高表達miRNA-9-5p的骨髓間充質干細胞對呼吸機引起的肺損傷大鼠的影響及機制研究

林新 余天興 許俊平 陳麗芳 謝萬 包宇旺

【摘要】 目的 研究具有高表達miRNA-9-5p的骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）對呼吸機引起的肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）大鼠的影響以及機制。方法 建立機械通氣的肺損傷模型，通過慢病毒轉染構建高miRNA-9-5p表達的BMSCs，評估BMSCs和高miRNA-9-5p表達的BMSCs對VILI大鼠的影響。通過蛋白質印跡和qRT-PCR方法檢測BMSCs和高表達miRNA-9-5p的BMSCs對VILI大鼠肺部的LC3、Atg5和Atg7表達的影響。結果 移植BMSCs可顯著降低VILI大鼠肺部損傷的嚴重程度以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）中的IL-1β和IL-2水平。移植高表達miRNA-9-5p的BMSCs能顯著降低VILI大鼠的肺部損傷嚴重程度和BAL液中的IL-1β和IL-2水平。與VILI大鼠相比，移植的BMSCs明顯增加了自噬相關蛋白的表達，包括Atg5和Atg7。與對照組相比，移植高表達miRNA-9-5p的BMSCs可顯著提高VILI大鼠的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例以及Atg5和Atg7水平。結論 BMSCs可能通過上調miRNA-9-5p表達提高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例、Atg5和Atg7介導的自噬水平，進而緩解VILI。

【關鍵詞】 BMSCs；VILI；miRNA-9-5p；自噬

文章編號：1672-1721（2024）16-0001-05? ? ?文獻標志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R563

危重病人的機械通氣不可避免誘發病理性和生理性的VILI，其特點是肺血管通透性增加、炎癥細胞浸潤和血液凝固[1]。確定有效的促進肺損傷修復的保護性通氣策略，將推動機械通氣治療發展。BMSCs是具有自我復制能力的多功能、多潛能的細胞，可在培養基中增殖并多樣化形成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。BMSCs在體外具有強大的增殖能力。有研究表明，移植BMSCs可治療一些疾病，包括肺部損傷[2]。有文獻報道，BMSCs可加速大鼠VILI的恢復[3]。BMSCs恢復VILI的機制還需進一步探索。因此，本研究探討BMSCs和具有高表達miRNA-9-5p的BMSCs對VILI大鼠的影響及可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）動物。SPF級雄性SD大鼠60只[常州卡文斯實驗動物有限公司，SCXK（豫）2005-0001]，年齡6～8周。隨機分為5組，即正常組、VILI組、VILI+BMSC組、VILI+BMSC+LV-NC（NC）組和VILI+BMSC+LV-miRNA -9-5p（OE）組，每組12只。（2）BMSCs的分離和培養。從大鼠后肢解剖股骨和脛骨，切開末端暴露骨髓腔。將骨髓分散在DMEM中，以1 500 r/min離心5 min。將骨髓顆粒重新懸浮在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，在37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養。24 h后更換培養基，培養貼壁的細胞，每2 d更換培養基。當細胞達到70%～80%匯合時，用質量分數0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。取4代的BMSCs用于慢病毒感染。

1.2 方法

（1）慢病毒感染法構建高表達miRNA-9-5p的

BMSCs。陰性對照慢病毒（LV-NC）、攜帶miRNA-9-5p的慢病毒（LV-miRNA-9-5p）用于感染BMSCs。72 h觀察綠色熒光。得到穩定感染的BMSCs（OE）和BMSCs（NC），用于隨后的大鼠體內移植實驗。（2）肺部損傷模型的建立。為建立機械通氣的肺部損傷模型，5%水合氯醛麻醉后，大鼠被固定成仰臥位。使用小型動物呼吸機（DW3000，淮北正華生物儀器設備有限公司）通氣4 h，潮氣量為40 mL/kg。為防止過度通氣，呼吸頻率調整為15次/min。實驗得到了福建醫科大學實驗動物中心動物倫理委員會的批準。（3）標本的采集和處理。模型建立的第7天，抽取動脈血測量氧氣和二氧化碳的分壓。每組取6只大鼠的肺部進行稱重，在80 ℃的烘箱中干燥72 h，然后再次稱重，計算肺部濕/干（W/D）比率。采用改良方法[4]從其余大鼠身上獲得BAL，于-80 ℃冰箱保存，后續用于測定促炎癥細胞因子的含量。右上肺組織在室溫下用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，然后石蠟包埋并切片進行組織學評價。右下肺組織冷凍在液氮中，保存于-80 ℃冰箱，進行蛋白質印跡分析（western blot，WB）。（4）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。使用ELISA試劑盒IL-1β和IL-2（ABclonal Technology）測定促炎癥細胞因子的水平。（5）蘇木精-伊紅染色。石蠟切片在室溫下用二甲苯脫蠟2次。乙醇處理后用自來水清洗2 min。用蘇木精染色5 min，自來水清洗，在1%酸性酒精中分化，在1%氨水中變藍，伊紅染色1 min，并再次用自來水清洗。然后用乙醇進行脫水，在二甲苯中清洗2次，持續10 min，用中性膠固定。顯微鏡觀察。（6）RNA提取和定量實時PCR（qRT-PCR）分析。用RNA提取試劑盒（TransGen Biotech）從肺部分離出總RNA。根據反轉錄試劑盒（TransGen Biotech）的說明，以總RNA為模板，反轉錄成cDNA，作為qRT-PCR的模板。引物見表1。（7）WB法測定LC3、Atg7和Atg5的表達。從肺部切片中提取總蛋白，用BCA試劑盒定量檢測蛋白水平。20～30 μg的蛋白質使用SDS-PAGE電泳分離，然后轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在室溫下用牛血清白蛋白溶液封閉1 h。然后將PVDF膜與一抗在4 ℃下靜置孵育過夜。洗膜后，與相應的HRP結合的二抗進行孵育。使用ECL化學發光試劑盒顯影。使用Image J軟件定量分析。

1.3 統計分析

使用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計量資料以x±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs對VILI大鼠的影響

圖1（a）中，與正常組相比，VILI組的肺部W/D比率明顯增加（P<0.05）；正常組和VILI+BMSC組的的肺部W/D比率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。圖1（b）中，VILI+BMSC組的氧分壓高于VILI組（P<0.05），但低于正常組（P<0.05）。圖1（c）中，VILI組BAL液中IL-1β和IL-2的水平明顯高于正常組（P<0.05），VILI+BMSC組IL-1β和IL-2的水平明顯低于VILI組（P<0.05），說明炎癥的發展受到了一定程度的抑制。大鼠肺組織的組織學評價結果見圖2。正常組沒有肺泡巨噬細胞浸潤，沒有明顯的病理變化。VILI組的肺組織有明顯的病理變化，肺泡間隔增厚，部分肺泡腔內有血性滲出。移植BMSCs后，肺組織的病理變化得到了改善。這些結果表明，BMSCs對VILI大鼠肺損傷有改善作用。

2.2 BMSCs對LC3、Atg5和Atg7介導的自噬的影響

WB法檢測LC3、Atg5和Atg7的蛋白表達，見圖3（a）。與正常/VILI組相比，VILI+BMSC組Atg5和Atg7蛋白的相對表達明顯增加（P<0.05），見圖3（b）。VILI組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的比例明顯低于正常組和VILI+BMSC組，見圖3（c）。上述結果表明，BMSCs的移植可能會增加VILI大鼠的自噬。本研究通過qRT-PCR檢測了大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的mRNA水平。與蛋白質水平類似，與正常組和VILI組相比，VILI+BMSC組大鼠肺部LC3、Atg5和Atg7的水平都有所增加，見圖3（d）。本研究還檢測了miRNA-9-5p的mRNA表達，見圖3（e）。與正常組和VILI組相比，VILI+BMSC組miRNA-9-5p的mRNA表達明顯增加（P<0.05）。由此可見，LC3、Atg5和Atg7在大鼠肺部的表達與BMSCs的移植有關，高miRNA-9-5p表達的BMSCs可能對VILI大鼠有積極作用。

2.3 miRNA-9-5p高表達的BMSCs對VILI大鼠的影響

為了探索miRNA-9-5p對VILI大鼠的影響，經qRT-PCR檢測成功建立高表達miRNA-9-5p的BMSCs，見圖4（a）。qRT-PCR檢測也顯示，用高表達miRNA-9-5p的BMSCs治療的大鼠肺組織中miRNA-9-5p的表達高于NC組，見圖4（b）。雖然NC組和OE組的肺部W/D比率比較，差異無統計學意義（P>0.05），但OE組的肺部W/D比率有下降趨勢，見圖4（c）。OE組的氧分壓高于NC組（P<0.05），見圖4（d）。OE組BAL液中IL-1β和IL-2的水平明顯低于NC組（P<0.05），見圖4（e）。OE組部分肺泡腔內的肺組織有明顯的病理變化，見圖5，表明高miRNA-9-5p表達的BMSCs可在一定程度上改善VILI大鼠肺泡腔內的肺泡間隔增厚。上述研究結果表明，高表達miRNA-9-5p的BMSCs可能有助于改善VILI大鼠的肺部損傷。

2.4 miRNA-9-5p高表達的BMSCs對由LC3、Atg5和Atg7介導的自噬的影響

OE組的LC3、Atg5和Atg7的mRNA、蛋白表達與NC組相比明顯升高（P<0.05），見圖6（a）、圖6（b）和圖6（d）。OE組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明顯高于NC組（P<0.05），見圖6（c）。由此可見，LC3、Atg5和Atg7在肺部的mRNA和蛋白質的表達與miRNA-9-5p的含量有關。BMSCs可能通過VILI大鼠的miRNA-9-5p的表達來調節LC3、Atg5和Atg7的表達，并介導自噬。

3 討論

VILI是指在治療過程中由機械通氣引起或加重的急性肺損傷，是呼吸支持患者不可避免的嚴重并發癥。據報道，BMSCs可以增強VILI大鼠肺損傷的恢復，然而其基本機制仍不清楚。本研究探討了miRNA-9-5p高表達的BMSCs對VILI大鼠的影響以及它們是否通過自噬發揮作用。結果發現，BMSCs可能通過上調miRNA-9-5p、增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率、Atg5和Atg7介導的自噬水平緩解VILI。這也是首次報道miRNA-9-5p高表達的BMSCs對VILI大鼠自噬的影響。

BMSCs已被廣泛用于創傷、炎癥損傷修復、抗感染和免疫調節等實驗，在肺損傷領域的基礎研究和臨床實踐中受到越來越多的關注[5]。有研究表明，BMSCs可以分化和修復受損的肺泡上皮細胞和毛細血管膜，降低其通透性，還可促進血管生成素-1的分泌，預防結構損傷、肺水腫[6]。本研究中，移植BMSCs后，大鼠肺部W/D比率降低，氧分壓明顯改善，IL-1β和IL-2水平降低，肺泡腔內出血滲出程度明顯減輕，提示移植BMSCs可明顯減輕VILI大鼠的肺部損傷。

自噬作為程序性細胞死亡，在體內發生氧化應激或內質網應激時可維持細胞的平衡。許多研究證實，自噬的激活可在一定程度上促進先天免疫反應和炎癥反應的發生。自噬反應由一系列的自噬相關蛋白介導。Atg5和Atg7是上游自噬信號的關鍵蛋白，可幫助細胞減輕壓力，抵抗細胞毒性，并促進細胞生存[7]。LC3Ⅱ是一種重要的自噬體膜標志蛋白，由細胞質LC3（LC3Ⅰ）轉化而來，LC3通過使用各種自噬相關蛋白來調節自噬反應[8]。本研究結果顯示，移植BMSCs后，VILI大鼠肺部Atg5和Atg7的水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例明顯增加，表明移植BMSCs減輕VILI大鼠肺部損傷與自噬有關。

有研究報道，miRNA-9可以通過激活自噬來促進BMSCs分化為神經元細胞[9]。在許多病理狀態下，miRNA-9-5p是血管生成的一個重要調節因素。本研究中，移植高表達miRNA-9-5p的BMSCs組明顯減輕了VILI大鼠的肺部損傷，表明BMSCs可能通過上調miRNA-9-5p的表達緩解機械通氣引起的肺部損傷。與NC組相比，移植高表達miRNA-9-5p的BMSCs還能顯著提高VILI大鼠的Atg5和Atg7水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例。這些結果表明，BMSCs可能通過上調miRNA-9-5p表達、增加LC3、Atg5和Atg7介導的自噬減輕VILI引起的肺損傷。然而本研究不夠深入，未來還需要在動物和臨床上進行更深層次的研究。

綜上所述，移植BMSCs可明顯減輕呼吸機誘發的大鼠肺損傷，BMSCs可通過上調miRNA-9-5p表達、增加LC3、Atg5和Atg7介導的自噬緩解VILI。

參考文獻

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