雞滑液囊支原體PCR檢測方法的建立

陳文平 李冬立 康翠翠 張妹 程春格 陳小嬌 由鵬 王全武 蔡曉慶

摘 要：目前雞滑液囊支原體（MS）在養(yǎng)雞生產(chǎn)中時有發(fā)生，是一種頑固性、條件性疾病。在多種致病因素的作用易發(fā)，給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成了經(jīng)濟(jì)損失；為了快速診斷MS，特別是致病性雞滑液囊支原體，本研究針對MS的VlhA基因設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行靈敏性試驗、特異性試驗和重復(fù)性試驗，建立快速高效檢測MS的PCR方法。試驗結(jié)果表明：該檢測技術(shù)具有較好的靈敏性、特異性強且CV＜3%，具有很好的符合性。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體；PCR；檢測

中圖分類號：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2024）06-0027-05

雞的滑液囊支原體感染（Mycoplasama synoviae infection），又稱滑液囊支原體病，是一種急性或慢性傳染性疾病，可引起雞和火雞的傳染性滑液囊炎、慢性呼吸系統(tǒng)疾病及雞蛋尖端綜合征[1]。臨床上主要表現(xiàn)為滲出性滑膜炎、腱鞘滑膜炎或粘液囊炎等，對雞的生產(chǎn)性能造成了很大的影響。近幾年來，MS在各個地區(qū)都陸續(xù)出現(xiàn)，各個品種的雞均有發(fā)病，特別是商品蛋雞、商品肉雞及一些地方品種雞等，且各個日齡均可感染；大多數(shù)成年雞呈隱形感染。MS有垂直傳播和水平傳播2種傳播方式，而呼吸道傳播感染是該病的主要傳播方式。臨床上主要表現(xiàn)為呼吸啰音、雞冠蒼白、食欲減退、生長緩慢；嚴(yán)重的可出現(xiàn)胸骨囊腫、腳墊及腳關(guān)節(jié)腫脹、跛行等。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟有尿酸鹽沉積，脾臟、腎臟腫大等[2]。剖檢病雞，主要病理變化為附關(guān)節(jié)、跗關(guān)節(jié)和腳墊腫脹，腫脹部位囤積大量黃色膠凍樣粘液。胸部發(fā)生囊腫，隨著病程延長，胸骨關(guān)節(jié)被粘液或干酪樣物質(zhì)覆蓋，爪墊內(nèi)也存在膿性分泌物或干酪樣滲出[3]。病雞的睫鞘滑膜層出現(xiàn)廣泛、散在和局灶性的炎性浸潤[4]。部分雞肝脾腫大、出現(xiàn)明顯的紋路，腎臟腫大[5]。

總體來說，現(xiàn)有的全球家禽養(yǎng)殖場的支原體流行情況報告大部分都是血清學(xué)檢測[6]，但血清學(xué)檢測不能用于確定血清抗體的存在，可能缺乏特異性或靈敏性，因此，單純的依靠血清轉(zhuǎn)化的檢測程序可能不夠完善 。

本研究對MS疑似的病料進(jìn)行病原的分離和鑒定是非常可靠的檢測方法，但是該方法對菌的生長環(huán)境和條件極為苛刻，且耗時較長、難度較大；大型雞場和獸醫(yī)基層工作人員，大多數(shù)還是以平板凝集的試驗來初步診斷。通過分離培養(yǎng)菌株，對MS分離菌株的VlhA基因設(shè)計特異性引物，建立快速準(zhǔn)確的PCR檢測方法，為臨床檢測MS提供一種快速的檢測技術(shù)。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1? 菌株? 雞滑液囊支原體MS菌株（Y1株），火雞支原體MM菌株、雞毒支原體MG菌株均由峪口禽業(yè)疾控研發(fā)中心提供。

1.1.2? 主要試劑? 2×Rapid Taq Master Mix 購自美國Axgey公司。DL2 000marker、5×RT-緩沖液、pMD19-T載體、DNA核酸提取試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.1.3? ?主要的設(shè)備? 核酸提取儀器、振蕩器、PCR儀、研磨器、電泳儀。

1.2? 方法

1.2.1? 引物的設(shè)計? 基于Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的雞滑液囊支原體的VlhA基因序列（Genbank編號：HQ682228.2），本研究成功設(shè)計出一套針對雞滑液囊支原體的通用引物。具體的引物序列詳見表1。這些引物由上海生物生工工程有限公司負(fù)責(zé)合成。這一研究成果為進(jìn)一步探索雞滑液囊支原體的檢測和分析提供了有力工具。通過對該基因序列的分析，我們可以更好地理解雞滑液囊支原體的生物學(xué)特性，從而為雞病的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1.2.2? 核酸的提取? 參照日本TaKaRa公司的柱式提取的試劑盒操作說明進(jìn)行核酸的提取。

1.2.3? 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備? 本研究主要關(guān)注質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備過程。首先，將目的片段與pMD19-T載體連接，形成重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)。隨后，提取含有pMD18-T的VlhA目的菌株中的質(zhì)粒。為了確保質(zhì)粒構(gòu)建的正確性，對其進(jìn)行測序鑒定，確保無誤。最后，通過紫外分光光度計測定質(zhì)粒的OD值，并在-20 ℃的條件下進(jìn)行保存。這一過程為后續(xù)相關(guān)研究提供了可靠的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4? MS普通PCR檢測方法的建立? （1）PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：通過對PCR的反應(yīng)體系進(jìn)行配置，在優(yōu)化過程中對引物濃度、退火溫度等進(jìn)行具體優(yōu)化，確定反應(yīng)條件（表2）。

反應(yīng)程序包括初始變性，循環(huán)擴(kuò)增，最終延伸和保存等步驟。具體為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15s，72 ℃ 15 s，共42個循環(huán)；92 ℃ 5 min；4 ℃保存。為了檢測PCR產(chǎn)物的正確性，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。根據(jù)電泳結(jié)果，選取疑似陽性PCR產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。這一過程為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供了重要保障。

（2）靈敏性試驗：分別以MS株為樣本，再分別按照10倍稀釋成0.42×109、0.42×108、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8個滴度。采用日本TaKaRa公司的柱式提取的試劑盒提取DNA為模板，按照優(yōu)化好條件進(jìn)行PCR，凝膠電泳讀取試驗結(jié)果。

（3）特異性試驗：本研究以MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照樣本，同時設(shè)置了MG和MM作為對照樣本。采用TaKaRa公司的柱式提取試劑盒提取DNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增；最后，通過凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行讀取，分析結(jié)果。這一過程不僅驗證了我們的實驗方法，也為后續(xù)的研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

（4）臨床試驗：選取臨床有呼吸道癥狀的雞群（河北省某雞場商品代雞群），隨機采取80份組織樣品進(jìn)行檢測，按照優(yōu)化條件進(jìn)行PCR檢測，每次實驗均設(shè)立陽性對照、陰性對照。

2? 結(jié)果

2.1? 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用構(gòu)建好的MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用F和R引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，核酸電泳檢測結(jié)果和預(yù)期結(jié)果一致，得到大約183 bp的目的片段（圖1），并進(jìn)行基因序列測序，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行blast比對，結(jié)果表明質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品符合VlhA的基因序列，可用于后續(xù)試驗。

利用imple超微量分光光度計測量DNA的濃度，其濃度為92 ng/μL，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)0.17×1012 copies/μL。

2.2? 靈敏性試驗

通過優(yōu)化后的檢測條件，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，稀釋到0.42×1012 copies/μL后，再進(jìn)行倍比稀釋成0.42×10、0.42×107、0.42×106、0.42×105、0.42×104、0.42×103、0.42×102 copies/μL，共8個滴度，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到0.42×103μcopies/μL時仍然可以檢測陽性條帶（圖2），稀釋到0.42×102copies/μL以后仍出現(xiàn)條帶，但是顯示為弱陽性，表明該方法具有較高的靈敏性。

2.3? 特異性試驗

用MS質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為樣本，分別以MG、MM為對照樣本，以去離子水為陰性對照及空白對照組，為保證試驗的準(zhǔn)確性，做3組重復(fù)試驗。試驗結(jié)果表明：MS標(biāo)準(zhǔn)品為陽性，其他均為陰性（圖3），表明該方法具有良好的特異性。

2.4? 臨床樣品檢測

采集臨床出現(xiàn)精神萎靡、關(guān)節(jié)有積液等樣品，應(yīng)用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對疫苗、蛋清、蛋黃及雞胚（尿囊腔液）樣品中雞滑液囊支原體的感染情況進(jìn)行檢測，其結(jié)果見表3。

3? 討論

雞毒支原體和滑膜囊支原體長期以來對家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的不利影響。因此，在早期感染的雞身上檢測滑膜囊支原體，并盡快采取有效的控制措施，從而達(dá)到凈化雞滑膜囊支原體的目的。鑒于其垂直和水平傳播的特點，受感染的雞混合感染其他細(xì)菌和病毒，因此引起疾病暴發(fā)，出現(xiàn)腳墊腫脹、關(guān)節(jié)積液等癥狀，但臨床上很難通過癥狀診斷雞支原體疾病并及時采取相應(yīng)措施。因此，迫切需要建立一種特異、靈敏、可重復(fù)和快速的檢測方法。

病原分離技術(shù)一直都是行業(yè)檢測MS的金標(biāo)準(zhǔn)。MS的生長對環(huán)境要求苛刻，對營養(yǎng)條件有很高的要求，通常在其培養(yǎng)基中添加0.01%的NAD以及10%豬血清或者馬血清。其生長的最適pH為7.5左右，當(dāng)pH降至6.5甚至更低時開始大量死亡。因此，通過病原分離的方法對大量的臨床樣品進(jìn)行檢測比較困難。研究發(fā)現(xiàn)，MS的vlhA基因在不同的MS菌株之間具有99%～100%的高度同源性，針對MS vlhA基因相對保守的特定區(qū)域設(shè)計引物，在其特定序列（1～200 bp）內(nèi)設(shè)計上游引物，并對目標(biāo)基因的選擇和引物進(jìn)行特異性設(shè)計[7]。本研究結(jié)果表明，靶向MS vlhA基因的特異性引物可以特異性擴(kuò)增混合樣品中MS的靶片段，有效鑒定了混合樣品中的MS。與OIE標(biāo)準(zhǔn)的MS普通PCR方法相比，MS-PCR方法可以有效避免操作不當(dāng)導(dǎo)致的假陽性，有效避免了分子污染，使其更加方便、快速，并在一定程度上降低了檢測成本，對檢測方法的逐步簡化，分子生物學(xué)方法更適合基層疫情檢測和實驗室廣泛推廣。

本研究建立的方法在前人研究的基礎(chǔ)上，同樣對引物的靶基因、引物序列、引物濃度和退火溫度以及酶的用量和模板濃度進(jìn)行了優(yōu)化，選擇了在MS屬內(nèi)高度保守且與其他病原體基因組具有差異區(qū)間的特異性基因vlhA作為檢測目標(biāo)，為滑液囊支原體單重及多重PCR檢測方法的建立提供了另一有效的選擇。本研究建立的PCR檢測方法，以固定量的陽性質(zhì)粒為模板，使用不同的酶和引物、探針濃度進(jìn)行MS PCR反應(yīng)，檢測感染臨床樣品，對滑液囊支原體的陽性檢出率高達(dá)83%以上，為滑液囊支原體感染流行病學(xué)調(diào)查研究以及進(jìn)一步開展滑液囊支原體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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Establishing of the PCR Detection Method of a Smooth Liquid Pocket

CHEN Wenping1，LI Dongli，KANG Cuicui1， ZHANG Mei1，CHENG Chunge，

CHEN Xiaojiao1，YOU Peng，Wang Quanwu，cai xiaoqing 12*

（1.Beijing Huaduyukou Poultry Industry Co.，Ltd.，Beijing 101206，China;

2.Pinggu Comprehensive Test Station of National Laying Hens Industrial Technology System，Beijing 101206，China）

Abstract： At present， the proportion of chlamydiac （MS） in a smooth liquid sac pocket is a high proportion of chicken -raising production， which is a refractory and conditional disease. Under the effect of a variety of diseased factors， it has increased and easy to occur， causing huge economic losses to the production of chicken breeding; in order to quickly diagnose MS， especially the pathogenic bodies of the pathogenic fluid， Specific primers， by optimizing the reaction conditions， conducting sensitivity tests， specific tests， and repeated tests to establish a PCR method for fast and efficient testing MS. The test results show that the detection technology has good sensitivity， strong specificity， and CV <3%， which has good compliance.

Keywords： Smochye Pork Pystogen supports; PCR; detection