采樣后，立即將標本放入充滿保存液的無菌試管中［生工生物工程（上海）股份有限公司］，在室溫下垂直放置10min，測試前于-80℃下冷凍保存。

1.4細菌DNA的提取和標記

使用微生物DNA提取試劑盒（中山康源基因技術科技有限公司），從陰道分泌物樣本中提取細菌DNA。引物F44（RGTTYGATYMTGGCTCAG）和R1543（GGNTACCTTKTTACGACTT）用于擴增16S rRNA的可變區1～9（V1～V9）。提取約5ng的DNA用于50μL聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。94℃下3min的初始變性步驟之后是退火30個循環，94℃下30s，55℃下30s，72℃下60s，以及72℃下3min的最終延伸步驟。通過進行瓊脂糖凝膠電泳以證實PCR擴增的成功。通過PCR擴增的DNA產物，不經純化直接用DNA標記試劑盒（中山康源基因技術科技有限公司）標記。然后，將5μL PCR合格的DNA加載到陣列載玻片上，并與雜交緩沖液混合雜交。

1.5物種特異性信息序列的處理

基于物種特異性信息序列，根據芯片外結果模擬了操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）序列和相應的相對豐度。然后將模擬的OTU信息用于OTU聚類，并通過注釋每個OTU來完成物種分類。去除不影響結果的OTU和非細菌物種。聚類后的代表性序列用核糖體數據庫項目（RDP分類器，V2.2，http：//rdp.cme.msuedu/）進行注釋，然后將其與Silva數據庫v132（http：//www.arbsilva.de/）進行比較，比較閾值為80%。使用微生物生態 學定量洞察（QIIME，v1.9.116）軟件對具有97%相似性的物種特異性信息序列進行聚類，產生OTU表，描述每個陰道拭子樣本中細菌的相對豐度。使用測序程序（中山康源基因技術科技有限公司）檢測陰道拭子樣本中微生物的種類和相對豐度。以α多樣性計算及QIIME軟件默認的原始參數用于分析陰道微生物群的一般特征。

1.6統計學方法

使用SPSS 22.0統計學軟件處理并分析數據。非正態分布計量資料用中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示，進行秩和檢驗；計數資料用例數（百分率）［n（%）］表示，進行χ 2檢驗；使用單向ANOVA或因子KruskalWallis檢驗分析各組間細菌豐度（觀察到的物種）和多樣性（逆辛普森指數）的差異；對病例組與對照組中相同參數的成對比較進行MannWhitney U非參數檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1病例組與對照組臨床資料和一般人口統計學特征的對比

病例組與對照組在年齡、體質量指數，以及吸煙者人數、妊娠情況、既往流產、胎齡、陰道pH值的分布比較差異均無統計學意義（P＞0.05），存在可比性，見表1。

2.2妊娠早期陰道菌群組成的特征

本資料中總共對216個陰道拭子樣本進行了測序，平均每個樣本提供2 916個讀數。去除單態和罕見OTU（每個樣本平均讀數＜10）后，在總樣本隊列中鑒定出244種細菌。使用來自前50個細菌物種（占所有序列讀數的95%以上）的相對豐度數據系統聚類，可以將樣本分為5個主要類型，其中菌落狀態類型（communitystate types，CST） Ⅰ的特征是卷曲乳酸桿菌占優勢，CST Ⅱ的特征是加氏乳酸桿菌占優勢，CST Ⅲ 的特征是內乳酸桿菌占優勢， CST Ⅴ的特征是詹氏乳酸桿菌占優勢，而CST Ⅳ的特征是乳酸桿菌屬的相對豐度較低；與這一發現相一致的是，在CST Ⅳ型群落中觀察到了最高的α多樣性和豐度，見圖1A、圖1B。

2.3病例組與對照組陰道乳酸桿菌屬的對比

與對照組相比，病例組的陰道菌群組成中乳酸桿菌屬消耗的比例顯著增加［25.0%（16/64） vs. 6.0%（5/83），χ 2=10.626，P＜0.01］，見圖2A。病例組中CST Ⅳ型為主陰道菌群組成的比例明顯增加［29.7%（19/64） vs. 12.0%（10/83），χ 2=7.100，P＜0.01］，見圖2B。與此相一致的是，病例組的逆辛普森指數（2.81±1.20 vs. 1.41±0.48）和豐度（28.06±15.08 vs. 17.13±6.83）均明顯高于對照組（t值分別為4.641、3.523，P＜0.05），見圖2C、圖2D。此外，當從病例組中排除報告陰道出血評分＞1的孕婦時，這種相關性仍然存在，見圖2E、圖2F。

注：A為堆積條形圖顯示早孕流產與較高比例的乳酸桿菌屬消耗有關；B為堆積條形圖顯示早孕流產與CST Ⅳ型陰道菌群組成增加有關；C、D為病例組與對照組陰道菌群的α多樣性和豐度的比較；E為堆積條形圖顯示早孕流產（不考慮陰道出血）與較高比例的乳酸桿 菌屬消耗有關；F為堆積條形圖顯示早孕流產（不考慮陰道出血）與CST Ⅳ型陰道菌群組成增加有關；與對照組相比， *P＜0.05、 * *P＜0.01。

2.4早孕流產類型的陰道乳酸桿菌屬的對比

與稽留流產相比，不完全/完全流產的陰道菌群組成中乳酸桿菌屬消耗的比例顯著增加［19.2%（10/52） vs. 75.0%（9/12），χ 2=14.527，P＜0.001］，見圖3A。不完全/完全流產中CST Ⅳ型為主陰道菌群組成的比例顯著增加［23.1%（12/52） vs. 75.0%（9/12），χ 2=11.923，P＜0.001］，見圖3B。

注：A為堆積條形圖顯示不完全/完全流產與較高比例的乳酸桿菌屬消耗有關；B為堆積條形圖顯示不完全/完全流產與CST Ⅳ型陰道菌群組成增加有關；與稽留流產相比， * * *P＜0.001。

3討論

3.1早孕流產與陰道乳酸桿菌減少有關

超過半數的流產被認為是由發育中胚胎的結構或染色體異常引起的。雖然其余的致病因素尚未完全闡明，但之前有報道顯示，使用基于培養和顯微鏡方法診斷的細菌性陰道病與流產風險增加之間存在關聯 ［8］。與這些發現一致，本研究顯示，早孕流產與陰道乳酸桿菌減少有關。其他研究使用了不依賴培養的分析方法，也確定了早孕流產與陰道乳酸桿菌屬之間的關系。乳酸桿菌屬消耗與不利的生殖健康結果相關，包括不孕癥、早產和性傳播疾病 ［9］。乳酸桿菌屬的保護作用在下生殖道中得到了很好的描述，并且可以部分歸因于乳酸驅動的陰道酸化，這抑制了其他病原物種的生長和定居 ［10］。此外，乳酸可以抑制陰道中炎癥介質的產生 ［11］。因此，陰道乳酸桿菌屬在早孕流產中具有保護作用。隨著乳酸桿菌屬消耗的增加，導致陰道菌群豐富性和多樣性增加，以及潛在病原體的定居，其包括普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬、消化桿菌屬、脲原體和嗜血桿菌屬；這些細菌可上調金屬蛋白酶和促炎細胞因子的表達，同時降低金屬蛋白酶組織抑制劑的抑制作用 ［12］。

3.2女性生育力低下與陰道菌群有關

上生殖道炎癥和組織重塑的精確調節是早期妊娠事件的一個關鍵方面，包括著床和胎盤滋養層浸入 ［13］。陰道菌群可能以多種方式影響這些途徑。在上行性陰道感染伴隨著致病菌在子宮內膜上的定植后，母體先天免疫系統對病原體的識別和應答可以驅動炎癥通路的過早激活，從而對子宮內膜容受性和著床產生負面影響。與此相一致的是，近期有研究表明，陰道B族鏈球菌感染誘導陰道上皮屏障功能喪失和細胞脫落，與流產、死產和早產的發生率增加有關 ［14］。此外，新的證據表明，子宮可能含有功能相關的微生物群 ［15］。子宮內膜微生物群的起源及何時建立尚待確定，陰道菌群紊亂可能參與其中機制。女性生育力低下與細菌性陰道病有關，細菌性陰道病通常以黏附性陰道菌群的存在為特征 ［16］。陰道菌群可能調節上生殖道炎癥途徑，而不直接在子宮內膜定居。有研究顯示，在小鼠中，給予陰道菌群脂多糖足以誘導宮頸重塑、巨噬細胞浸潤和隨后的早產 ［17］。總之，這些文獻支持陰道菌群在炎癥病因學中的作用，這可能是部分流產病例的基礎。這一觀點得到了本研究結果的支持。本研究顯示，在不完全/完全流產中觀察到CST Ⅳ型為主陰道菌群組成的比例顯著增加，而CST Ⅳ型陰道菌群組成已被證實可誘發局部炎癥。

3.3本研究的局限性

目前，本研究的設計很難確定病例組患者何時經歷乳酸桿菌屬的消耗，或者是早孕流產的驅動因素。陰道出血是流產的一種癥狀，同時其也可能導致陰道菌群不穩定，并通過堿化陰道環境和提供機會致病菌容易利用的能量底物來消耗乳酸桿菌群落 ［18］。在不完全/完全流產中，出血是常見癥狀，破壞陰道菌群組成。然而，本研究確定的乳酸桿菌消耗可能與出血事件無關，因為在排除有出血報告的樣本后仍然顯示乳酸桿菌屬消耗顯著增加。因此，本研究中的小樣本可能沒有足夠的證據來驗證早孕流產與陰道菌群組成的關系。

綜上，本研究對妊娠早期陰道菌群組成及其與 流產的關系進行了深入的探討。通過應 用16S rRNA基因測序發現乳酸桿菌減少、高度多樣性的陰道菌群可能與早孕流產有關。與其他流產原因（如染色體異常）不同，陰道菌群紊亂是一種風險因素，可以通過使用靶向抗生素、益生元或益生菌進行治療。因此需要進一步的研究來確定高危陰道菌群何時及如何建立，以進一步闡明感染在流產中的作用及制定治療策略。

［參考文獻］

［1］ 李佳釙，侯悅，李凡，等.復發性流產患者妊娠早期邊緣性亞臨床甲狀腺功能減退癥的研究［J］.中華內分泌代謝雜志，2021，37（6）：516522.

［2］Sun D，Zhao X，Pan Q，et al.The association between vaginal microbiota disorders and early missed abortion：a prospective study［J］.Acta Obstet Gynecol Scand，2022，101（9）：960971.

［3］Chen S，Xue X，Zhang Y，et al.Vaginal atopobium is associated with spontaneous abortion in the first trimester：a prospective cohort study in China［J］.Microbiol Spectr，2022，10（2）：e0203921.

［4］Peelen M J，Luef B M，Lamont R F，et al.The influence of the vaginal microbiota on preterm birth：a systematic review and recommendations for a minimum dataset for future research［J］.Placenta，2019，79：3039.

［5］Liu X，Cao Y，Xie X，et al.Association between vaginal microbiota and risk of early pregnancy miscarriage［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2021，77：101669.

［6］Singer M，Borg M，Ouburg S，et al.The relation of the vaginal microbiota to early pregnancy development during in vitro fertilization treatment：a metaanalysis［J］.J Gynecol Obstet Hum Reprod，2019，48（4）：223229.

［7］Li R，Hu K L.Kisspeptin，a promising biomarker for miscarriage in early pregnancy［J］.Fertil Steril，2021，116（3）：672673.

［8］Ravel J，Moreno I，Simón C.Bacterial vaginosis and its association with infertility，endometritis，and pelvic inflammatory disease［J］.Am J Obstet Gynecol，2021，224（3）：251257.

［9］Abbasi A，AghebatiMaleki L，HomayouniRad A.The promising biological role of postbiotics derived from probiotic Lactobacillus species in reproductive health［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，2022，62（32）：88298841.

［10］ Park S，You Y A，Kim Y H，et al.Ureaplasma and Prevotella colonization with Lactobacillus abundance during pregnancy facilitates term birth［J］.Sci Rep，2022，12（1）：10148.

［11］France M，Alizadeh M，Brown S，et al.Towards a deeper understanding of the vaginal microbiota［J］.Nat Microbiol，2022，7（3）：367378.

［12］Curty G，de Carvalho P S，Soares M A.The role of the cervicovaginal microbiome on the genesis and as a biomarker of premalignant cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer［J］.Int J Mol Sci，2019，21（1）：222.

［13］劉競，張蘭，曾利，等.稽留流產絨毛組織中IGF1，Ecadherin，微血管密度表達與藥物治療結果的相關性研究［J］.中國婦幼健康研究，2023，34（2）：7479.

［14］Manzer H S，Nguyen D T，Park J Y，et al.The group b streptococcal adhesin bspc interacts with host cytokeratin 19 to promote colonization of the female reproductive tract［J］.mbio，2022，13（5）：e0178122.

［15］Liu F T，Yang S，Yang Z，et al.An altered microbiota in the lower and upper female reproductive tract of women with recurrent spontaneous abortion［J］.Microbiol Spectr，2022，10（3）：e0046222.

［16］Gustin A T，Thurman A R，Chandra N，et al.Recurrent bacterial vaginosis following metronidazole treatment is associated with microbiota richness at diagnosis［J］.Am J Obstet Gynecol，2022，226（2）：225.e1225.e15.

［17］Girardi G，Lingo J J，Fleming S D，et al.Essential role of complement in pregnancy：from implantation to parturition and beyond［J］.Front Immunol，2020，11：1681.

［18］朱大敏，鄒慧娟，汪晶，等.IVF/ICSIET后陰道出血患者妊娠結局的影響因素分析及其列線圖預測模型構建［J］.安徽醫科大學學報，2022，57（7）：11711176.

［專業責任編輯：李 力］

［中文編輯：王 懿；英文編輯：牛 惠］

［基金項目］ 陜西省衛生健康委員會資助項目（20212641）

［作者簡介］ 段寧娟（1988—），女，主治醫師，碩士，主要從事妊娠期合并癥、陰道微生態、自身免疫及流產的研究。

［通訊作者］ 賈 健，副主任醫師。