基于肺與大腸相表里理論探討肺腺癌患者腸道菌群多樣性*

王振宇 錢 祥 張愛琴

1 浙江省杭州市丁橋醫院 浙江 杭州 310021

2 浙江省腫瘤醫院 浙江 杭州 310022

本研究通過新一代的高通量測序，對腸道菌群進行基因測序，了解原發性肺腺癌患者與健康對照組腸道菌群結構的差異性。

1 材料與方法

1.1 標本采集：選取浙江省腫瘤醫院胸部腫瘤外科新入院患者，充分溝通后，簽署知情同意書。要求1周內未使用中藥制劑、抗生素、類固醇藥物、微生態制劑及酸奶等。收集的糞便于省腫瘤醫院-80℃保存。剔除各種原因不愿手術，術后病理為炎性病變，術后病理非腺癌糞便標本。取病理確診為肺腺癌的患者糞便10例，與患者平均年齡相近的正常人糞便10例，用做實驗對象。

1.2 糞便DNA提取與16S rRNA PCR擴增及Illumina測序：按TIANamp Stool DNA kit試劑盒說明進行。用紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。質檢后選取合適DNA樣本進行后續分析。

1.3 數據分析：通過生物數據分析進行OTU聚類及注釋、Alpha多樣性、Beta多樣性、群落組成分析、物種豐度差異分析等。

2 結果

2.1 一般資料：入組的10例原發性肺腺癌患者均為男性，年齡42～59歲，平均年齡48.8±6.12歲；健康人群對照組10例均為男性，年齡40～60歲，平均年齡48.7±6.25歲。兩組人群年齡、性別比較無統計學差異（P＞0.05）。

2.2 樣本腸道菌群OTU聚類、注釋及維恩圖：如圖1。每個橢圓代表一個樣品(分組)，橢圓間的重疊區域表示樣品間（組間）共有的OTUs，每個區域的數字大小表示該區域對應的OTUs數目?？梢钥闯鲈l性肺腺癌患者與健康人群腸道菌群OTUs總數基本一致，在種類上有一定的重合性，同時存在顯著差異。

圖1 OTU維恩圖

2.3 腸道菌群多樣性分析：Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性。常用的多樣性度量指數有：群落豐富度指數，包括Chao指數和ACE指數，兩指數越大，說明群落豐富度越高。群落多樣性指數，包括Shannon指數和Simpson指數。Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。組間t檢驗P均＞0.05，說明兩組樣本多樣性無顯著性差異。見表1。

表1 4個多樣性指數組間t檢驗數據表

Beta多樣性是不同生態系統之間多樣性的比較，利用各樣品序列間的進化及豐度信息來計算樣品間距離，反映樣品間是否具有顯著的微生物群落差異。運用UniFrac分析進行層級聚類得到叢集樹狀圖2。PCoA是一種研究數據相似性或差異性的可視化方法，通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異圖3。從兩圖中我們可以看出肺癌患者腸道菌群與健康人組存在顯著性差異。圖中PCoA Plot12，PCoA Plot13，PCoA Plot23分別是前三個主要成分兩兩組合，分別進行作圖。不同形狀的點代表不同環境或條件下的樣本組，橫、縱坐標軸的刻度是相對距離，無實際意義。

圖2 叢集樹狀圖

圖3 PCoA圖

2.4 兩組糞便樣本腸道菌群差異分析：基于各分類學水平樣品序列數的統計信息，可以比較某一特定物種在兩個或多個（組）樣品之間豐度的差異情況。根據序列數的統計信息，應用軟件mothur中的Metastats命令進行差異分析。q值越小說明P值越準確。結果如表2。Alistipes存在差異性（P＜0.05）。

表2 兩組糞便樣本腸道菌群差異分析

3 討論

本實驗通過研究肺腺癌患者以及正常人的腸道菌群豐度分布，通過組間對照尋找肺癌患者腸道中的關鍵菌，結果發現肺癌患者腸道內存在著大量的Alistipes，提示其可能與肺癌的發生發展有密切聯系。

大腸與肺在生理上密切相關，又在病理上相互影響，腸道菌群作為腸道的一個重要組成部分，與肺癌也必然存在密切關系。糞便移植和益生菌的補充已被證明能對多種肺部疾病起到積極的療效。近年腸道菌群也被證明可以提高宿主抗癌免疫反應[1]以及通過調節腫瘤微環境下的骨髓來源的細胞功能發揮抗腫瘤療效[2]。中醫學從表里經入手，通過歸經為大腸的藥物（如白花蛇舌草、苦杏仁等），對肺癌起到了積極的療效。

本次實驗結果是祖國醫學在“肺與大腸相表里”理論正確性上的一個表現。腸道菌群與肺癌被證明存在著非常密切的關系。能否通過改善Alistipes的豐度分布，從而影響肺癌發生發展，對肺癌起到積極的治療效果，成為肺癌防治的新靶點，從而為肺癌的防治提供了一個新的思路、新靶點和新的技術平臺，還有待實驗的論證。