aCGH應用于產前診斷意外發現DMD基因缺失或重復病例分析

［摘 要］" 目的" 探討微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術應用在產前診斷中發現抗肌萎縮蛋白基因（又稱DMD基因）缺失或重復的重要價值。 方法" 收集2019年9月至2020年7月在西北婦女兒童醫院因高危因素（高齡、血清學篩查高風險、無創篩查高風險或超聲軟指標異常等）選擇aCGH技術進行產前診斷的851例孕婦的羊水樣本進行檢測，并進一步采用多重連接探針擴增（MLPA）方法對DMD基因變異樣本進行驗證。 結果" 在851例孕婦的羊水樣本中，經aCGH產前診斷時意外發現4例羊水樣本存在DMD基因缺失或重復，同時MLPA檢測驗證了上述變異。胎兒1：男胎，arr［GRCh37］Xp21.1（31691172 31766673）×0，DMD基因E5253缺失；胎兒2：男胎，arr［GRCh37］Xp21.2（3101698331351900）×2，DMD 基因E6179重復；胎兒3： 女胎， arr［GRCh37］Xp21.2（3118269931474949）×3，DMD基因E5874重復；胎兒4：男胎，arr［GRCh37］Xp21.1（3177792532152126）×2， DMD基因E4551重復。4例變異均遺傳自母親。 結論" 產前診斷是防止DMD患者出生的重要手段，aCGH技術用于產前診斷不僅可以檢測染色體微缺失和微重復綜合征，還有助于檢測由基因缺失或重復引起的單基因疾病，從而為臨床診斷及遺傳咨詢提供了理論依據。

［關鍵詞］ 微陣列比較基因組雜交；抗肌萎縮蛋白基因；產前診斷；多重連接探針擴增 Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.05.008

［中圖分類號］ R17"""" ［文獻標識碼］ A"""［文章編號］ 1673-5293（2024）05-0047-08

Case analysis of accidental discovery of DMD gene deletion or duplication using aCGH in prenatal diagnosis

WU Qiuhua，SHI Fengrui，LIU Yuan，WANG Lin，ZHAI Wen，QIANG Rong

（Center of Medical Genetics，Northwest Women’s and Children’s Hospital，Shaanxi Xi′an 710061，China）

［Abstract］"" Objective" To explore the important value of array comparative genomic hybridization （aCGH） technology in prenatal diagnosis for the detection of deletions or duplications in the dystrophin gene （also known as the DMD gene）." Methods" Amniotic fluid samples from 851 pregnant women who underwent prenatal diagnosis using aCGH technology due to highrisk factors （such as advanced maternal age，highrisk serum screening，highrisk noninvasive screening，or abnormal ultrasound soft markers） at Northwest Women’s and Children’s Hospital from September 2019 to July 2020 were collected for testing.Furthermore，the multiplex ligationdependent probe amplification （MLPA） method was used to validate DMD gene variations." Results" Among the 851 amniotic fluid samples from pregnant women，aCGH prenatal diagnosis unexpectedly revealed 4 cases of DMD gene deletions or duplications.Subsequent MLPA testing confirmed the above variations.Fetus 1：male，arr ［GRCh37］Xp21.1 （3169117231766673）×0，DMD gene E5253 deletion;Fetus 2：male，arr ［GRCh37］Xp21.2 （3101698331351900）×2，DMD gene E6179 duplication;Fetus 3：female，arr ［GRCh37］Xp21.2 （3118269931474949）×3，DMD gene E5874 duplication;Fetus 4：male，arr" ［GRCh37］Xp21.1 （3177792532152126）×2，DMD gene E4551 duplication.All 4 variations were inherited from the mothers." Conclusion" Prenatal diagnosis is an important means to prevent the birth of DMD patients.The application of aCGH technology in prenatal diagnosis not only detects chromosomal microdeletions and microduplications syndromes but also helps to detect singlegene diseases caused by gene deletions or duplications，providing a theoretical basis for clinical diagnosis and genetic counseling.

［Key words］" array comparative genomic hybridization;dystrophin gene;prenatal diagnosis;multiplex ligationdependent probe amplification

Duchenne型肌營養不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是臨床中最常見的進行性肌營養不良癥，由位于染色體Xp21.1的抗肌萎縮蛋白（dystrophin）基因（又稱DMD基因）突變引起 ［1］。大多數患者為男性，女性一般為致病基因攜帶者。DMD在活產男嬰中的發病率接近2.86/萬（1/3 500） ［2］。DMD臨床典型特征為對稱性的近端肌肉無力伴腓腸肌假性肥大，患者一般在3～5歲時出現癥狀，進行性加重，直至失去行走能力，在30歲左右死于心肺衰竭。約40%的DMD病例為新發突變 ［3］，無DMD家族史，一般在出生后才能被發現。微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）等新技術廣泛應用于產前診斷后，越來越多的染色體微缺失和微重復被檢測到，甚至可能有一些意想不到的發現。本研究收集了2019年9月到2020年7月在西北婦女兒童醫院因高危因素（高齡、血清學篩查高風險、無創篩查高風險或超聲軟指標異常等）選擇aCGH技術進行產前診斷的851例孕婦的羊水樣本進行檢測，意外發現4例胎兒存在DMD基因外顯子重復或缺失，報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

孕婦1，34歲，孕1產0，孕21周 +3天，B超提示胎兒（胎兒1）臍膨出。本次系因多囊卵巢促排妊娠，否認孕期不規則出血史，否認其他有毒有害物質接觸史，無寵物接觸史。平素月經規律，乙肝小三陽攜帶，丈夫體健。其妹生育1兒1女，均體健。孕婦及其丈夫無遺傳病家族史。

孕婦2，33歲，孕2產1，孕26周 +5天，B超提示胎兒（胎兒2）右位主動脈弓伴左側鎖骨下動脈迷走、胎兒左心室強光點，產前血清學篩查未見異常。本次妊娠有感冒史，咳嗽病史，口服桔貝合劑。孕前診斷為抑郁癥，服用抗抑郁藥（安定、百解憂等）1個月，停藥20天后停經。既往月經規律，生育1女，半年前女兒患特異性皮炎。孕婦既往鼻炎病史，無遺傳病家族史。

孕婦3，33歲，孕3產1，孕27周 +3天，孕22周時系統B超提示胎兒（胎兒3）頸后皮膚皺褶（nuchal fold，NF）增厚（6.8mm），胎兒心臟B超未見明顯異常，產前血清學篩查示唐氏臨界風險（1∶413），孕婦外周血胎兒游離DNA無創產前檢測（noninvasive prenatal test，NIPT）低風險。10年前（2010年）順產1男嬰，目前體?。墼袐D自述，后經多重連接探針擴增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）檢測確定該男童為DMD外顯子部分重復］。否認孕期有毒有害物質接觸史，既往體健，無遺傳病家族史。

孕婦4，32歲，孕1產0，孕28周 +5天，B超提示胎兒（胎兒4）骶尾椎先天發育異常，左側側腦室后角增寬至10mm，胎兒心臟B超未見明顯異常。本次因不孕行試管助孕，一代試管失敗，二代試管補救后妊娠，種植1枚胚囊，產前血清學篩查低風險，NIPT低風險，既往體健，無遺傳病家族史。

本研究已通過西北婦女兒童醫院醫學倫理委員會審批（2023013）。所有孕婦及家屬均簽署書面知情同意書。

1.2方法

1.2.1 DNA的提取

所有孕婦均行羊膜腔穿刺術，抽取羊水10mL，離心收集羊水中的細胞。使用PureGene組織提取試劑盒（Qiagen，德國）提取羊水基因組DNA，進行aCGH和MLPA檢測。抽取孕婦外周血3～4mL，使用血液基因組DNA試劑盒（天根，北京）提取外周血DNA，進行MLPA檢測。為了確保結果的準確性，使用熒光標記短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）復合擴增檢測試劑盒（閱微，江蘇）對羊水和孕婦外周血的DNA進行擴增，以分析待檢樣本中是否存在母體細胞污染。

1.2.2 aCGH的檢測

檢測方法參照有關參考文獻 ［4］。按照aCGH技術流程進行標記、純化、雜交、洗滌。試劑盒均為Technologies Agilent公司生產，雜交芯片為美國Agilent Technologies公司生產的PerkinElmer CGX TM（8×60K）芯片。使用SureScan微陣列掃描儀（Agilent Technologies，美國）掃描芯片，并使用Cytogenomics軟件（Agilent Technologies，美國）分 析結果。最后，使用Genoglyphix （https：//uk.genoglyphix. com/）在線判讀數據并進行分析。參考DGV、DECIPHER、ISCA、OMIM、ClinVar、PubMed等公共和實驗室數據庫，針對≥100kb的拷貝數變異（copy number variation，CNVs）片段進行致病性分析。根據最新版美國醫學遺傳學與基因組學學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的序列變異解讀指南 ［5］進行致病性分析解讀。

1.2.3 MLPA的檢測

DMD基因檢測試劑盒（MRCHolland，荷蘭）含有2個探針（SALSA MLPA P034/P035），可檢測DMD基因的79個外顯子是否存在缺失或重復。使用ABI 3500DX測序儀（Thermo Fisher Scientific， 美國）進行毛細管電泳，使用Coffalyser軟件（http//www.mlpa.com） 分析數據。以探針相對峰面積增加或減少30%分別提示DMD基因外顯子的重復或缺失。

2結果

2.1 aCGH及MLPA檢測結果

所有羊水樣本均無肉眼可見性母血污染，經STR檢測，均無母體細胞污染，可用于后續檢測。

羊水aCGH及MLPA檢測結果提示：

胎兒1：男胎，arr［GRCh37］Xp21.1（3169117231766673）×0（Xp21.1缺失75.5kb），MLPA提示DMD基因E5253缺失，見圖1。

胎兒2：男胎，arr［GRCh37］Xp21.2（3101698331351900）×2（Xp21.2重復334.92kb），MLPA提示DMD基因E6179重復，見圖2。

胎兒3：女胎，arr［GRCh37］Xp21.2（3118269931474949）×3（Xp21.2重復292.25kb），MLPA提示DMD基因E5874重復，見圖3。

胎兒4：男胎，arr［GRCh37］Xp21.1（3177792532152126）×2（Xp21.1重復374.20kb），MLPA提示DMD基因E4551重復，見圖4。

4例孕婦外周血MLPA提示：孕婦1的DMD基因E5253雜合缺失；孕婦2的DMD基因E6179重復；孕婦3的DMD基因E5874重復；孕婦4的DMD基因E4551重復。4例胎兒的DMD基因變異均遺傳自母親。

2.2妊娠結局

經詳細的遺傳咨詢和慎重考慮，孕婦1、孕婦2和孕婦4均選擇終止妊娠；孕婦3選擇繼續妊娠，其女胎出生時表現出雙腿向上彎曲，體毛濃密，新生兒疾病篩查未見異常，全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）（隨訪時家屬自述）未檢測出DMD基因變異。4例胎兒的檢測結果及妊娠結局見表1。

3討論

目前，對DMD尚無有效治愈方法，該病對患者、家庭和社會均造成沉重負擔。盡管學者們對DMD基因治療進行了許多研究，如通讀治療、外顯子跳躍治療、載體介導的基因替代治療和基因編輯治療，但目前基因治療仍然面臨著巨大的挑戰和困境 ［6］。因此在出生前及時發現并終止妊娠是避免DMD患兒出生及降低出生缺陷率的關鍵。女性DMD攜帶者一般無臨床表型，無DMD家族史的患者尤其是新發病例通常無法在出生前被發現，因此產前DMD基因篩查尤為重要，產前診斷是預防DMD患者出生的重要手段。

3.1 aCGH技術在臨床染色體疾病診斷中的應用

近年來，隨著產前診斷技術的不斷發展，aCGH作為新興技術在臨床染色體疾病診斷中逐漸得到了廣泛的應用 ［79］。aCGH技術基于芯片平臺，用不同熒光標記待測樣本與標準基因組DNA對照，最后雜交于微陣列芯片上，可檢測待測樣本基因組相對于標準基因組DNA拷貝數的變化。它與傳統的染色體G顯帶核型分析技術相比，具有分辨率高、覆蓋面廣、速度快和自動化程度高的優點，可大大提高產前診斷的準確性及疾病的檢出率 ［1011］。Costa等 ［12］研究表明，使用aCGH技術比單獨使用常規核型分析的診斷率提高了4.9%。aCGH技術在產前診斷領域應用的臨床指征主要有高齡、NIPT檢測DNA高風險、夫妻一方染色體異常、B超提示異常、不良孕育史等 ［13］。本研究中4例胎兒均存在超聲軟指標異常，胎兒1為臍膨出，胎兒2為心血管結構異常，胎兒3為NF增厚伴血清學篩查臨界風險，胎兒4為骶尾椎先天發育異常伴左側側腦室后角增寬。目前，以上異常與DMD基因的相關性均未見文獻報道。產前超聲軟指標是產前診斷中不可忽視的一部分，超聲軟指標異常的出現意味著胎兒存在潛在的其他結構異?；蛉旧w異常風險 ［14］，且合并超聲軟指標異常數量越多的胎兒染色體異常發生率越高 ［15］。因此，對于胎兒超聲軟指標異常陽性時，有必要行介入性產前診斷，及時明確診斷可為產前咨詢和后續臨床處理提供依據 ［16］。aCGH技術應用于產前診斷可顯著提高胎兒染色體異常的檢出率，有效降低胎兒出生缺陷的發生 ［17］。

3.2 DMD的遺傳咨詢

雖然aCGH并非是DMD的特異性診斷技術，但在產前診斷過程中意外檢出DMD基因或其他致病基因的微重復或微缺失的情況時有發生 ［1819］。本研究通過aCGH技術進行了羊水產前診斷，意外發現了4例羊水樣本的染色體Xp21.2或Xp21.1區域存在小片段的缺失或重復，該片段覆蓋了DMD基因的外顯子部分區域，同時MLPA檢測證實了這些突變。這為aCGH技術對產前診斷的重要性再次提供了強有力的證據。李濤等 ［20］對64個DMD基因新發突變家系女性再妊娠進行產前診斷，結果發現胎兒中有2例存在DMD基因外顯子缺失突變。本研究中4例孕婦均為DMD攜帶者，因此建議凡有DMD胎兒妊娠史的女性，即使本人DMD基因外顯子未見變異，仍建議其再孕時及時進行DMD基因產前診斷。在本研究中，孕婦3的女性胎兒為DMD外顯子重復攜帶者，但其出生后表現為雙腿向上彎曲，體毛濃密，新生兒疾病篩查和WES未檢測出明顯異常，推測其雙腿向上彎曲有可能是關節緊張，與宮內姿勢有關；毛發的密度和顏色往往受父母遺傳因素影響，先天性多毛癥或一些內分泌疾病如先天性腎上腺皮質增生、垂體病變及卵巢病變也會引起體毛過重 ［2123］；因此認為其雙腿和體毛的問題應該與DMD基因外顯子重復無關。

綜上所述，產前診斷是預防DMD患者出生的重要手段，aCGH技術用于產前診斷不僅可以檢測染色體微缺失和微重復綜合征，還有助于發現DMD或其他染色體片段缺失或重復所致的單基因疾病，在一定程度上降低了單基因疾病的漏診率，為全面評估胎兒和后續的遺傳咨詢提供理論依據。

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［專業責任編輯：陳 倩 于學文］

［中文編輯：王 懿；英文編輯：牛 惠］

［基金項目］ 國家自然科學基金項目（82201865）；陜西省重點研發計劃項目（2023YBSF305）

［作者簡介］ 吳秋華（1984—），女，主管技師，主要從事遺傳檢驗工作。

［通訊作者］ 強 榮，主任醫師。